专利名称：一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法及菌株的制作方法
一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法及
菌株
(-)技术领域 本发明涉及一种利用腈转化酶生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的 方法，以及可用于生产腈转化酶的新菌株——红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149。
背景技术：
由于近年来随着农药和医药科学的发展，烟酸系列化学品越来越受到广泛地关注 和应用。烟酸的2位氯取代物2-氯烟酸则由于其特殊的生理活性，在医药、农药领域得到 了广泛的应用，它可用于合成许多医用止痛剂或抗炎剂，医用抗菌素、治疗心血管疾病的药 物以及农用杀菌剂、杀虫剂和除草剂等，特别是在农药领域，2-氯烟酸的应用显得尤为突 出。以吡啶及其衍生物为中间体的新一代农药具有高效、低毒、环境相容性好的特点，正在 成为开发热点。由2-氯烟酸为母体开发的新农药，不仅农药毒性低，而且活性高，我国是一 个农业大国，提高和改善人民的生活水平，生产出更多更好的农药以保证稳定的丰收是非 常必要的。除此之外其衍生物2-氯烟酸甲酯、2-氯-N，N- 二甲基烟酰胺和2-巯基烟酸也 是重要的医药和农药中间体。由它们出发，也可合成许多医用抗菌素、治疗心血管疾病的药 物以及农用杀菌剂、杀虫剂和除草剂等。鉴于2-氯烟酸已成为重要的农药和医药中间体， 应用前景十分广阔。2002年，全球对2-氯烟酸的需求量约为300t，而2003年达到600t以 上，增长高达100%，随着以2-氯烟酸作为原料的新的医药产品的开发，烟嘧磺隆专利的过 期，以及不断发展的医药化工行业，2008年需求量在1500t以上。而现在国内产量大致在 600 700t左右，而2-氯烟酸的市场价格原来在128000元/t，现在达到14万左右，市场 前景可观。但由于缺乏合适的生产路线，2-氯烟酸在世界范围内供不应求，严重制约着新医 药及新农药的研究与发展，在我国表现得尤为突出，这与2-氯烟酸急剧增加的市场需求相 悖，同时也表明目前缺乏较好的2-氯烟酸合成路线，因此，深入研究2-氯烟酸的生产具有 重大的经济效益和社会效益。目前2-氯烟酸主要是通过化学合成的方法获得。其合成方法主要有(1)烟酸氮 氧化-氰化-水解法该方法原料价格较贵，所制得的产品成本较高，经济效益较差，此外在 后两步反应中易产生2，6位的同分异构体，不易分离，产品纯度也比较低，不符合医药和农 药的要求，总的收率较低，环境污染大；(2)3-氰基吡啶氮氧化法-氯化-水解法该方法国 内较为成熟，但总的反应收率较低，反应时间长，可操作性差，需要昂贵的催化剂并产生大 量酸性废水，环境污染大；(3) 3-甲基吡啶氰化_氧化法该方法所用原料3-甲基吡啶国内 没有工业化生产，氯化反应条件苛刻，并产生大量异构体，分离困难，生产成本大；(4)氰基 乙酸乙酯氰化_丙烯醛迈克尔加成-水解法该反应的缺点是反应原料丙烯醛毒性大，消耗 量也较大，易挥发，且整个工艺路线繁琐，操作步骤冗长，反应中使用溶剂多，回收困难。因 此这些化学方法缺陷较多，一方面有大量废酸排出，造成严重的环境污染，另一方面设备要 求高，反应条件苛刻，成本较高。由于污染大、成本高，这些方法都不适合大规模工业化生产。所以，2-氯烟酸的高效、清洁生产方法具有极大的社会和生态效益。近年来生物技术领域的突破性进展，使生物催化在化学合成中日趋重要。生物催 化是一种新型的转化技术，特别适合于制药及其相关工业中活性化合物的合成。当今社会 对“可持续发展”、“绿色化学”以及“环境友好制造”的呼声越来越高，因此生物催化和生物 转化过程受到前所未有的重视，被普遍认为是生物技术的第三次浪潮，正在极大地推动生 物产业的发展，具有重大的社会意义和经济效益。利用腈转化酶生物催化生产酰胺、羧酸及 其衍生物是一种非常有效的生产方法，可以极大地降低能耗、节省原料、减少污染，将生物 技术应用于腈化合物的转化合成，已经引起人们的高度重视和关注。这一切给生物法生产 2-氯烟酸的发展带来了机遇。
发明内容
本发明目的是提供一种利用腈转化酶生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸 的方法，以及可用于生产腈转化酶的新菌株——红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149。 本发明采用的技术方案是—种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法，所述方法包括在以 2_氯-3-氰基吡啶为底物、以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)经发酵培养获得的 腈转化酶为催化剂、以水或磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于PH7. O 9. 0、25 60°C 下进行催化水解反应，制得所述2-氯烟酸。所述腈转化酶用量以使2-氯-3-氰基吡啶充 分反应为止，也可过量。所述腈转化酶来自红平红球菌CCTCC NO =M 209194经发酵培养获得的含酶细胞， 所述反应体系中含酶细胞浓度以含酶细胞湿重计为10 20g/l。所述反应体系中，底物2-氯-3-氰基吡啶初始浓度为1. 0 5. 0g/l。所述含酶细胞由如下方法制备得到将红平红球菌接种至适用于红平红球菌的发 酵培养基中，在温度25 30°C、起始pH 6. 5 7. 0、摇床转速100 300rpm的条件下震荡 培养48 72h，离心分离，得到所述含酶细胞。所述适用于红平红球菌的发酵培养基为常规适用于红平红球菌的液体培养基，本 发明中所述发酵培养基终浓度组成如下麦芽糖5. 0 15. Og/Ι，酵母粉7. 0 18. 