专利名称：黑翅土白蚁内切-β-1,4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。 背景技术：
木质纤维素类物质是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作 用产生的主要干物质。据估计，全世界绿色植物每年光合作用产生的干物质达1730亿吨， 所合能量为2Χ1021焦耳，相当于全世界每年消耗能量的10倍(李忠仁，生物能源的开发和 利用，延边大学农学学报，2003，25 (3) 225 227)。纤维素的酶降解需要纤维素酶的参与，纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若 干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系统。一般来说，纤维素酶主要由三类组成(1)内 切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo—^-l,4-glucanase, EC 3. 2. 1. 4)，主要作用于纤维素分子 内部的非结晶区，随机水解β _1，4糖苷键，将长链纤维素分子链截短，产生大量带有非还 原性末端的小分子纤维素和可溶性纤维寡聚糖；(2)外切-β_1，4-葡聚糖酶(Εχο-β-1， 4-glucanase, EC 3.2. 1. 91)，主要作用于纤维素分子链的非还原末端，水解β_1，4糖苷 键，产生纤维二糖；(3) β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC 3. 2. 1.21)，水解上述两种酶 产生的纤维二糖和其他低聚糖，生成葡萄糖(Coughlin M P，Ljungdahl J G. Comparative biochemistry of fungal and bacterial eellulolyticenzyme systems. In Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. New York Academic,1988,11-30 ；Goyal A, et al. Characteristics of fungalcellulases. Bioresource Technology, 1991, 36(1) 37-50;王兰芬.纤维素酶的作用机理及开发应用.酿酒科技，1997,6:16-17;严岩，张全 福.纤维素酶的性质、应用及其环境意义.农业环境与发展，1997，1 :17-20)。随着全球人类的增长和多数国家的工业化发展，能源的消耗在急剧增加，能源危 机日益严重，因此寻找新的石油替代品一直是众多科技工作者关注的问题。近年来，燃料乙 醇作为石油能源的替代物，逐渐成为世界各国研究的热点。在美国，乙醇已被广泛应用在汽 车燃料中取代部分石油，它们在石油燃料中加入部分乙醇，以减少石油的使用。这样既可以 减少环境污染，又可以节省能源，减少成本。目前，美国等国家在混合燃料中所使用的大量 乙醇都是由谷物发酵而产生的，这样成本较高，并且还会消耗掉大量的粮食。我国是一个 农业大国，农林生产中所产生的生物质种类多，产量巨大，较常见的有枝桠材、稻壳、植物秸 秆、玉米芯、锯末、碎木块、甘蔗渣、薪柴、禽畜粪便和城市垃圾等，是仅次于煤炭、石油和天 然气的第四位能源。然而，每年用于工业过程或燃烧的木质纤维素仅占所产生木质纤维素 的2% (李忠仁.生物能源的开发和利用.延边大学农学学报，2003，25 (3) :225_227 ；王超， 章超桦.酶解纤维素类物质生产燃料酒精的研究进展.纤维素科学与技术，2003，11 (4) 52-59)。如果用高活性的木质纤维素酶将这些木质纤维素降解产生还原糖，再进一步发酵 生产乙醇，这样既可以降低制造成本，还可以变废为宝，为燃料和能源工业服务。自然界中，纤维素酶广泛存在于细菌、真菌、软体动物、原生动物、甲壳动物和一些昆虫如蟑螂、天牛、白蚁等的体内。其中，人们对细菌、真菌体内的纤维素酶研究得最多，而 对昆虫体内的纤维素酶则研究得较少。目前有关昆虫体内纤维素酶的研究主要集中在天牛 和白蚁的一些种类上。白蚁是一类以木质纤维素为主要食源的古老生物，在地球物理循环和能量流动 中起着十分重要的作用。在长期的进化过程中，白蚁为了适应纤维素类食物的消化，体 内形成了非常高效的降解纤维素的纤维素酶系统。近几十年的研究结果表明，白蚁体内 的纤维素酶主要由内切_0 -1，4-葡聚糖酶和0 -葡糖苷酶组成，在一定条件下，这两种 酶也具有外切-0-l，4-葡聚糖酶活性。在澳白蚁科、草白蚁科、木白蚁科、鼻白蚁科和 齿白蚁科白蚁体内，纤维素的消化由白蚁自身分泌的纤维素酶和体内共生生物分泌的纤 维素酶协同完成；在白蚁科白蚁体内，纤维素的消化则主要依赖头部唾液腺或中肠上皮 细胞分泌的内源性纤维素酶(Martin M M. The evolution ofcellulose digestion in insects. Philosophical Transactions of the Royal Societyof London B:Biological Sciences. 1991,333(1267) :281_288 ；李捃，等.低等白蚁肠道内原生动物的分布及其进 化学意义.白蚁科技，1999，16(2) 1-7 ；Nakashima K, ffatanabe H, Saitoh H et al. Dual cellulose-digesting system ofthe wood-feeding termite, Coptotermes formosanus Shiraki. InsectBiochemistry and Molecular Biology, 2002, 32 :777_784)。在当前利用纤维素酶降解纤维素的生产工艺中，最困扰人们的是如何提高纤维素 酶的酶解效率和降低纤维素酶的生产成本(王景林.纤维素酶固定化的研究进展.生命科 学.1997，9(3) :116-118，135)。从自然界中寻找高活性的纤维素酶和利用分子生物学技术 改造纤维素酶基因，进而开发活性高、热稳定性好、底物范围广、耐酒精能力强的纤维素酶 生物工程菌，是解决这一问题的有效途径。
