专利名称：：酿酒酵母及在微生物转化制备(R)-(+)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株新菌株-酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.3361，及其在微生物转化制备(R)_(+)_13_羟基苯丙酸乙酯中的应用。(二)
背景技术：
：(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酉旨(Benze卿ropanoicacid，P-hydroxy,ethylester，(PR)_)，分子式CnH1403，分子量194.23，CAS号72656-47-4。(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯是合成(R)-托莫西汀的重要中间体。托莫西汀是一种抑制去甲肾上腺素吸收的抑制剂。托莫西汀与去甲肾上腺素吸收位有高度的亲和性。可以维持神经系统的去甲肾上腺素的浓度达到一定的水平，可以提高人的忍耐力，抗抑郁。(R)-托莫西汀的药效是消旋体托莫西汀药效的2倍，是(S)-托莫西汀药效的9倍。(R)-(+)-13-羟基苯丙酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法两种。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原P-羰基苯丙酸乙酯可以获得(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯。采用化学法不对称还原e-羰基苯丙酸乙酯需要在手性催化剂的催化下才能完成，化学还原过程中手性催化剂价格昂贵、制备过程繁琐。采用含有羰基还原酶的微生物细胞不对称还原13-羰基苯丙酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低廉的特点，又被称为手性化合物的绿色合成技术。采用微生物转化法还原e-羰基苯丙酸乙酯制备(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯未见专利报道，只有少数公开发表的文章报道如下2008年，中国科研工作者JinCui等利用面包酵母转化P-羰基苯丙酸乙酯制备(R)-(+)-l3-羟基苯丙酸乙酯。得到产物的对映体过剩值为75%，产率30%。从目前微生物法合成(R)-(+)-13-羟基苯丙酸乙酯的报道和研究来看，产物的产率及对映体选择性均不理想，需要找到一种催化效率更高的菌株，并选择适当的反应条件，最大限度地提高产物的产率及对映体过剩值。(三)
发明内容本发明的目的是提供一种可供生物转化P-羰基苯丙酸乙酯为(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯的微生物新菌种酿酒酵母，以及利用该菌株转化e-羰基苯丙酸乙酯合成(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯的方法。本发明采用的技术方案是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.3361，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期2009年10月23日，保藏编号CGMCCNo.3361。菌株来源本发明中所述的微生物菌株酿酒酵母CGMCCNo.3361是从杭州市西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌株用于转化P-羰基苯丙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCCNo.3361具有良好的转化P-羰基苯丙酸乙酯生产(R)_(+)_P_羟基苯丙酸乙酯的能力。所述酿酒酵母CGMCCNo.3361的菌落特征在琼脂培养基上呈现出乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态。本发明还涉及所述的酿酒酵母CGMCCNo.3361在P_羰基苯丙酸乙酯微生物转化制备(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯中的应用。具体的，所述应用为以e-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母CGMCCNo.3361发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在磷酸盐缓冲液中，于2545t:转化反应840小时，转化液经分离纯化得到产物(R)_(+)_13_羟基苯丙酸乙酯。底物13-羰基苯丙酸乙酯在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为3.629.0mmol/L。为提高转化率，所述磷酸盐缓冲液中还可添加50150g/L葡萄糖作为辅助底物。所述含酶菌体细胞用量为350g/mmo1底物(以菌体细胞干重计)。所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo.3361接种到斜面培养基，2635"培养46天得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，琼脂1525g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，2635°C，摇床转速为150200r/min，培养1826h得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgS040.20.4g/L，K2HP043H200.51.5g/L，KH2P040.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水;(3)发酵培养取种子液，以体积比1020%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为2635t:，摇床转速为150200r/min，培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgS040.20.4g/L，K2HP04*3H200.51.5g/L，KH2P040.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水。所述分离纯化方法如下将转化液离心分离菌体细胞，取清液煮沸弃去沉淀后用正己烷萃取，萃取液蒸发回收溶剂后用硅胶柱层析分离，得产物(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯。得到的(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯纯品用气相色谱-质谱联用仪进行检测确定产物的纯度和分子量。摩尔转化率和产物(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值(ee%)采用安捷伦1200液相色谱仪分析检测。色谱柱为手性柱，型号为DaicelOB-H;流动相为正己烷/异丙醇(80/20);紫外检测波长为254nm。手性柱可以检测到(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯和(s)-(-)-e-羟基苯丙酸乙酯两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值(ee%)。本发明中采用微生物细胞不对称还原e-羰基苯丙酸乙酯来制备(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯，可以获得高对映体过剩值、高摩尔转化率，重要的是，反应中伴有辅酶再生过程有利于提高转化率。本发明采用的微生物转化法制备(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯与化学合成法、酶催化法相比具有以下优点①生物催化剂为微生物菌体，比化学催化剂成本低廉；②环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化；③生产所用的菌株安全无毒；不受季节影响，易于实现大规模工业化生产；⑤生产操作简便，生物转化率较高；⑥整个反应过程中不需要添加辅酶。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，121。C灭菌20min。分别用lmol/LNaOH或lmol/LHCl调整液体培养基的pH值为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于3(TC、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以体积比10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液，将发酵液于4500r/min离心20min，所得菌体用于微生物转化。