专利名称：一种细胞长期培养保存三维系统及相关的细胞长期培养保存方法
技术领域：
本发明涉及生物学技术领域，特别涉及细胞培养保存方法技术领域，具体是指一种细胞 长期培养保存三维系统及相关的细胞长期培养保存方法。
背景技术：
目前主要用液氮长期保存细胞，其操作过程主要是常规消化收集细胞后，用冻存液悬浮 细胞后密封，在冻存管上标明细胞信息，之后进入程序性降温过程，即细胞先后经历4°C、 -20°C、 -80°C、液氮。降温过程操作繁瑣，耗时较长，且降温过程中细胞的损伤较大，易造 成细胞破裂死亡。细胞复苏培养时，先后经历37。C水浴融解，之后离心或直接接种于培养皿 培养。
常规的细胞保种方法要经历繁瑣的细胞冻存及复苏培养，整个过程操作繁瑣，历时较长， 人力及物力成本高，用此种方法得到的细胞经常出现细胞密度小，细胞活力低，要经过2-3 天的适应性培养才能用于实验研究。
由于常规细胞保存方法存在上述缺陷，因此，需要一种新的细胞保存方法，其细胞保存 操作简^_、成本低、细^>活力高、可立即使用，^v而可以大大加快试-睑研究或工业化生产的 进展。
发明内容
本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种细胞长期培养保存三维系统及 相关的细胞长期培养保存方法，该细胞长期培养保存三维系统设计巧妙、结构简单，相关的 细胞长期培养保存方法操作简便、成本低、细胞活力高、可立即使用，从而可以大大加快试 验研究或工业化生产的进展，适于大规模推广应用。
为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种细胞长期培养保存三维系统，其 特点是，包括三维支架和液体培养基或维持培养液，所述三维支架浸泡在所述液体培养基或 所述维持培养液中，所述三维支架为生物相容性材料制成，其上分布有许多孔洞，所述孔洞 大于所要培养的细胞。
本发明具体使用的三维支架为圆柱形，当然也可以为其它形状，有多种规格可以放置在%孔及12孔细胞培养板中。本发明具体使用的三维支架是由细小的纤維、间隙和孔洞组成， 氧气、激素和营养成分得以通过，而废物可以从里面过滤出来。本发明具体使用的三维支架 生物相容性好，并且彻底解决了孔联通性不好、孔不均一等技术难题，能很好地支持细胞的增殖。
较佳地，所迷三维支架为可降解支架或不可降解支架。 较佳地，所述孔洞的孔径为200pm-500pm。
现成的三维支架材料是生物医学领域组织工程中所指的生物材料，它是种子细胞形成组 织之前赖以生存和依附的三维支架，它能将细胞固定于一定的位置，为其生长，繁殖，新陈 代谢及细胞外基质分泌等生理活动提供场所，三维支架各孔间的连通性可以保证培养液与细 胞的充分接触，有利于细胞与培养液的物质交换，并引导再生组织形成基本形状，因此具有 良好的生物相容性。本发明中使用的三维支架可以为细胞生长提供空间，它包括可降解和非 可降解三维支架。利用三维支架培养原代细胞或干细胞用于组织工程，可以选择可降解三維 支架。利用三维支架培养癌细胞或工程细胞用于普通实验研究或工业化生产可以选择非可降 解三维支架。
在本发明的第二方面，提供了一种细胞长期培养保存方法，其特点是，采用上述的细胞 长期培养保存三维系统，用所述三维支架将所述细胞在所述液体培养基中进行培养并传代； 或，用所述三维支架将所述细胞在所述维持培养液中进行维持培养。
较佳地，所述细胞是人肝癌细胞HepG2、中国仓鼠卯巢细胞CHO、原代人脐静脉内皮细 胞HUVEC或人羊水间充干细胞；相应的，所述液体培养基是高糖DMEM培养基、无血清培 养基；ECM培养基或MEM-a培养基；所述维持培养基是低血清浓度的高糖DMEM培养基， 低营养添加剂的无血清培养基，低血清浓度的ECM培养基或MEM-a培养基。
较佳地，所述培养是将所述三维支架在所述液体培养基中进行浸泡，然后将所述细胞接 种于所述三维支架，接着37。C恒温振荡，然后再放入C02培养箱37。C常规培养。
更佳地，所述浸泡在37。C的C02培养箱内进行2小时；所述细胞接种的密度为 2xl05cells/ml;所述恒温振荡采用的转速为200转/分钟，使用的时间为4小时。
