专利名称：利用藻类Chlorella vulgaris生产用于治疗感染的抗菌肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗菌肽的生产方法。具体来说，本发明利用藻类这种水生植物 成本低、无污染、数量大的优点，开发藻类真核生物表达系统0化"/&^/^^&，用于大量生产抗菌肽，并将具有极强非特异性的生物活性分子抗菌肽用于治疗 细菌或真菌感染，尤其是那些因为过度使用抗生素而产生耐药性的病原。
背景技术：
抗菌肽是一种在自然界分布极为广泛、微生物和多细胞生物都可以合成的 生物活性分子。这使得抗菌肽很自然地成为生物体抵抗病原的第一道防线，并 且与其非特异性免疫相关联。由抗菌肽在生物组织中的不同分布，它们确保生物体能全面或在局部地区抵抗环境中的病原。大多数抗菌肽为带正电荷的分子，有20-50个氨基酸，并且具有两性结构，如alpha-螺旋，发夹式折叠,beta-折叠，或 者alpha-螺旋/beta-折叠混合结构等，而这些结构则可能是抗菌肽具有抗菌活性 的关键。这些抗菌肽展现了有效的抗菌活性，特异性很小，因此能抑制很多各 种各样的细菌和真菌，包括口腔病原。抗菌肽主要被分为三种1、具有(x-螺旋 构象的多肽(昆虫抗菌肽、magainins等)；2、具有一对半胱氨酸残基的环状和 开放末端环状多肽(defensins、 protegrin等)；3、特定氨基酸含量高的多肽(富 含脯氨酸、富含组氨酸等)。过去几十年，随着抗生素的广泛应用，持续进化的抗药物微生物，以及有 可能出现的"末日审判"微生物，如MRSA、 VRE，被越来越多地关注。然而， 由于抗菌肽在生物活性(像亲水脂分子一样插入细菌细胞膜，在膜上产生的孔道能导致细菌细胞渗透性裂解)上具有非特异性，使得那些对抗生素具有抗性 的细菌对抗生素仍旧是敏感的。因此，作为天然的抗菌物质，抗菌肽可以作为 一种新的药物用于治疗。然而，由于无法生产大量具有生物活性的分子，限制 了将抗菌肽用于抗感染治疗。近年来，水生生物由于其易于大量聚集和作为新能源潜在资源的特性，吸 引了广泛的关注。同样，由于其生产成本低、无污染和数量大的特性，使水生 生物作为表达系统生产抗菌肽成为可能。在研究过程中，我们使用普通的藻类(C似ow/fo VW/garh)作为"抗菌肽原型大量表达系统"生产两种重组抗菌肽，并 且证实水生生物表达系统能用于生产足够的抗菌肽，用于科研活动和未来可能 商业性抗菌肽治疗人或动物的感染，尤其是口腔感染。藻类分布的范围极广，对环境条件要求不严，适应性较强，在只有极低 的营养浓度、极微弱的光照强度和相当低的温度下也能生活。不仅能生长在 江河、溪流、湖泊和海洋，而且也能生长在短暂积水或潮湿的地方。从热带 到两极，从积雪的高山到温热的泉水，从潮湿的地面到不很深的土壤内，几 乎到处都有藻类分布。以小球藻为例，小球藻是一种单细胞真核绿藻，作为 生物反应器可对复杂蛋白进行正确的翻译后加工，形成有活性的分子；同时又 具备微生物的特点，生长繁殖迅速，培养条件简单，生产成本相对低廉，易于 大规模培养；对其基因组结构与功能的研究也口益深人，因而小球藻是进行基 因工程研究的较理想材料。水生生物是一组具有巨大生物技术潜力的生物，因 为它们有低成本和数量大的优点。在每平方英里地域上，藻类的数量大概是其 它作物(如玉米)的30倍。由于可以进行光合作用产生能量用于代谢，大多数 藻类可以在非常简单的环境(水、碳源、光照)中生长。同样，藻类可以作为 新的生物反应器用于生产生物活性物质。