发明内容
本发明目的是提供一种黑翅土白蚁内切-0-1，4_葡聚糖酶、编码基因、载体及应用。本发明采用的技术方案是一种内切-0-1，4-葡聚糖酶，含有与5￡0 ID No. 3所示多肽同源性95%以上的氨
基酸序列。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有与SEQ ID NO. 3所示氨基酸序列的肽蛋白同 源性在95%以上的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，均属于本发明 保护范围之列。具体的改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变 体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替 换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。或者，所述的内切-3-l，4-葡聚糖酶，具有与SEQ ID No. 2所示多肽同源性95% 以上的氨基酸序列。在本发明中，术语“内切-3 -1，4-葡聚糖酶”、“黑翅土白蚁内切_ 3 -1，4-葡聚糖 酶”或“酶OfEG”都可互换使用，该术语包括含有信号肽的多肽以及不含信号肽的成熟的内 切-3-l，4-葡聚糖酶。在本发明中，术语“内切-3 -1，4-葡聚糖酶”指具有内切-3 -1，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No. 2的全长序列(第1-448位)或成熟序列(第17-448位，即SEQ ID No. 3) 的多肽。该术语还包括具有内切-0-l，4-葡聚糖酶活性的SEQ ID No.2序列的变异形式。 这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端 和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行 取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基 酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括内切-0-l，4-葡聚糖酶的活性片段和衍 生物。该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或 低的严谨度条件下能与内切-0-1，4-葡聚糖酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提 供了其他多肽，如包含内切-0-l，4-葡聚糖酶或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽 外，本发明还包括了内切-日-1，4-葡聚糖酶的可溶性片段。通常，该片段具有内切-3-1， 4-葡聚糖酶序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约 50个连续氨基酸，最佳地约70个连续氨基酸。发明还提供内切-0-1，4_葡聚糖酶或多肽的类似物，这些类似物与天然内 切-1，4-葡聚糖酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形 式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通 过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其 他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸) 的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如0、Y氨基酸)的类似物。应理解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙 酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进 行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动 物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨 酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化 了溶解性能的多肽。本发明所述内切-0-1，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 2中第1 448位或第17 448位(即SEQ ID No. 3)氨基酸残基序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或 其活性衍生物。优选的，所述的内切-3-l，4-葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。或 者将SEQ ID No. 2氨基酸残基序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成 的，且具有内切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。优选的，所述的内切-0-1，4_葡聚糖酶，具有SEQ ID No. 3所示的氨基酸序列。将 SEQ ID No. 3氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且 具有内切-1，4-葡聚糖酶活性的多肽。本发明还涉及一种编码所述内切-1，4_葡聚糖酶的基因。该核苷酸序列与选 自下组的一种核苷酸序列有至少70%相同性(a)具有SEQ ID No. 1中第1 1726位的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID No. 1中第152 1498位(即SEQ ID NO. 4)的核苷酸序列；
