专利名称：用以鉴别目标核酸的单核苷酸多态性的检验套组的制作方法
技术领域：
本发明大致有关于依据每一个体同时的两个基因的型别，来决定该个体适合的用 药起始剂量或适用剂量。详言之，本发明是透过一检验套组，特别是有关于用以鉴别一种生 物样品中包括CYP2C9基因与VK0RC1基因在内的目标基因的单核苷酸多态性的检验套组， 来鉴别此个体内至少两目标核酸的单核苷酸多态性，进而决定出该个体适合的用药起始剂 量或适用剂量。
背景技术：
基因序列位置上一群变异的单核苷酸，又称为“单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs) ”，分布于整个基因序列中。一单核苷酸多态性也 可以是等位基因，也就是说，由于基因多态性的存在，因此一物种中某些个体会具有非 变异序列(又称“野生型(wild type)”)，而另一些个体则具有变异序列(又称“变 异型(variants)”)。就动物个体而言，基因多态性可能导致隐性遗传疾病，例如枫 糖尿症(Maple SyrupUrine Disease)、尿核苷单磷酸盐合成缺失症(Deficiency of UridineMonophosphate Synthase)、囊性纤维化症(cystic fibrosis)等；或是造成个体对 某特定治疗药剂具有不同敏感性(sensitivity)或拮抗性(resistance)。就基因多态性所造成的个体对某特定治疗药剂具有不同敏感性或拮抗性这点来 说，以目前广泛使用的抗凝血剂-华法林(warfarin)为例，就必须依照每一个体体内某特 定蛋白质的基因型(野生型或变异型)来决定所需用药剂量，方能避免因用药剂量误差而 使个体出现严重的并发症，例如，出血(参阅Bogousslavsky et al.，Acta. Neurol，Scand.， 71(6) 464-471,1985 ；Landefeld et al.，Am. J. Med.，95(3) :315-328,1993 ；Gullov et al. , J. Thromb. Thrombolysis,1 (1) 17~25,1994 Beyth et al. , Annals of Internal Medicine,133(9) :687_695，2000)。目前已知一种可代谢华法林的酶-P450细胞色素IIC亚族的第9多肽 (Cytochrome P450, subfamily IIC, polypetide 9，CYP2C9)的基因多态性，与患者对华法 林的敏感性/拮抗性有关。更详言之，若将CYP2C9*1视为野生型，则由CYP2C9变异型(包 括CYP2C9*2及CYP2C9*3)所编码产生的多肽，其酶活性很低，使得个体所需华法林剂量将 比野生型个体所需剂量来得低(参阅Furuya et al.，Pharmacogenetics, 5 (6) :389_392， 1995)。然而，由于此二种CYP2C9变异型在亚洲人出现的频率低，所以此基因的多态性无 法完全解释华法林剂量需求的差异，尤其是亚洲人对于华法林需求量较低的现象(参阅 Yuan et al. , Human Moleculargenetics,14(13) :1745_1751,2005 以及 Nasu et al., Pharmacogenetics,7(5) =405-409,1997)。进一步研究发现，另一种参与血液凝结机制的酶_维生素K环氧化物还原复合 物的亚基 1 (Vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1，VK0RC1)的基因多态性 也会影响个体对华法林需求量的多寡(参阅D，Andrea et al. , Blood, 105 (2) =645-649, 2005 ；Rieder et al. ,N. Engl. J. Med. ,352(22) :2285-2293, 2005 ；Obayashi et al. ,Clin.Pharmacol. Ther. ,80(2) 169-178，2006 及 Bodin et al. ,Blood,106(1) : 135-140，2005)。因此，为了能正确地决定每一亟需抗凝血剂治疗的个体所需华法林的正确剂量， 必须能依据每一个体上述两种的基因型别来决定用药剂量，较佳是能在给药前检查每一个 体身上CYP2C9基因与VK0RC1基因的单核苷酸多态性，以便正确地用药并避免出现因用药 剂量不当所产生的并发症。本发明即是针对此一需求而提供可用来鉴别生物样本中包括 CYP2C9基因与VK0RC1基因的单核苷酸多态性的检验套组。
发明内容