农杆菌中介使基因稳定转化的藻类表达系统可以作为潜在的高效表达系统，因为其具有如下优点1、载体可以将外 源基因整合到藻类细胞中；2、可以获得稳定转化的转基因藻类；3、转基因薄 可以很快生长到很大的数量；4、真核生物藻类可以进行糖基化修饰。发明技术内容本发明的目的是提供一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于 治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立 自主知识产权的藻类水生植物特异性表达的技术平台，以藻类CWo^//" 为生物反应器，利用藻类特异性表达的启动子，在藻类中高效表达具有生物活 性的重组抗菌肽。克服了重组抗菌肽的表达量低、可溶性差、无生物活性和纯 化工艺难等技术问题，为实现重组抗菌肽的规模化生产提供了可能。上述的藻类是指藻类,c/2/^//av"/ga&和其他常见藻类，也可以是其他不常见藻类。本发明将公开利用藻类C/z/ow//a 生产用于治疗感染的抗菌肽的方法。所述利用藻类Oz/^W/a 生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤1、 在藻类表达系统中生产重组抗菌肽为了能在藻类(C/z/ow//a vw/gw&)中表达抗菌肽，先将人卩防御肽(hBD-3) 和Capl8的cDNA序列连接到表达载体上，以便将其用于对藻类的感染。随 后把经PCR扩增的抗菌肽编码序列插入到表达载体中。得到的重组载体先在 体外转化农杆菌，接着利用标准电转化的方法在组织培养皿中与藻细胞 (CM^//aVW/g^^)共培养。在卡那霉素的选择压力下共培养5-10天后，转 基因藻开始生长。在本步骤中，我们会在插入序列中连接His-tag标签，以便 后期对重组蛋白进行检测和筛选。2、 纯化重组抗菌肽我们会预先在蛋白的C末端添加His-tag以便检测抗菌肽是否表达，以及 纯化过程中也能使用该标签达到最好的效果。纯化工具使用Maxi His-tag纯化 柱(USB公司)，纯化方法则完全按生产商提供的标准程序进行。纯化出来的 抗菌肽蛋白进一步用Western blotting的方法加以确认，His-tag抗体来源于USB 公司。如果需要纯度更高的蛋白用于检测其抗菌活性，则使用高效液相色谱的 方法。3、检测重组抗菌肽对微生物的抗菌活性用肉汤培养的每一种微生物先在其最适条件下(厌氧或需氧，37°C)培养， 随后转接以进行HTS微滴度平板检测。我们会检测浓度按IO倍连续稀释的重 组抗菌肽活性，起始浓度一般在l-25pM的区间范围内。这样可以在一个为滴 度平板上检测不同种属及不同接种量(如10%、 5%、 1%)的微生物对抗菌肽 的反应及其程度。添加任天清(指示作用)后，将微生物与重组抗菌肽共培养 2-8小时，接下来可以通过在600nm或540nm处观察共培养溶液的颜色变化来 判断抗菌肽对微生物的致死作用，或者通过将共培养液涂平板后统计菌落数的 方法。
具体实施方式
本发明提供一种高效、大量、无污染的方法来生产抗菌肽，用于治疗各种 病原菌引起的感染。以下实施实例详细说明本发明，但不应视为本发明范围的 限制。实施例一藻种培养接种藻种于稀释的LB培养基，在1000 mL的三角烧瓶中培养。将三角瓶放在光照培养箱中培养，控制其培养条件光照强度75.3 肌lmmol/m、，温度 为26°C， ph为6~8。每天搅拌三次，每次1分钟，待藻长到一定程度后扩种于73000ml的三角烧瓶中，放在温度较低、光线较弱的地方，人工通入经过过滤的 空气进行培养，每3个星期左右扩种1次。扩大培养的程序为3 000mL三角 烧瓶—20L细口玻璃瓶—桶中培养—生产池。 实施例二抗菌肽基因克隆到穿梭载体用PCR克隆抗菌肽基因，例如hbd3andCapl8基因。