较佳地，所述传代是将所述液体培养基吸出，用磷酸盐緩冲液冲洗细胞后，用胰蛋白酶 部分消化所述三维支架上粘附的所述细胞，消化完毕，所述三维支架用新的磷酸盐緩冲液冲 洗后放入新的培养皿内，添加新鲜液体培养基继续培养。
更佳地，所述胰蛋白酶为0.05%的含EDTA的胰蛋白酶。
更佳地，在所述传代步骤的最后，用所述维持培养液代替所述新鲜液体培养基从而维持
4培养所述三维支架上粘附的所述细胞。
本发明的细胞长期培养保存三维系统可以用于人肝癌细胞，中国仓鼠卵巢细胞，人脐静 脉内皮细胞及羊水间充干细胞的培养和保存，也可以用于组织工程，还可以用于实验研究及 制备生物制剂。利用本发明按上述方法可以培养出大量形态典型，活力高的人肝癌细胞用于 实验研究。按照上述方法培养干细胞可以诱导出多种人造组织，为组织工程提供原材料。同 样按照上述方法培养CHO等工程细胞，可以提取更多的细胞产物。
本发明的有益效果具体如下
1. 本发明釆用细胞长期培养保存三维系统长期培养保存细胞，设计巧妙，操作筒便、 成本低、细胞活力高、可立即使用，从而可以大大加快试验研究或工业化生产的进 展，适于大规模推广应用；
2. 本发明的细胞长期培养保存三维系统采用的三维支架可以在相对固定的空间内给细 胞提供更广阔的生长空间，且为细胞提供三维支持作用，细胞能够在支架材料上呈 三维立体生长，细胞不仅形态典型，密度大，且生物活性或蛋白表达量强；
3. 本发明的细胞长期培养保存三维系统采用的三维支架的各孔的连通性保证了培养液 可以均匀地为细胞提供营养物质和氧气，提高营养物与氧气之间的供应距离，使细 胞得到的营养物质和氧气更加丰富；
4. 本发明利用细胞长期培养保存三维系统培养细胞，可以降低培养成本。与平面培养 相比，在同规格培养容器内，使用同样的培养液可以收获更多量的细胞；
5. 本发明利用细胞长期培养保存三维系统培养原代细胞及干细胞，可以更好地保持细 胞的原始状态，不分化；
6. 本发明使用细胞长期培养保存三维系统长期保存细胞，可以减少常规细胞冻存复苏 的繁瑣程序，避免细胞反复冻存复苏给细胞造成的伤害，同时缩短细胞准备周期， 为实验研究尤其是大规模生产节约宝贵的时间。从三维支架上消化下来的细胞可以 直接用于实验研究或大规模生产，不需要经过常规冻存复苏程序中细胞适应性培养；
7. 本发明利用细胞长期培养保存三维系统长期培养并保存细胞，短期内不使用细胞时 可以用维持培养液长期维持细胞存活状态。
图1是本发明的细胞长期培养保存三维系统的一具体实施例的三维支架的局部示意图； 图2是采用图1所示的三维支架接种人肝癌细胞HepG2细胞的局部示意5图3是采用图1所示的三维支架培养人肝癌细胞HepG2细胞的局部示意图； 图4是平面培养人肝癌细胞H印G2细胞的局部示意图。
具体实施例方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
实施例1长期培养保存人肝癌细胞H印G2
1. 将三维支架(3D Biotek公司的PCL多孔支架，孔径200inm-50(Vm )浸入高糖DMEM 液体培养基后，置于37°C 5%C02的培养箱内静置2小时；
2. 将常规细胞消化收集的人肝癌细胞HepG2细胞，调整细胞密度为2xl05cells/ml接 种于浸泡好的三维支架中(请参见图2所示)；
3. 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒 温振荡4小时后，放入37°C 5%C02的培养箱内培养；
4. 待细胞长至对数增长期(请参见图3所示)时，0.05%胰酶(含EDTA )消化细胞。 具体步骤为
(1 )吸弃旧的培养液，用PBS小心冲洗粘附有细胞的三维支架；
(2)冲洗后的三維支架置入新的同规格的培养容器内加入适量胰酶，37。C消化 10min后轻轻振荡培养皿；
(3 )加入培养液终止消化，将消化下来的细胞收集于离心管中，200g离心5min;
(4) 弃掉离心上清，用新鲜的培养液悬浮细胞，并调整细胞密度后接种于合适的 培养容器内常规培养或直接用于实验研究；