基于上述问题，本发明提出可用来鉴别单核苷酸多态性的检验套组，特别是一种 能够鉴别生物样品中包括CYP2C9基因与VK0RC1基因在内的目标基因的单核苷酸多态性的 检验套组。本发明目的在于提供一种用来检验据以判定一个体适用的抗凝血剂剂量的目标 核酸的单核苷酸多态性的试剂组，包含一第一组探针，其中此第一组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO :3、 4及5的核酸序列及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列，且此第一组探针中的一第 二探针具有与任一选自SEQ ID NO :6、7及8的核酸序列及其互补序列相似度至少为80% 的核酸序列；一第二组探针，其中此第二组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO 11、12及13的核酸序列及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列，且此第二组探针中的 一第二探针具有与任一选自SEQ IDN0 14、15及16的核酸序列及其互补序列相似度至少为 80%的核酸序列。上述的试剂组，还可包括一第一引物对，其分别具有与SEQ ID N0 :1及2的核酸 序列相似度至少为80%的核酸序列及其互补序列；上述的试剂组，还可包括一第二引物对，其分别具有与SEQ ID NO 9及10的核酸 序列相似度至少为80%的核酸序列及其互补序列。在一实施方式中，所述的抗凝血剂包含华法林，且所述的目标核酸包括CYP2C9及 VK0RC1。在另一实施方式中，依据本发明所述的试剂组中的该第一引物对与该第一组探针 是用来侦测并定量位于该VK0RC1基因位置-1639处G > A的单核苷酸多态性，且该第二引 物对与该第二组探针是用来侦测并定量位于该CYP2C9基因位置1075处A > C的单核苷酸 多态性。上述的试剂组还包含一第三引物对，其分别具有SEQ ID NO 17及18的核酸序列 及其互补序列；及一第三组探针，其中该第三组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO :19、20及21的核酸序列及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列，且此第三组探 针中的一第二探针具有与任一选自SEQ ID NO :22、23及24的核酸序列及其互补序列相似 度至少为80%的核酸序列。在一较佳实施方式中，该第三引物对与该第三组探针是用来侦测并定量位于该 CYP2C9基因位置430处C > T的单核苷酸多态性。在另一较佳实施方式中，依据本发明所述的试剂组更可包括一用来标定对照组单 核苷酸多态性的探针组；一可用来执行聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的反应液，该反应液中包括耐热型Taq聚合酶，包含A、C、T、G在内的脱氧核糖核酸、及不含 核酸酶的水；以及一说明书，用来说明所述试剂组的使用方法。本发明的实施方式细节将详述于下，然其并非用以限定本发明的范畴，此领域中 任何熟练技术人员，应可理解在不悖离本发明精神及所主张范围下，尚可对本发明内容进 行多种变化及改良，其应仍视为附随的权利要求内容所涵盖的范围。
具体实施例方式本发明提出可用来鉴别目标基因的单核苷酸多态性的检验套组，特别是一种能够 鉴别生物样品中包括CYP2C9基因与VK0RC1基因在内的目标基因的单核苷酸多态性的检验套组。据此，发明人提出适于用来判定包括CYP2C9基因与VK0RC1基因在内的目标基因 的单核苷酸多态性的探针组，包括第一、第二及第三组探针；以及可将所检测目标核酸加 以增量放大的PCR反应用的引物对，包括第一、第二及第三引物对。分别组合使用该第一、 第二及第三组探针以及该第一、第二及第三引物对，来检测一生物样品中VK0RC1基因位 置-1639处G > A的单核苷酸多态性、该CYP2C9基因位置1075处A > C的单核苷酸多态 性、或该CYP2C9基因位置430处C > T的单核苷酸多态性，并将所检测的各目标核酸加以 增量放大。依据本发明，适合用来判别一个体中CYP2C9基因与VK0RC1基因的单核苷酸多 态性的探针组与引物对如下文表1所揭示。本文中所指的“探针”为一种其部分结构含有2 200个寡核苷酸的分子。此探针 需具有适当长度，以便藉由杂合作用(hybridization)而结合至所关注的核酸序列上，合 宜的长度在8 100个寡核苷酸之间，例如，8 20、10 30、15 45、或50 80个寡核 苷酸。该些探针的设计是依据目标核酸中已知的单核苷酸多态性及其特性来设计，例如GC 含量、链合温度、内部配对情形等，其一般可藉由软件程序来进行预测。此外，为方便侦测， 也可将本文所述的探针与标定物连结，例如，一发光基团或含有配体(如，抗原)的分子，以 便藉由公知的方法直接或间接测定一生物样品中目标核酸的含量。至于引物对的设计，基本上其不包含单核苷酸多态性(SNP)位置，而是利用与SNP 位置侧翼序列(franking sequence)相同或互补的序列，做为可与目标核酸杂合的引物对 序列，这些侧翼序列通常是物种中不同基因个体的保守序列。这些引物对的目的是用来将 含有单核苷酸多态性(SNP)位置的目标核酸加以复制并放大。引物本身也需具备足够的长 度，以便藉由杂合作用(hybridization)而结合至所关注的核酸序列上，合宜的长度在8 100个寡核苷酸之间，例如，8 20、10 30、15 45、或50 80个寡核苷酸间。可使用已知方法来增量放大经本发明探针加以标定、且可与本发明引物对杂合 的目标核酸，这些方法包括聚合酶链反应(polymerase chainreaction, PCR)、竞争性的具 序列专一性探针/寡核苷酸与酶连结的免疫吸附分析(competitive sequence specific probes/oligonucleotides coupledwith enzyme-linked immunosorbent assay, CSSP-ELISA)、实时 PCR (realtime PCR)、限制片段长度多态性分析(restriction fragment lengthpolymorphism, RFLP)、变性高效液相色谱层析法(Denaturing HighPerformance Liquid Chromatography,DHPLC)等。较佳是使用实时PCR或是RFLP来进行目标核酸的增 量反应。