将抗菌肽基因克隆到 穿梭载体，以质粒形式存在。例如为了在PCR中克隆hbd3基因，在上海生工公 司合成扩增引物，上游引物含有XhoI限制位点，下游引物含有XbaI限制位点。PCR(Polymerase Chain Reaction)在下列条件用"DNA热循环者"和Tag DNA 聚合酶(Takara公司)作为反应试剂进行的。反应物PCR缓冲剂、1.25mMdNTP混合物、模板、引物(上游和下游)、Tag酶、 无菌水。将以上成分混合，并使该混合物进行PCR反应。 PCR循环变性过程 94 。C 60s退火过程 52 。C 60s延伸过程 72 °C 120s由以上过程组成的一个循环重复30个循环。反应完成后，将以上反应混合 物10ul进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物片段大小是否符合。 抗菌肽基因与穿梭质粒连接-用胶回收试剂盒(Invitragen公司)回收作为PCR产物的抗菌肽目的片段， 详细步骤参考试剂盒内的说明书。回收后的片段与pGEM-T载体连接，其连接 体系为反应缓冲剂、pGEM-T载体、PCR产物抗菌肽片段、T4连接酶。反应 1小时后转入4 。C连接反应16小时。 蓝白斑筛选连接产物，酶切获得目的片段，构建穿梭载体将以上连接反应产物用氯化钙的方法转化入感受态状态的Escherichia coli JM109细胞，涂布到含有0.2M IPTG的固体培养基(10g蛋白胨、5g酵母粉、 5gNaCl、和16g琼脂溶解于1升双蒸水)。在该培养基挑取白色阳性菌落扩增培 养，16小时后收集细胞并利用碱裂解法小量制备质粒。然后利用Xho I和Xba I 双酶切质粒并回收抗菌肽目的片段。该片段与同样经过Xho I和XbaI双酶切处 理的表达载体连接，其连接体系为表达载体、抗菌肽目的基因、T4连接酶、 无菌水。连接产物为目的基因与表达载体连接的质粒，简称Amp-表达载体。 实施例三根癌农杆菌的培养和转化利用冻融法把以上构建好的Amp-表达载体转入根癌农杆菌感受态细胞中， 涂布于固体培养基上(LB +40 mg/ L利福平+25 mg/ L链霉素+75 mg/ L庆大霉 素)，挑取单菌落，在2mL农杆菌液体培养基中，28 °C培养过夜，取1 mL以 上培养物，加入50mL农杆菌液体培养基中，28。C培养至OD6()()=L0，将50 mL农杆菌液经3500 4000 r/ min离心8 min收集菌体，用UM1液体培养基 重悬，28。C继续培养3 4h，至0。600 = 0.50 实施例四藻的遗传转化及转化株的筛选将以上培养好的藻放入上述农杆菌培养液中，在190r/min， 28'C摇床上共 培养10min后，用无菌滤纸吸去除多余培养液，置于铺有一层无菌滤纸的UM1 培养基上，用封口膜封好培养皿，25°C，于暗处共培养约60 h，之后依次用无 菌水、含500mg/L氨苄青霉素的无菌水和用含500mg/L氨苄青霉素的UM1 将农杆菌洗掉，放在UM2培养基上，用封口膜封好培养皿，暗处培养，待藻 种生长到一定程度时，转至UM3培养基中继续培养，之后转至无激素的MSO 培养基中培养，得到藻转化株，而非转化株则在含有50mg/L卡那霉素的培养 基上逐渐死亡。实施例五藻的转化株的筛选和抗菌肽活性碾碎1克藻抗菌肽转化株，将碾碎的藻抗菌肽转化株放入1毫升PBS缓冲液中。取1微升和5微升的溶液加入100微升的变异链球菌5^e/ tococc^ 的培养液中于37'C培养过夜。将此培养液稀释l: 10000。取5微升稀释过的培 养液涂于血液琼脂盘上培养过夜。