0g/l, 己内酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η20 0· 1 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0. 1 0. 5g/l, KH2PO4 0. 1 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6· 5 7· 0。具体的，所述方法如下(1)红平红球菌CCTCC NO =M 209194接种至种子培养基，25 30°C培养16 20h，得到种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖10. 0 20. Og/Ι，蛋白胨5. 0 10. Og/Ι,己内酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0· 2 0. 5g/ 1，KH2PO4O. 2 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6· 5 7· 0 ；(2)步骤(1)种子液以3 10%体积比接种至发酵培养基，在25 30°C、初始 PH6. 5 7. 0条件下震荡培养48 72h，离心分离，得到菌体含酶细胞；所述发酵培养基终 浓度组成如下麦芽糖5. 0 15. Og/Ι，酵母粉7. 0 18. Og/Ι,己内酰胺4. 0 8. 0g/l, MgSO4 · 7Η200· 1 0. 5g/l, K2HPO4 · 3H20 0· 1 0. 5g/l, KH2PO4 0· 1 0. 5g/l, FeSO4 · 7H200. 01 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6. 5 7. 0。
(3)将步骤(2)菌体含酶细胞添加至含有2-氯-3-氰基吡啶的反应体系中，所述 反应体系中菌体含酶细胞以含酶细胞湿重计浓度为10 20g/l，2-氯-3-氰基吡啶初始浓 度为1. 0 5. Og/Ι，于pH7. 0 9. 0,25 60°C下进行催化水解反应10 12h，制得所述 2-氯烟酸。反应液中2-氯烟酸浓度的测定对步骤(3)获得的反应液1ml，离心，上清液进行 液相色谱分析测定底物的含量。液相色谱的条件日本岛津液相色谱仪，不锈钢填充柱，填料为C18，长0. 25m,内径 4. 6mm,流速lml/min，柱温室温，流动相为乙腈0. 1 %磷酸水溶液(25V 75V)，进样量为 IOul0其中，2-氯烟酸出峰时间为4. 2min。采用外标法确定样品中2-氯烟酸的含量。本发明还涉及一株筛选到的产腈转化酶的新菌株——红平红球菌(Rhodococcus erythropolis) ZJB-09149，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学， 430072，保藏日期2009年9月4日，保藏编号CCTCC NO =M 209194。本发明所涉及的菌株是通过如下方法筛选得到的(1)将由全国各地农药厂附件采集的土样和污水样接种到富集培养基中，在 30°C,150rpm的摇床上富集培养72h后，再取Iml培养液接种到新鲜的富集培养基上培养 72h。如此重复3个循环。富集培养基的配方如下(终浓度)葡萄糖5 10g/l，K2HPO4 0. 2 0. 5g/l, KH2PO4O. 2 0. 5g/l, MgSO4 0. 2 0. 5g/l, NaCl 1 2g/l, FeSO4 0. 01 0. 02g/l，2-氯-3-氰基吡啶 0. 7 1. 4g/l，pH 6. 5 7. 0。(2)最后一次培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落到斜面保藏。平板培 养基为富集培养基中加入1. 5-2. 0%的琼脂。(3)挑取的单菌落接种到发酵培养基，组分含量如下(终浓度)葡萄糖10. 0 20. Og/Ι，蛋白胨 5. 0 10. Og/Ι，己内酰胺 4. 0 8. Og/1，MgSO4 · 7Η20 0· 2 0. 5g/l， K2HPO4 · 3H20 0· 2 0. 5g/l, KH2PO4 0· 2 0· 5g/l, FeSO4 · 7H20 0· 01 0. 02g/l，溶剂为 水，pH值6. 5 7. 0 ；在25 30°C、初始pH6. 5 7. 0条件下震荡培养48 72h，离心分 离，得到菌体含酶细胞；离心后悬浮于磷酸缓冲体系中。(4)通过加入2-氯-3-氰基吡啶进行转化实验，共分离获得3株可生物催化制备 2-氯烟酸的菌株；经进一步复筛，最终获得目标菌株ZJB-09149。本发明筛选得到的菌株ZJB-09149，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌 鉴定手册(第八版)》的生理生化鉴定，菌株为革兰氏阳性，形态近似为杆状，成对生，宽约 0. 5 1. 0 μ m，长约1. 0 1. 5 μ m，在筛选平板上30°C培养36h，菌落形态特征呈圆形，边缘 整齐，中间略突起，易挑取，菌落呈粉红色，于30°C恒温培养24h，单菌落直径约2 3mm。16S rDNA序列分析以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物pl6S_8 5' -aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3‘禾口 pl6S_1541 5‘ -aag gag gtg ate cagccg ca~3‘ ^im 菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1434bp， 将该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)的同源性最高。