(5) 原有的三维支架上仍有许多细胞未被消化下来(完全消化三维支架上的细胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，将残存有细胞的三维支架用PBS小心冲洗后置入新的 同规格的培养容器内，加入新鲜高糖DMEM培养液，37°C 5。/。C02的培养箱内培养。 如短期内不使用该细胞，则换成低血清高糖DMEM维持培养液维持培养细胞。
实施例2直接接种三维支架后加维持培养液维持培养人肝癌细胞H印G2
1 、将三维支架(3D Biotek公司的PCL多孔支架，孔径200nm-500nm)浸入低血清高 糖DMEM液体培养基后，置于37。C 5%C02的培养箱内静置2小时；2、 将常规细胞消化收集的人肝癌细胞HepG2细胞，调整细胞密度为2xl05cells/ml接
种于浸泡好的三维支架中；
3、 将接种有细胞的三維支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒
温振荡4小时后，放入37。C 5。/。C02的培养箱内维持培养。
实施例3长期培养保存中国仓鼠卵巢细胞CHO
1. 将三维支架(BD公司的3D磷酸钙多孔支架，孔径200i^m-500(im)浸入含有营养 添加剂的无血清液体培养基后，置于37°C 5%C02的培养箱内静置2小时；
2. 将常规细胞消化收集的中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，调整细胞密度为2xl05cells/ml 接种于浸泡好的三维支架中；
3. 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒
温振荡4小时后，放入37。C 5%(302的培养箱内培养；
4. 待细胞长至对数增长期时，0.05%胰酶(含EDTA)消化细胞。具体步骤为
(1) 吸弃旧的培养液，200g离心5min后收集细胞；
(2) 同时用PBS小心冲洗粘附有细胞的三维支架，冲洗后的三维支架置入新的同 规格的培养容器内加入适量胰酶，37°C消化lOmin后轻轻振荡培养皿；
(3 )加入培养液终止消化，将消化下来的细胞收集于离心管中，200g离心5min;
(4)弃掉离心上清，用新鲜的无血清培养液悬浮细胞，并将此次收集的细胞与步 骤(1 )收集的细胞合并后调整细胞密度接种于合适的培养容器内常规培养或直接用于 实验研究。
实施例4直接接种三维支架后加维持培养液维持培养中国仓鼠卵巢细胞CHO
1. 将三维支架(BD公司的3D磷酸钙多孔支架，孔径200pm-50(Vm)浸入低营养添 加剂的无血清液体培养基后，置于37°C 5%C02的培养箱内静置2小时；
2. 将常规细胞消化收集的中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞，调整细胞密度为2xl05cells/ml
接种于浸泡好的三维支架中；
3. 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒温振荡4小时后，放入37°C 5%C02的培养箱内维持培养。
实施例5长期培养保存人脐静脉内皮细胞HUVEC
1. 将三維支架(InVitrogen公司的AlgiMatrix三维支架，孔径200lam-500pm )(浸入 ECM液体培养基后，置于37°C 5%C02的培养箱内静置2小时；
2. 将常规细胞消化收集的人脐静脉内皮细胞HUVEC，调整细胞密度为2xl05cells/ml 接种于浸泡好的三维支架中；
3. 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒
温振荡4小时后，放入37。C 5。/。C02的培养箱内培养；
4. 待细胞长至对^:增长期时，0.05%胰酶(含EDTA)消4匕细胞。具体步骤为
(1 )吸弃旧的培养液，用PBS小心冲洗粘附有细胞的三维支架；
(2)冲洗后的三維支架置入新的同规格的培养容器内加入适量胰酶，37。C消化 10min后轻轻振荡培养m;
(3 )加入培养液终止消化，将消化下来的细胞收集于离心管中，200g离心5min;
(4)弃掉离心上清，用新鲜的培养液悬浮细胞，并调整细胞密度后接种于合适的 培养容器内常规培养或直接用于实验研究；