PCR反应一般包含变性、链合、延长共三个步骤的操作，可重复进行多次，以便获得 足量的放大产物。重复施行的次数与样品本身性质有关，其重复施行的次数则与其所使用 的样本性质及其它因素有关。若样本为复杂的核酸混合物，则重复施行聚合酶链反应的次 数就必须较多。通常重复施行PCR的次数至少20次左右，但也可能达到40次、50次、60次 甚至100次之多。此外，当使用实时PCR时，可利用DNA结合剂或具序列专一性的探针来检 测所获得的PCR产物。DNA结合剂的例子包括SYBR Green，而具序列专一性的探针则包 括水解探针(例如，TaqMan、Beacons及Scorpions)及杂合探针。此外，适合使用本发明检验试剂组的生物样品包含血清样本、唾液样本等。当操作 本发明的检验试剂组时，依据说明书的指示，先从生物个体样本(如，血清或唾液)中抽取 出基因组DNA，接着，将所抽取出的DNA与本发明检验试剂组中所提供的专一性探针组、引 物对和PCR反应液混合，依照指示进行实时PCR反应，包括(i)在95°C下活化聚合酶3至 10分钟，(ii)在92°C下变性DNA模板15秒及在60°C下键合/延长DNA链90秒，及(iii) 进行变性/键合/延长循环30至40次。另外，依据本发明所述的试剂组还可更包括一用来标定对照组单核苷酸多态性的 探针组，适合做为对照组的单核苷酸多态性，可以是VK0RC1基因位置包含-1639区域，及 CYP2C9基因位置包含+430、+1075区域所建构的质粒或其基因片段。表1 用来鉴别及定量目标基因的单核苷酸多态性的引物对与探针 实施例以实时PCR测定VK0RC1基因位置-1639处及CYP2C9基因位置在+430、 +1075 处的 SNP本测试使用100个由台湾健康人血液抽取出的DNA，及100个白种人DNA样本进行 分析，其中100个白种人DNA源自于美国Corielllnstitute for Medical Research。以 本文表1所揭示可用以扩增含有VK0RC1基因位置-1639区域、CYP2C9基因位置在+430、 +1075区域的PCR引物对及探针组来进行检测。PCR扩增反应依如下方式操作(i)在95°C下活化聚合酶310分钟，(ii)在92°C下变性DNA模板15秒及在60°C下键合/延长DNA链90秒，及(iii)进行变性/键合/延 长循环30至40次。合成一对用于侦测位置-1639的单核苷酸多态性的TagMan探针组(共两条探针， 分别包含SEQ ID NO :4及7的序列)，用于侦测-1639G的探针以萤光染料FAM标记，而用 于侦测-1639A的探针则以萤光染料VIC标记。同时亦合成用于侦测CYP2C9变异型的TagMan探针组。针对CYP2C9基因的c. 430C 单核苷酸多态性或C.430T单核苷酸多态性，各自设计两条探针，分别包含SEQ ID NO :20及 23，以测定患者是否带有CYP2C9*1或CYP2C9*2。两个探针其中之一以萤光染料VIC进行标 记而另一者则以FAM进行标记。针对c. 1075A单核苷酸多态性或c. 1075C单核苷酸多态性，分别设计出两条探针， 分别包含SEQ ID N0:13及16的序列，以测定患者是否带有CYP2C9*1或CYP2C9*3。两个 探针其中之一以VIC进行，而另一者则以FAM进行标记。除了萤光染料之外，所有探针亦以淬灭基团(quencher moiety)标记。当一探针 完美配对于一单核苷酸多态性时，该染剂将释出萤光信号。当配对不完美时，淬灭基团将淬 灭萤光信号。以循环阀值(threshold cycle (Ct))来测定单核苷酸多态性(含有关注的核苷 酸)存在与否。一 20至30的Ct值暗示存在有特定单核苷酸多态性，而大于35的Ct值则 暗示无特定单核苷酸多态性存在。若一单核苷酸多态性为同型接合，可预期只有VIC或FAM 之一者释出信号，会实质增加。若一单核苷酸多态性为异型接合，可预期两种染料的释出信 号，会实质增加。此外，为确保PCR反应不致出现假阳性或假阴性的结果，每次操作时，还必须以不 含核酸酶的水取代DNA做为空白对照组。另外，以个体单核苷酸多态性取代样本DNA作为 阳性控制组，依相同方式进行检测。在本试验中，总计收集200个健康人血液或DNA样本，分别包含台湾人100个血 液样本及白种人100个DNA样本进行分析，其中100个白种人DNA源自于美国Coriell Institute for Medical Research。然后，由上述的实时 PCR 测定 VK0RC 1 基因位置-1639 的SNP及CYP2C9基因的基因型，且藉由双向直接测序确定此数据的准确性。检测及测序结 果表示于下表2 4中，由表2 4结果可知本发明检测试剂组的专一性及敏感性> 99 %。表2 :VK0RC1基因位置-1639的试剂组的检测结果 表3 :CYP2C9c. 1075试剂组的检测结果 表4 :CYP2C9c. 430试剂组的检测结果 其它实施例所有在本发明说明书中揭露的特征可以任何组合方式组合。在本说明书中揭露的 每一特征可由任一具相同、对等或相似目的的可替代特征置换。