根据以上微生物学特征鉴定，该新菌株ZJB-09149属于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，该株微生物不属于现己公开菌种的任何一种，该株微生物具有生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的能力，可以用于2-氯烟酸的生产。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明从微生物群中筛选得到可生物催化 生产 2-氯烟酸的红平红球菌 ZJB-09149 (Rhodococcuserythropolis ZJB-09149) =CCTCC NO =M 209194。其在适合条件下，能有效生产2-氯烟酸；(2)本发明将红平红球菌菌株 ZJB-09149用于生物催化生产2-氯烟酸实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产2-氯烟 酸，12h内2-氯-3-氰基吡啶转化率达到60 100% (见实施例3 5)，因此该菌在生物 催化生产2-氯烟酸的领域中具有广泛的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 新菌株ZJB-09149的筛选
从将由全国各地农药厂附件采集的土样和污水样接种到富集培养基中；在30°C， 150rpm的摇床上富集培养72h后，再取Iml培养液接种到新鲜的富集培养基上培养72h。 如此重复3个循环。最后一次培养液稀释后涂布到平板培养基上，挑取单菌落到斜面保藏。 挑取的单菌落接种到发酵培养基，在25 30°C、初始pH6. 5 7. O条件下震荡培养48 72h，离心分离，得到菌体含酶细胞；悬浮于磷酸缓冲体系中，通过加入2-氯-3-氰基吡啶进 行转化实验。将0. Ig湿菌体加入终浓度为1. 38g/l的2-氯-3-氰基吡啶的反应液中，反应 12h后，分别测定2-氯烟酸的含量，从中筛选出生产2-氯烟酸能力最强的菌株ZJB-09149， 作为进一步研究的出发菌株。所述富集培养基配方为(终浓度)葡萄糖5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/l，KH2PO4 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，NaCl lg/1，FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，2_ 氯-3-氰基吡啶 0. 7g/ 1，ρΗ 7.0，溶剂为水。所述发酵培养基配方为(终浓度)葡萄糖20g/l，蛋白胨5g/l，已内酰胺4g/l， Κ2ΗΡ04 · 3H20 0. 5g/l, KH2PO4 0. 5g/l, MgSO4 · 7H20 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l, pH 7. 0， 溶剂为水。实施例2 新菌株ZJB-09149的鉴定对实施例1筛选得到的菌株ZJB-09149按《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，以 及《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化特性鉴定。该菌株菌落呈圆形，边缘整齐，中间略突起，易挑取，菌落呈粉红色，于30。C恒温培 养24h，单菌落直径约2 3mm。在上述基础上，进一步将菌株ZJB-09149按精编分子生物学 实验指南方法提取染色体DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物pl6S-8 5' -aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3‘禾口 pl6S_1541 :5‘ -aag gag gtg ate cag ccg ca~3‘扩 增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托上海皓嘉科技发展有限公司 对该菌16SrDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检 索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对；基于形态、生理生化特 征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，将菌株ZJB-09149鉴定为红平红球 菌,拟命名为红平红球菌ZJB-09149 (Rhodococcus erythropolis ZJB-09149)，此菌株已于 2009年9月4日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO =M 209194。菌株ZJB-09149, CCTCC NO :M 209194 的 16S rDNA 序列如下TTGTTACGACTTCGTCCCAATCGCCGATCCCACCTTCGACGGCTCCCTCCCACAAGGGGTTAAGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCATGACGTG ACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCGTTGCTGATCTGCGATTACTAGCGACTCCGACTTCACGGGGTCGAGTTGCAGACCCCGATCCGAACTGAGACCAGCTTTAAGGGATTCGCTCCACCTCACGGTCTCGC