(5 )原有的三维支架上仍有许多细胞未被消化下来(完全消化三维支架上的细胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，将残存有细胞的三维支架用PBS小心沖洗后置入新的 同规格的培养容器内，加入新鲜ECM培养液，37°C 5。/。C02的培养箱内培养。如短期 内不使用该细胞，则换成低血清ECM维持培养液维持培养细胞。
实施例6直接接种三维支架后加维持培养液维持培养人脐静脉内皮细胞HUVEC
1. 将三维支架(InVitrogen公司的AlgiMatrix三维支架，孔径200(im-500(am )浸入低
血清的ECM液体培养基后，置于37°C 5%C02的培养箱内静置2小时；
2. 将常规细胞消化收集的人脐静脉内皮细胞HUVEC，调整细胞密度为2xl05cells/ml
接种于浸泡好的三维支架中；
3. 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒
温振荡4小时后，放入37°C 5%C02的培养箱内维持培养。
8实施例7长期培养保存人羊水间充干细胞
1 、将三维支架(BioHermes的三维支架，孔径200nm-500nm)浸入MEM-a液体培养 基后，置于37。C 5%<:02的培养箱内静置2小时；
2、 将常规细胞消化收集的人羊水间充干细胞，调整细胞密度为2xl()Scells/ml接种于浸 泡好的三维支架中；
3、 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒 温振荡4小时后，放入37。C 5。/。C02的培养箱内培养；
4、 待细胞长至对数增长期时，0.05%胰酶(含EDTA)消化细胞。具体步骤为
(1 )吸弃旧的培养液，用PBS小心冲洗粘附有细胞的三维支架；
(2)冲洗后的三维支架置入新的同规格的培养容器内加入适量胰酶，37。C消化 10min后轻轻振荡培养皿；
(3 )加入培养液终止消化，将消化下来的细胞收集于离心管中，200g离心5min;
(4) 弃掉离心上清，用新鲜的培养液悬浮细胞，并调整细胞密度后接种于合适的 培养容器内常规培养或直接用于实验研究；
(5) 原有的三维支架上仍有许多细胞未被消化下来(完全消化三維支架上的细胞 要胰酶消化4-5次，10min/次)，将残存有细胞的三维支架用PBS小心冲洗后置入新的 同规格的培养容器内，加入新鲜MEM-a培养液，37°C 5%C02的培养箱内培养。如短 期内不使用该细胞，则换成低血清MEM-a維持培养液维持培养细胞。
实施例8直接接种三维支架后加维持培养液维持培养人羊水间充干细胞
1、 将三维支架(BioHermes的三维支架，孔径200|imi-500nm )浸入低血清的MEM-a 液体培养基后，置于37。C 5。/。C02的培养箱内静置2小时；
2、 将常规细胞消化收集的人羊水间充干细胞，调整细胞密度为2xlC)Scells/ml接种于浸 泡好的三维支架中；
3、 将接种有细胞的三维支架系统置于恒温摇床内，设置参数为37°C 200转/分钟，恒 温振荡4小时后，放入37'C 5%0)2的培养箱内维持培养。
9在上述实施例中，本发明根据细胞长期培养保存三维系统，采用不同细胞使用不同的培 养基共同验证同一目的即三维立体式长期培养细胞，替代常规细胞冻存复苏保种方法，并体 现新型细胞保种方法的优越性。
由于三维支架系统可以更好地模拟体内细胞生长的微环境，有利于保持细胞的原始状态 并且能维持细胞高增殖、低死亡和增加细胞产物的分泌等特性，促进细胞的分裂增殖及细胞 间的信号传递。因此细胞在该系统中生长，不仅增值速度快，形态典型且能保持很高的细胞 活性，同时避免了常规细胞冻存复苏操作给细胞带来的复苏后细胞密度小，活性低，形态改 变等损伤。请参见图3所示，采用本发明的方法长期培养保存的人肝癌细胞HepG2，增值速 度快，形态典型且能保持4艮高的细胞活性，细胞消化后台盼蓝染色证明细胞活力达95%以上， 不需适应性培养即可立即用于实-睑研究或工业化生产，具有平面培养无可比拟的优势。