(c)具有SEQ ID No. 1中第200 1498位(即SEQ ID NO. 5)的核苷酸序列(d)编码具有SEQ ID No. 2中第1 448位或第17 448位(即SEQ IDN0. 3)氨 基酸残基序列的多核苷酸；(e)在高严谨条件下可与SEQ ID No. 1限定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。由于核苷酸序列的特殊性，任何前述多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有 70%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。在本发明中，术语“编码内切-0-1，4_葡聚糖酶的多核苷酸”指编码具有内 切-0-1，4-葡聚糖酶活性的多肽的核苷酸序列，如3￡0 ID No. 1中第152 1498位核苷酸 序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No. 1序列的编码框第152 1498位核苷 酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于 密码子的简并性，所以与SEQ ID No. 1中第152 1498位核苷酸序列同源性低至约70%。 简并序列也能编码出SEQ ID No. 2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳 地在高度严紧条件下，与SEQ ID No. 1中从核苷酸第152 1498位的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No. 1中从核苷酸第152 1498位的核苷酸序列的同 源性至少70 %，较佳地至少80 %，更佳地至少90 %的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与内切-1，4_葡聚糖酶相同功能的蛋白的SEQ ID No. 2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入或取 代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。本发明还包括内切-0-1，4_葡聚糖酶多肽编码序列及其片段的反义序列，这种 反义序列可用于抑制细胞内内切-0-l，4-葡聚糖酶的表达。优选的，所述基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。或者，所述基因具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。本发明还涉及一种含有所述基因的重组载体。以及利用所述重组载体转化、转导 或转染得到的宿主细胞。本发明中，编码内切-0-1，4_葡聚糖酶的核苷酸序列可插入到载体中，以构成含 有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、 植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载 体还包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的 pcDNA3. 1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复 制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选PET载体系列以及其它原 核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译 调控元件。术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大 肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳 地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CH0细胞、COS细胞等。本发明还涉及所述的基因在制备内切-0-1，4_葡聚糖酶中的应用。具体方法包 含(a)在适合表达该内切-0_1，4-葡聚糖酶的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细 胞；(b)从培养物中分离出该内切-0-l，4_葡聚糖酶。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁内切-0-1，4_葡聚糖酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该内切-0-l，4_葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发 明的内切-0-1，4-葡聚糖酶的酶活达1901本发明所提供的内切-0-1，4_葡聚糖酶及其 编码基因可应用于纤维素的降解。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此实施例1 黑翅土白蚁内切-1，4_葡聚糖酶基因(OfEG)的克隆1.基因克隆于冰浴条件下解剖黑翅土白蚁(取自浙江杭州)的唾液腺，并将获得的腺 体迅速至于Trizoldnvitrogen)溶液中，迅速抽提其总RNA，并以oligo(dT)18为 引物反转录生成cDNA。以反转录的cDNA为模板，用一对特异性引物(Primer 1