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体9g(干重)，加入0.36mmo1P_羰基苯丙酸乙酯作为底物，置于30°C，200r/min的摇床中反应24h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表1:培养基初始pH值对酿酒酵母CGMCCNo.3361转化P-羰基苯丙酸乙酯的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>培养基的初始pH值转化率(％)(R)-(+)-P-羟基苯丙酸乙酯的对映体过剩值(ee%)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，12rC灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体9g(干重)，加入|3-羰基苯丙酸乙酯0.36mmol作为底物，其浓度为3.6mmol/L，加入辅助底物葡萄糖，使其浓度分别为10g/L、30g/L、50g/L、70g/L、100g/L、150g/L，置于30°C，200r/min的摇床中反应24h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表2:添加葡萄糖对(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯转化率及对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，12rC灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体9g(干重)，加入|3-羰基苯丙酸乙酯0.36mmol作为底物，其浓度为3.6mmol/L，加入辅助底物葡萄糖，使其浓度为10%，在200r/min的摇床中分别于25°C、30°C、35°C、40°C、45°C下反应24h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表3:反应温度对(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯转化率及对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例4:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，12rC灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体9g(干重)，加入|3-羰基苯丙酸乙酯0.36mmol作为底物，其浓度为3.6mmol/L，加入辅助底物葡萄糖，使其浓度为100g/L，置于30。C，200r/min的摇床中分别反应8h、16h、24h、32h、40h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表4:反应时间对(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯转化率及对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例5:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，12rC灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中加入上述所得菌体9g(干重)，使其浓度为90g/L(干重/反应体积)，加入13_羰基苯丙酸乙酯的浓度分别为3.6mmol/L、7.3mmol/L、14.5mmol/L、21.8mmol/L、29.Ommol/L，加入辅助底物葡萄糖，使其浓度为10%，置于3(TC，200r/min的摇床中分别反应24h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表5:底物初始浓度对(R)_(+)_13_羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例6:斜面培养将CGMCCNo.3361菌种接种至斜面培养基，3(TC培养46天。所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH值，溶剂为水；12rC灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面。种子培养和发酵种子和发酵培养基均采用液体培养基，按如下组成配制葡萄糖30g/L，酵母粉3g/L，硫酸铵5g/L，无水MgS040.25g/L，K2HP043H20lg/L，KH2P04lg/L，12rC灭菌20min。调整液体培养基的pH值为7.0。用接种针从斜面培养基中取一环菌体接种在含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得种子。将种子液以10%的接种量接种于含有100ml液体培养基的250ml三角瓶中，于30°C、180r/min的条件下培养24h获得发酵液。在含有100mlpH7.0磷酸盐缓冲液的三角瓶中分别加入上述所得菌体9g、17.2g、25.8g、34.4g、43.Og(干重)，使其浓度分别为90g/L、172g/L、258g/L、344g/L、430g/L(干重/反应体积)，加入P-羰基苯丙酸乙酯的浓度分别为21.8mmol/L，加入辅助底物葡萄糖，使其浓度为100g/L，置于3(TC，200r/min的摇床中反应24h。反应结束后，离心弃去菌体，上清液煮沸弃去沉淀后用等体积正己烷萃取3次，液相色谱分析其摩尔转化率及对映体过剩值。表6:菌体量对(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯转化率及对映体过剩值的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNo.3361，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期2009年10月23日，保藏编号CGMCCNo.3361。2.如权利要求l所述的酿酒酵母CGMCCNo.3361在P-羰基苯丙酸乙酯微生物转化制备(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为以e-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母CGMCCNo.3361发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，在磷酸盐缓冲液中，于2545t:转化反应840小时，转化液经分离纯化得到产物(R)-(+)-P_羟基苯丙酸乙酯。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于底物e-羰基苯丙酸乙酯在磷酸盐缓冲液中的初始浓度为3.629.0mmol/L。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述磷酸盐缓冲液中还添加有50150g/L葡萄糖作为辅助底物。6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞用量为350g/mmo1底物。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含酶菌体细胞由如下方法制备得到(1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo.3361接种到斜面培养基，2635。C培养46天得菌体斜面；所述的斜面培养基按如下组成配制麦芽汁515g/L，酵母粉24g/L，蛋白胨46g/L，葡萄糖712g/L，琼脂1525g/L，自然pH值，溶剂为水;121。C灭菌20min，灭菌后冷却制成斜面；(2)种子培养从斜面培养基取一环菌体转接到种子培养基，2635t:，摇床转速为150200r/min，培养1826h得种子液；所述的种子培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgS040.20.4g/L，K2HP043H200.51.5g/L，KH2P040.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水；(3)发酵培养取种子液，以体积比1020%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为2635t:，摇床转速为150200r/min，培养1830h得到含有含酶菌体细胞的发酵液；所述发酵培养基按如下组成配制葡萄糖2632g/L，酵母粉24g/L，硫酸铵36g/L，无水MgS040.20.4g/L，K2HP043H200.51.5g/L，KH2P040.61.5g/L，自然pH值，溶剂为水。8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化方法如下将转化液离心分离菌体细胞，取清液煮沸弃去沉淀后用正己烷萃取，萃取液蒸发回收溶剂后用硅胶柱层析分离，得产物(R)-(+)-e-羟基苯丙酸乙酯。全文摘要本发明提供了一株新菌株——酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)CGMCCNO.3361，及其在微生物转化制备(R)-(+)-β-羟基苯丙酸乙酯中的应用。所述酿酒酵母保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，100101，保藏日期2009年10月23日，保藏编号CGMCCNO.3361。本发明微生物转化法制备(R)-(+)-β-羟基苯丙酸乙酯的有益效果主要体现在①生物催化剂为微生物菌体，比化学催化剂成本低廉；②环境友好，反应条件温和，常温常压下即可顺利进行转化；③生产所用的菌株安全无毒；④不受季节影响，易于实现大规模工业化生产；⑤生产操作简便，生物转化率较高；⑥整个反应过程中不需要添加辅酶。文档编号C12R1/865GK101709271SQ20091015477公开日2010年5月19日申请日期2009年12月7日优先权日2009年12月7日发明者应国清,欧志敏,陈晓彦申请人:浙江工业大学