综上，本发明的细胞长期培养保存三维系统设计巧妙、结构简单，相关的细胞长期培养 保存方法操作简便、成本低、细胞活力高、可立即使用，从而可以大大加快试验研究或工业 化生产的进展，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种 修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限 制性的。
权利要求
1.一种细胞长期培养保存三维系统，其特征在于，包括三维支架和液体培养基或维持培养液，所述三维支架浸泡在所述液体培养基或所述维持培养液中，所述三维支架为生物相容性材料制成，其上分布有许多孔洞，所述孔洞大于所要培养的细胞。
2. 根据权利要求l所述的细胞长期培养保存三维系统，其特征在于，所述三维支架为可降解 支架或不可降解支架。
3. 根据权利要求l所述的细胞长期培养保存三维系统，其特征在于，所述孔洞的孔径为 200,-500拜。
4. 一种细胞长期培养保存方法，其特征在于，采用根据权利要求l所迷的细胞长期培养保存 三维系统，用所述三維支架将所述细胞在所述液体培养基中进行培养并传代；或，用所述 三维支架将所述细胞在所述维持培养液中进行维持培养。
5. 根据权利要求4所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，所述细胞是人肝癌细胞 HepG2、中国仓鼠卵巢细胞CHO、原代人脐静脉内皮细胞HUVEC或人羊水间充干细胞； 相应的，所述液体培养基是高糖DMEM培养基、无血清培养基；ECM培养基或MEM-a培 养基；所述维持培养液是低血清浓度的高糖DMEM培养基，低营养添加剂的无血清培养基， 低血清浓度的ECM培养基或MEM-a培养基。
6. 根据权利要求4所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，所述培养是将所述三维支架 在所述液体培养基中进行浸泡，然后将所迷细胞接种于所述三维支架，接着37。C恒温振荡， 然后再放入C02培养箱37。C常规培养。
7. 根据权利要求6所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，所述浸泡在37'C的C02培养 箱内进行2小时；所述细胞接种的密度为2xl()Scells/ml;所述恒温振荡采用的转速为200转/ 分钟，使用的时间为4小时。
8. 根据权利要求4所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，所述传代是将所述液体培养 基吸出，用磷酸盐緩冲液冲洗细胞后，用胰蛋白酶部分消化所述三维支架上粘附的所述细 胞，消化完毕，所述三維支架用新的磷酸盐緩冲液冲洗后放入新的培养皿内，添加新鲜液 体培养基继续培养。
9. 根据权利要求8所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，所述胰蛋白酶为0.05%的含 EDTA的胰蛋白酶。
10. 根据权利要求8所述的细胞长期培养保存方法，其特征在于，在所述传代步骤的最后，用 所述维持培养液代替所述新鲜液体培养基从而维持培养所述三維支架上粘附的所述细胞。
全文摘要
本发明涉及一种细胞长期培养保存三维系统，包括三维支架和液体培养基或维持培养液，三维支架浸泡在液体培养基或维持培养液中，所述三维支架为生物相容性材料制成，其上分布有许多孔洞，所述孔洞大于所要培养的细胞，较佳地，三维支架为可降解支架或不可降解支架，孔洞的孔径为200μm-500μm，设计巧妙、结构简单，还提供了采用上述细胞长期培养保存三维系统长期培养保存细胞的方法，用三维支架将细胞在液体培养基中进行培养并传代；或，用三维支架将细胞在维持培养液中进行维持培养，该细胞长期培养保存方法操作简便、成本低、细胞活力高、可立即使用，从而可以大大加快试验研究或工业化生产的进展，适于大规模推广应用。
文档编号C12M3/00GK101643703SQ200910194729
公开日2010年2月10日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者刘东旭, 震 雷 申请人:雷 震;刘东旭