-aggaaggattccgcccttaacga-3‘,Primer2 -ccgtcacccaatgcgt aatcga-3')进行 PCR 扩增，将扩增到的片段进行T载体(Promega)克隆，并对其进行序列测定(Invitrogen)。根据测序得到的结果设计特异性引物(Primer 3 5，-tgtcgacccctcttattccaacga-3，，Primer 4 :5，-gtagtaactgttggcgtcggtga-3，)，分别 用于扩增编码OfEG全长cDNA的3’及5’端。以总RNA为模板，利用3’及5’ RACE试剂盒 (Takara-Clontech)，参照试剂盒说明书，分别扩增该基因的3’端及5’端序列。分别对扩 增到的片段进行T载体(Promega)克隆，并对其进行序列测定(Invitrogen)。将测序获得 的序列用软件进行序列拼接，最终获得全长cDNA。2.序列比对利用DNAStar软件对编码OfEG的全长cDNA序列进行相关分析，发现该序列长 1726bp(SEQ ID No. 1)，GC 含量为 50. 0%。其中开放阅读框(open reading frame, 0RF)为 1347bp(SEQ ID NO. 4)，编码 448 个推导氨基酸残基(SEQ ID NO. 2)。利用SignalP 3. 0 在线软件(http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)对其 推导氨基酸序列的信号肽序列进行预测分析，发现前16个氨基酸残基为信号肽序列。利用 http://au. expasy. org/网站的在线工具预测该基因编码的蛋白质分子量为48. 9KDa，等 电点为5. 25。使用在线SMART工具(http//smart, embl-heidelberg. de/)预测蛋白质的 功能结构域，发现该蛋白含有一个典型的Glyco hydro 9结构域。将该基因的0RF阅读框所包含的cDNA序列于NCBI数据库中进行BLASTn比对分 析，结果显示其与多种昆虫的内切0 -1,4-葡聚糖酶基因高度同源。实施例2 黑翅土白蚁内切-1，4_葡聚糖酶基因(OfEG)在大肠杆菌中的表达将得到的黑翅土白蚁内切-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因编码区 (SEQID N0. 4)，经Sac I和Hind III双酶切后，连接入同样酶切的大肠杆菌表达 质粒pET-28a(NOVagen)中，转化大肠杆菌DH5a，经测序鉴定正确后得到表达质粒 pET-28a-0fEG。将质粒转化至大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆，并对其进行诱导表达。将含有pET-28a-0fEG的表达菌株接种于LB培养液中，37°C培养过夜，按1 100 接种到大体积LB液体培养基中，37°C培养至0D值0. 6，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，28°C 诱导4小时。将诱导培养物离心收集菌体，用20mM Tris-HCl pH8. 0 50mM NaCl 0. 5mM EDTA洗菌体两遍，重悬于 20mM Tris-HCl pH8. 0 50mM NaCl 0. 5mM EDTA 0. 5mM PMSFO. 5mg/ml 溶菌酶中，超声处理裂解细胞，取上清测酶活，没有活性。实施例3 黑翅土白蚁内切-0-1， 4_葡聚糖酶基因(OfEG)在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹夜蛾细胞株)中的表达将得到的黑翅土白蚁内切-1，4-葡聚糖酶(OfEG)的基因编码区 (SEQID NO. 4)，经Not I和Hind III双酶切后，连接入同样酶切的Tn细胞表达载体 pBacFastHTa(Invitrogen)中，转化大肠杆菌DH5 a，经测序鉴定正确后得到表达质粒 pBacFastHTa-OfEG。将质粒转化至大肠杆菌DHlOBac中，筛选阳性克隆，抽提质粒。重组质粒在Lipofectin(GiBco Life)介导下转染Tn细胞，转染48小时后，收集 细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2 3周的TC-100连续 传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，取上清测酶活，酶活大小为190U。实施例4 黑翅土白蚁内切-1，4_葡聚糖酶的酶活测定内切-1，4_葡聚糖酶的酶活测定采用Somogyi-Nelson微量法(Somogyi M，A reagent for the copper-iodometric determination of verysmall amounts of sugar. Journal of Biological Chemistry,1937,117 (2) 771-776 ；Somogyi M, A new reagent for the determination of sugars. Journal of Biological Chemistry,1945,160(1) 61-68 ；Somogyi M, Notes onsugar determination. Journal of Biological Chemistry, 1952,195(1) 19-23；Nelson N, A photometric adaptation of the Somogyi method for thedetermination of glucose. Journal of Biological Chemistry,1951,193 (1) 375-380)，具体操作如下1.试剂配制Somogyi I 将288g无水硫酸钠溶于1L煮沸的蒸馏水中，然后再依次加入24g酒 石酸钾钠晶体，48g碳酸钠，32g碳酸氢钠，溶解后用蒸馏水稀释至1.6L，27°C保存。Somogyi II 将72g无水硫酸钠溶于300ml煮沸的蒸馏水中，然后再加入8g硫酸 铜，用煮沸的蒸馏水稀释至400ml，在27 °C保存。