计算盘上的克隆数，与对照对比计算重组抗 菌肽的抑菌活性结果表明重组抗菌肽具有很好的抗菌活性。终浓度5毫克/毫升 的提取物能够抑制100%变异链球菌Sfre/^ococcw 的生长。更多的稀释研究表明重组抗菌肽具有很好的抗菌活性。实施例六纯化的藻类重组抗菌肽活性检测将5微摩尔浓度的抗菌肽添加到微滴度平板的第一个孔中，然后转移到旁 边的其他平板孔中，转移过程中抗菌肽的浓度是按照10倍连续稀释的。往各孔 中添加20微升已过夜培养的各种微生物。预培养约30分钟后，往各孔中添加 合适的培养基和0.2°/。任天清。可通过观察在500nm和600nm紫外光下培养液的 颜色变化来确定微生物的生存能力。另一种鉴别微生物生存能力的方法是在培 养24-48小时后将培养液涂布在血琼脂平板上，然后统计平板上的菌落数。
权利要求
1、一种用高效、大量、无污染的方法生产的抗菌肽，用于治疗各种病原菌引起的感染。其特征在于利用分子生物学技术，采用具有独立自主知识产权的藻类水生植物特异性表达的技术平台，以藻类Chlorella vulgaris为生物反应器，利用藻类特异性表达的启动子，在藻类中高效表达具有生物活性的重组抗菌肽。
2、 根据权利要求1所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法。其特征在于，所述利用以藻类Oz/OM//" V"/gW&生产用于治疗感染的抗菌肽的主要步骤(1) 在藻类表达系统中生产重组抗菌肽为了能在以藻类CM^化ra/^riy中表达抗菌肽，先将人(3防御因子(hBD-3)和Cap18的cDNA序列连接到表达载体上，以便将其用于对藻类组织的感染。随后把经PCR扩增的抗菌肽编码序列插入到表达载体中，构建重组质粒Amp-表达载体。将以藻类CMo^/fl vz^^n's转接到组织培养平板中的同时，将构建好的重组质粒转化到农杆菌。在卡那霉素存在的条件下培养5-10天后，转基因的藻类开始生长。初步检测转基因的藻类是否具有一定的抗菌活性。(2) 纯化重组抗菌肽我们会预先在蛋白的C末端添加His-tag以便检测抗菌肽是否表达，以及纯化过程中也能使用该标签达到最好的效果。纯化工具使用Maxi His-tag纯化柱(USB公司)，纯化方法则完全按生产商提供的标准程序进行。纯化出来的抗菌肽蛋白进一步用Western blotting的方法加以确认，His-tag抗体来源于USB公司。如果需要纯度更高的蛋白用于检测其抗菌活性，则使用高效液相色谱的方法。
3、 根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于抗菌肽基因与高效穿梭载体连接，并用于转化农杆菌。
4、 根据权利要求2中所述高效、大量、无污染生产抗菌肽的方法，构建重组穿梭质粒Amp-表达载体，其特征在于将人p防御因子(hBD-3)和Capl8的cDNA序列连接到表达载体上。
全文摘要
本发明公开一种生产重组抗菌肽蛋白质的方法。利用水生植物作为生物反应器的优点，生产对多种病原微生物有广泛致死作用的活性抗菌肽，其技术内容大致包括在藻类表达系统中生产重组抗菌肽；纯化重组抗菌肽；检测重组抗菌肽对微生物的抗菌活性。本发明不仅为现阶段可用于治疗病原微生物感染的抗菌肽产量太少的问题，提供了一种新的解决方案，还为如何利用水生植物成本低、无污染、数量大的特点作为生物反应器生产活性蛋白，提供了借鉴意义。
文档编号C12P21/02GK101603050SQ20091014289
公开日2009年12月16日 申请日期2009年5月20日 优先权日2009年5月20日
发明者黄赤夫 申请人:湖北汇特生物医药技术有限公司