AGCCCTCTGTACTGGCCATTGTAGCATGTGTGAAGCCCTGGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCTTACGAGTCCCCACCATAACGTGCTGGCAACATAAGATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGGGCCACATCTCTGCAGCTTTCCGGTATATGTCAAACCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCACATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGCGCTTAATGCGTTAGCTACGGCACGGATTCCGTGGAAGGAACCCACACCTAGCGCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCACGCTTTCGTTCCTC
AGCGTCAGTTACTGCCCAGAGACCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCAGTCTCCCCTGCAGTACTCAAGTCTGCCCGTATCGCCTGCAAGCCAGCAGTTGAGCTGCTGGTTTTCACAAACGACGCGACAAACCGCCTACGAACTCTTTACGCCCAGTAATTCCGGACAACGCTTGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTGCGCTTCGTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGTCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTAGGCCATTACCCCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCCCATCCTGCACCGATAAATCTTTCCACCACCCACCATGCGATAGGAGGTCATATCCGGTATTAGACCCAGTTTCCCAGGCTTATCCCGAAGTGCAGGGCAGATCACCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCGCTCGTGTACCCCGAAAGGCCTTACCGCTCGACTTGCATGTGTAAGCA实施例3 利用菌株ZJB-09149生物催化生产2_氯烟酸按以下步骤进行(1)斜面培养基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1，K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，琼脂 20g/l，pH 7. O，溶剂为水；(2)菌种的活化培养采用步骤(1)斜面培养基，将新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培养24h后，备用；(3)种子液的制备将步骤(2)活化后的菌种1环接入种子培养基中，在培养条件 30 0C，200r/min 下培养 20h。(4)菌种的发酵培养将步骤(3)菌种液按10%体积比接种量接入发酵培养基中，在培养条件30°C，200r/min下培养72h，进行离心分离，得到菌体；发酵培养基配方为(终浓度)麦芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι,己内酰胺 8. Og/Ι，MgSO4 ·7Η20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3Η20 0. 5g/l, KH2PO4O. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6· 5 7· 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸将步骤(4)得到的湿菌体0. Ig 加入到IOml含有0.0138g 2-氯-3-氰基吡啶的磷酸盐缓冲液(pH7. 0)反应体系中，30°C， 150r/min 反应 12h ；(6)转化液中2-氯烟酸含量的测定取Iml转化液，离心，上清液进行液相色谱分 析日本岛津液相色谱仪，不锈钢填充柱，填料为C18，长0. 25m,内径4. 6mm，流速lml/min，柱 温室温，流动相为乙腈0. 磷酸水溶液(25V 75V)进样量为10 μ 1其中，2-氯烟酸出 峰时间为4. 2min，确定样品中2-氯烟酸的含量为0. 95g/l，摩尔转化率为60%。实施例4 利用菌株ZJB-09149生物催化生产2_氯烟酸(1)斜面培养基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1，K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，琼脂 20g/l，pH 7. 0，溶剂为水；(2)菌种的活化培养采用步骤(1)斜面培养基，将新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培养24h后，备用；(3)种子液的制备将步骤(2)活化后的菌种1环接入种子培养基中，在培养条件 30 0C，200r/min 下培养 20h。(4)菌种的发酵培养将步骤(3)菌种液按10%体积比接种量接入发酵培养基中， 在培养条件30°C，在200r/min下培养72h，进行离心分离，得到菌体；发酵培养基配方为 麦芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι，己内酰胺 8. Og/1，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/ 1，KH2PO4 0. 5g/l，FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6. 