Nelson Reagent 将100g钼酸铵溶解在1. 8L蒸馏水中，然后加入84ml浓硫酸，再 加入100ml砷酸钠溶液(12g砷酸钠溶解在100ml蒸馏水中)，然后溶液保存在棕色瓶中并 在37°C下储存24 48h，最后保存在室温下。2.葡萄糖标准曲线的制作在8支试管中分别装入200ii g/ml标准葡萄糖0、0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 2、 1. 4ml。再依次加入蒸馏水2. 0,1. 8,1. 6,1. 4,1. 2,1. 0,0. 8,0. 6ml，配成每毫升含0、 20、40、60、80、100、120、140ii g的葡萄糖溶液。每试管中加入铜试剂2ml (Somogyi I 1. 6ml, Somogyi II 40ml)，混勻后沸水浴中加热15min,立即冷却，再加入2ml砷钼酸试 剂(NelsonReagent)，振荡两分钟后用分光光度计在520nm下测定吸光值。以葡萄糖含量 (ug/ml)为横坐标，520nm下吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。3.酶活测定以(w/v)的羧甲基纤维素(溶剂为0. 1M醋酸-醋酸钠缓冲液pH5.6)为底 物。取950 ill底物与50 u 1酶液充分混合，在37°C下水浴30min，水解产生的还原糖采用 Somogyi-Nelson微量法进行测定。最后在520nm下测定吸光值。一个酶活力单位定义为每 分钟每克蛋白质所产生还原糖的微摩尔数，表示为U。
gaagacgtta agtactacat cgggggctga agttggggatgttggtaaaa ggagacaaat0102]aaaggaattc gtcctctgca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa￡l￡l￡l￡l￡l￡l0103]<210>20104]<211>4480105]<212>PRT0106]<213>formosan whitetermite0107]<400>20108]MetArg ValPheValCysLeuLeuSerAlaLeuAlaLeuCysGinGly0109]1510150110]AlaTyr AspTyrLysThrValLeuArgAsnSerLeuLeuPheTyrGlu0111]2025300112]AlaGinArgSerGlyLysLeuProAlaAspGinLysValThrTrpArg0113]3540450114]LysAspSerAlaLeuAsnAspLysGlyGinAsnGlyGluAspLeuThr0115]5055600116]GlyGlyTyrTyrAspAlaGly AspTyrValLysPheGlyPheProMet0117]657075800118]AlaSerThrAlaThrValLeuAlaTrpGlyLeuValAspTyrAlaAla0119]8590950120]GlyTyrThrSerAlaGly AlaLeuAspAspGlyArgLysAlaValLys0121]1001051100122]TrpAlaThrAspTyrPheLeuLysAlaHisThrAlaProThrGluLeu0123]1151201250124]TyrGlyGinValGlyLysGlyAspLeuAspHisSerTyrTrpGlyArg0125]1301351400126]ProGluAspMetThrMetSerArgProAlaPheLyslieAspAlaSer0127]1451501551600128]AsnProGlySerAspLeuAlaGlyGluThrAlaAlaAlaLeuAlaAla0129]1651701750130]AlaSerlieValPheLys AlaValAspProSerTyrSerAsnAspLeu0131]1801851900132]LeuThrHisAlaLysGinLeuPheAspPheAlaAsnAsnTyrArgGly0133]1952002050134]LysTyrSerAspSerlieThrAsp AlaAsnSerTyrTyrThrSerTyr0135]2102152200136]AspTyrArgAspGluLeuValTrpAlaAlaAlaTrpLeuTyrArgAla0137]2252302352400138]ThrAsnAsplieThrTyrLeuAsnThrAlaGluSerLeuHisAsnGin0139]245250255
10140]PheGly LeuGinAspTrpAsnGly Gly PheSer TrpAspAlaLysVal0141]2602652700142]SerGly ValGinLeuLeuLeuAla LysLeuThrAsnLysGinGinTyr0143]2752802850144]LysAsp AlalieLys GlyTyrValAspTyrLeulieAsnAlaGinGin0145]2902953000146]LysThr ProLysGlyLeuLeuPhelieAspValTrpGlySerLeuArg0147]3053103153200148]HisAla SerAsnAlaAlaPheVallieLeuGinAlaAlaAspLeuGly0149]3253303350150]lieSer AlaValSerTyr ArgGinPheAlaLysLysGinlieAspTyr0151]3403453500152]AlaLeu GlyAspGlyGlyArgSerLeuValValGlyPheGlyAsnAsn0153]3553603650154]ProPro ThrHisProHisHisAlaSerSerSerCysProAspAlaPro0155]3703753800156]AlaVal CysAspTrpSerThrTyrSerSerProAspProAsnPheHis0157]3853903954000158]ValLeu