因此，除非特别声明，揭露 的每一特征仅为对等或相似特征的通称系列的说明例示。由前述说明，一本领域技术人员 可轻易确定本发明的实质特征，且在未偏离本发明的技术思想及范畴下，可完成多种本发 明不同改变及润饰以适于多种用途及条件。因此，其它实施例亦涵括于后文权利要求的范 畴中。序列表<110>世基生物医学股份有限公司<120>用以鉴别目标核酸的单核苷酸多态性的检验套组<130)092565<160>24<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211 >24<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<223> 引物<400>1gtcaagcaag agaagacctg aaaa24<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature <223>引物 <400>2
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权利要求
一种试剂组，用来检验据以判定一个体适用的抗凝血剂剂量的目标核酸的单核苷酸多态性，包含一第一引物对；一第二引物对；一第一组探针，其中该第一组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO3、4及5的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列，且该第一组探针中的一第二探针具有与任一选自SEQ ID NO6、7及8的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列；及一第二组探针，其中该第二组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO6、7及8的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列，且该第二组探针中的一第二探针具有与任一选自SEQ ID NO11、12及13的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列。
2.如权利要求1所述的试剂组，其中该第一引物对分别具有与SEQIDNO :1及2的核 酸序列或及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列。
3.如权利要求1所述的试剂组，其中该第二引物对分别具有与SEQIDNO 9及10的核 酸序列及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列及其互补序列。
4.如权利要求1所述的试剂组，还包含一第三引物对；及一第三组探针，其中该第三组探针中的一第一探针具有与任一选自SEQ ID N0:19、20 及21的核酸序列及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列，且该第三组探针中的一第 二探针具有与任一选自SEQ IDNO :22、23及24的核酸序列及其互补序列相似度至少为80% 的核酸。
5.如权利要求4所述的试剂组，其中该第三引物对分别具有与SEQIDN0:17及18的 核酸序列或及其互补序列相似度至少为80%的核酸序列。
6.如权利要求1所述的试剂组，其中所述的抗凝血剂包含华法林。
7.如权利要求1所述的试剂组，其中所述的目标核酸包括P450细胞色素IIC亚族的第 9多肽，及维生素K环氧化物还原复合物的亚基1。
8.如权利要求1所述的试剂组，其中该第一引物对与该第一组探针是用来侦测并定量 位于该VKORCl基因位置-1639处的单核苷酸多态性。
9.如权利要求1所述的试剂组，其中该第二引物对与该第二组探针是用来侦测并定量 位于该CYP2C9基因位置1075处的单核苷酸多态性。
10.如权利要求5所述的试剂组，其中该第三引物对与该第三组探针是用来侦测并定 量位于该CYP2C9基因位置430处的单核苷酸多态性。
全文摘要
在此揭示用以鉴别一种生物样品中包括CYP2C9基因与VKORC1基因在内的目标基因的单核苷酸多态性的检验套组。此套组包含一第一组探针，其中此第一组探针中一第一探针具有与任一选自SEQ ID NO3、4及5的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列，且此第一组探针中一第二探针具有与任一选自SEQ IDNO6、7及8的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列；一第二组探针，其中此第二组探针中一第一探针具有与任一选自SEQ IDNO11、12及13的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列，且此第二组探针中一第二探针具有与任一选自SEQ ID NO14、15及16的核酸序列及其互补序列相似度至少为80％的核酸序列。此试剂组还可包括一第一引物对及一第二引物对。
文档编号C12Q1/68GK101886117SQ200910141420
公开日2010年11月17日 申请日期2009年5月13日 优先权日2009年5月13日
发明者李怡侬, 林心郁, 许仁祺 申请人:世基生物医学股份有限公司