5 7. 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸生物催化2_氯_3_氰基吡啶生 产2-氯烟酸将步骤(4)得到的湿菌体0. 2g加入到IOml含有0. 0138g 2-氯-3-氰基吡 啶的磷酸盐缓冲液(PH7. 0)反应体系中，30°C，150r/min反应12h ；(6)转化液中2-氯烟酸含量的测定同实施例3。确定样品中2-氯烟酸的含量为 1.6g/l，转化率为99%。实施例5 利用菌株ZJB-09149生物催化生产2_氯烟酸(1)斜面培养基的配制葡萄糖10g/l，酵母膏3g/l，NaCl lg/1, K2HPO4 · 3H20 0. 2g/l，MgSO4 · 7H20 0. 2g/l，琼脂 20g/l，pH 7. 0，溶剂为水；(2)菌种的活化培养采用步骤(1)斜面培养基，将新菌株ZJB-09149，在30°C活 化、培养24h后，备用；(3)种子液的制备将步骤(2)活化后的菌种1环接入种子培养基中，在培养条件 30 0C，200r/min 下培养 20h。(4)菌种的发酵培养将步骤(3)菌种液按10%体积比接种量接入发酵培养基中， 在培养条件30°C，200r/min下培养72h，进行离心分离，得到菌体；发酵培养基配方为麦 芽糖 5. Og/Ι，酵母粉 7. Og/Ι,己内酰胺 8. Og/Ι，MgSO4 · 7H20 0. 5g/l，K2HPO4 · 3H20 0. 5g/l， KH2PO4 0. 5g/l, FeSO4 · 7H20 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6· 5 7· 0。(5)生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸生物催化2_氯_3_氰基吡啶生 产2-氯烟酸将步骤(4)得到的湿菌体0. Ig加入到IOml含有0. 0138g 2-氯-3-氰基吡啶的磷酸盐(pH7. 0)反应体系中，35°C，150r/min反应12h ；(6)转化液中2-氯烟酸含量的测定同实施例3。确定样品中2-氯烟酸的含量为1.3g/l，转化率为84% οSEQUENCE LISTING〈110〉浙江工业大学〈120〉一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2_氯烟酸的方法及菌株〈130〉<160>1<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>1434<212>DNA<213>Rhodococcus erythropolis<400>1ttgttacgac ttcgtcccaa tcgccgatcc caccttcgac ggctccctcc cacaaggggt 60taagccaccg gcttcgggtg ttaccgactt tcatgacgtg acgggcggtg tgtacaaggc 120ccgggaacgt attcaccgca gcgttgctga tctgcgatta ctagcgactc cgacttcacg 180gggtcgagtt gcagaccccg atccgaactg agaccagctt taagggattc gctccacctc 240acggtctcgc agccctctgt actggccatt gtagcatgtg tgaagccctg gacataaggg 300gcatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccgagttg accccggcag tctcttacga 360gtccccacca taacgtgctg gcaacataag ataggggttg cgctcgttgc gggacttaac 420ccaacatctc acgacacgag ctgacgacag ccatgcacca cctgtatacc gaccacaagg 480ggggccacat ctctgcagct ttccggtata tgtcaaaccc aggtaaggtt cttcgcgttg 540catcgaatta atccacatgc tccgccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt 600tagccttgcg gccgtactcc ccaggcgggg cgcttaatgc gttagctacg gcacggattc 660cgtggaagga acccacacct agcgcccacc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 720tcctgttcgc tacccacgct ttcgttcctc agcgtcagtt actgcccaga gacccgcctt 780cgccaccggt gttcctcctg atatctgcgc atttcaccgc tacaccagga attccagtct 840cccctgcagt actcaagtct gcccgtatcg cctgcaagcc agcagttgag ctgctggttt 900tcacaaacga cgcgacaaac cgcctacgaa ctctttacgc ccagtaattc cggacaacgc 960ttgcacccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccggtgctt cttctgcagg 1020taccgtcact tgcgcttcgt ccctgctgaa agaggtttac aacccgaagg ccgtcatccc 1080tcacgcggcg tcgctgcatc aggctttcgc ccattgtgca atattcccca ctgctgcctc 1140ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggccg gtcaccctct caggtcggct 1200acccgtcgtc gccttggtag gccattaccc caccaacaag ctgataggcc gcgggcccat 1260cctgcaccga taaatctttc caccacccac catgcgatag gaggtcatat ccggtattag 1320acccagtttc ccaggcttat cccgaagtgc agggcagatc acccacgtgt tactcacccg 1380ttcgccgctc gtgtaccccg aaaggcctta ccgctcgact tgcatgtgta agca143权利要求