ThrGlyAlaLeuValGlyGlyProAspValAsnAspAsnTyr0159]4054104150160]ValAsp AspArgAsnAspTyrValGinAsnValValAlaCysAspTyr0161]4204254300162]AsnAla GlyPheGinSerAlaValSerAlaLeuValThrLeuGlyTyr0163]4354404450164]<210>30165]<211>4320166]<212>PRT0167]<213>formosan whitetermite0168]<400>30169]AlaTyr AspTyrLysThrValLeuArg AsnSerLeuLeuPheTyrGlu0170]1510150171]AlaGin ArgSerGlyLysLeuProAlaAspGinLysValThrTrpArg0172]2025300173]LysAsp SerAlaLeuAsnAspLysGlyGinAsnGlyGluAspLeuThr0174]3540450175]GlyGly TyrTyrAspAlaGlyAspTyrValLysPheGlyPheProMet0176]5055600177]AlaSer ThrAlaThrValLeuAlaTrpGlyLeuValAspTyrAlaAla0178]65707580
11
385390395400
Val Asp Asp Arg Asn Asp Tyr Val (jln Asn ValVal Ala Cys Asp Tyr
405410415
Asn Ala Gly Phe Gin Ser Ala Val Ser Ala LeuVal Thr Leu Gly Tyr
420425430
<210>4
<211>1347
<212>DNA
<213>formosan white termite
<400>4
atgagggtcttcgtttgccttctgtctgcgcttgcgctttgccaaggtgcttatgactac60
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gctgatcagaaggtcacgtggaggaaggattccgcccttaacgacaagggacagaacgga180
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aatccagggtcggatctggccggcgagacggccgccgccctcgctgcagcttccattgtg540
ttcaaggctgtcgacccctcttattccaacgatctgctcacacacgccaagcagcttttc600
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<210>5
<211>1299
<212>DNA
<213>formosan white termite
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13
<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>8tgtcgacccc tcttattcca acga 24<210>9<211>23<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>9gtagtaactg ttggcgtcgg tga 2权利要求
一种内切-β-1，4-葡聚糖酶，含有与SEQ ID No.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。
2.如权利要求要求1所述的内切-β_1，4-葡聚糖酶，具有与SEQID Νο.2所示多肽同 源性95%以上的氨基酸序列。
3.如权利要求要求2所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有SEQID Νο.2所示的氨基酸 序列。
4.如权利要求要求1所述的内切-β_1，4-葡聚糖酶，具有SEQID Νο.3所示的氨基酸 序列。
5.一种编码权利要求1所述内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因。
6.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列。
7.如权利要求5所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5 所示的核苷酸序列。
8.一种含有权利要求5 7之一所述基因的重组载体。
9.一种利用权利要求8所述重组载体转化、转导或转染得到的宿主细胞。
10.权利要求5 7之一所述的基因在制备内切-β -1，4-葡聚糖酶中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶，编码基因、载体及应用。所述黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶，含有与SEQ IDNo.3所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。进一步，所述的内切-β-1，4-葡聚糖酶，具有与SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。本发明发现了一种编码黑翅土白蚁内切-β-1，4-葡聚糖酶的基因，该基因可在宿主细胞中大量表达以生产该内切-β-1，4-葡聚糖酶，用于纤维素的降解，实验证明本发明的内切-β-1，4-葡聚糖酶的酶活达190U。本发明所提供的内切-β-1，4-葡聚糖酶及其编码基因可应用于纤维素的降解。
文档编号C12N15/63GK101864405SQ200910155260
公开日2010年10月20日 申请日期2009年12月10日 优先权日2009年12月10日
发明者莫建初, 陈春润 申请人:浙江大学