一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法，所述方法包括在以2-氯-3-氰基吡啶为底物、以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)经发酵培养获得的腈转化酶为催化剂、以水或磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于pH7～9、25～60℃下进行催化水解反应，制得所述2-氯烟酸。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述腈转化酶来自红平红球菌CCTCCNO :M 209194经发酵培养获得的含酶细胞，所述反应体系中含酶细胞浓度以含酶细胞湿重计为 10 20g/l。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述反应体系中，底物2-氯-3-氰基吡啶初 始浓度为1.0 5. Og/1。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含酶细胞由如下方法制备得到将红平 红球菌接种至适用于红平红球菌的发酵培养基中，在温度25 30°C、起始pH 6. 5 7. 0、 摇床转速100 300rpm的条件下震荡培养48 72h，离心分离，得到所述含酶细胞。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述适用于红平红球菌的发酵培养基终浓 度组成如下麦芽糖5.0 15. 0g/l，酵母粉7.0 18. 0g/l，己内酰胺4.0 8. 0g/l, MgS04 7H20 0. 1 0. 5g/l，K2HP04 3H20 0. 1 0. 5g/l,KH2P04 0. 1 0. 5g/l，FeS04 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6. 5 7. 0。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下(1)红平红球菌CCTCCNO :M 209194接种至种子培养基，25 30°C培养16 20h， 得到种子液；所述种子培养基终浓度组成如下葡萄糖10. 0 20. 0g/l，蛋白胨5. 0 10. 0g/l,己内酰胺 4. 0 8. 0g/l, MgS04 7H20 0. 2 0. 5g/l, K2HP04 3H20 0. 2 0. 5g/ 1，KH2P040. 2 0. 5g/l, FeS04 7H20 0. 01 0. 02g/l，溶剂为水，pH 值 6. 5 7. 0。(2)步骤(1)种子液以3 10%体积比接种至发酵培养基，在25 30°C、初始pH6.5 7. 0条件下震荡培养48 72h，离心分离，得到菌体含酶细胞；所述发酵培养基终浓度组成 如下麦芽糖5. 0 15. 0g/l，酵母粉7. 0 18. 0g/l，己内酰胺4. 0 8. 0g/l，MgS04 '7H200.1 0. 5g/l，K2HP04.3H20 0. 1 0. 5g/l，KH2P04 0. 1 0. 5g/l，FeS04 7H200. 01 0. 02g/ 1，溶剂为水，pH值6. 5 7.0。(3)将步骤(2)菌体含酶细胞添加至含有2-氯-3-氰基吡啶的反应体系中，所述反应 体系中菌体含酶细胞以含酶细胞湿重计浓度为10 20g/l，2-氯-3-氰基吡啶初始浓度为1.0 5. 0g/l，于pH7. 0 9. 0,25 60°C下进行催化水解反应10 12h，制得所述2-氯 烟酸。
7.红平红球菌(Rhodococcuserythropolis)ZJB-09149，保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址中国武汉武汉大学，430072，保藏日期2009年9月4日，保藏编号CCTCC NO M 209194。
全文摘要
本发明提供了一种生物催化2-氯-3-氰基吡啶生产2-氯烟酸的方法及其菌株，所述方法包括在以2-氯-3-氰基吡啶为底物、以红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)经发酵培养获得的腈转化酶为催化剂、以水或磷酸盐缓冲液为溶剂的反应体系中，于pH7.0～9.0、25～60℃下进行催化水解反应，制得所述2-氯烟酸。本发明的有益效果主要体现在(1)本发明从微生物群中筛选得到可生物催化生产2-氯烟酸的红平红球菌CCTCC NOM 209194，其在适合条件下，能有效生产2-氯烟酸；(2)本发明将红平红球菌菌株ZJB-09149用于生物催化生产2-氯烟酸实验，结果表明，该菌可有效生物催化生产2-氯烟酸，12h内2-氯-3-氰基吡啶转化率达到60～100％，因此该菌在生物催化生产2-氯烟酸的领域中具有广泛的应用前景。
文档编号C12N1/20GK101857889SQ20091015489
公开日2010年10月13日 申请日期2009年11月26日 优先权日2009年11月26日
发明者李亚飞, 沈寅初, 郑裕国, 金利群 申请人:浙江工业大学