专利名称：丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢产乙酸优势菌群的分离方法。
背景技术：
厌氧生物处理方法是现今高浓度有机废水处理的常用技术，在厌氧生物处理方法 过程中因存在产酸发酵菌群(其中含有产氢产乙酸菌群)，又因为产酸发酵菌群比产氢产 乙酸菌群的生长和代谢速率快，产生的大量丙酸、丁酸等有机挥发酸，如果不能及时转化为 乙酸，不仅会限制后续产甲烷作用，同时由于挥发酸的积累和PH的降低，使反应系统中的 所有微生物类群受到严重抑制，最终导致反应器的运行失败。因此，厌氧生物处理系统中产 氢产乙酸作用的强化，不仅可以达到废水处理高度资源化的目的，而且可以提高厌氧生物 处理系统"抗酸化"的能力，可望较大幅度地提高厌氧生物处理系统的处理效能和运行稳定 性，具有重要的工程应用价值。 然而，众所周知产氢产乙酸菌具有生理生化特性特殊，并且分离困难，菌种资源严 重缺乏，目前得到的纯培养物不超过6株，培养出的产氢产乙酸菌产氢率低。在这种情况 下，选育以产氢产乙酸菌为优势的氧化丙酸和丁酸混合微生物菌群，不仅在技术上可行，而 且在群落结构上更加稳定，更易应用于工程实践，开发基于强化产氢产乙酸菌群功能作用 的高效厌氧生物处理技术。
发明内容
本发明目的是为了解决现有产氢产乙酸菌的分离方法存在分离困难及培养出的 产氢产乙酸菌产氢率低的问题。而提供丙酸氧化产氢产乙酸菌群的分离方法。
分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以下步骤实现一、先以C0D浓度为 2000 10000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧折流板反应器为模型，然后在 进水pH为7. 0 7. 5、温度为35t:和HRT为48h的条件下对厌氧活性污泥进行初步驯化； 二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后加入驯化后的第三格室厌氧 折流板反应器中30 60mL厌氧活性污泥，封口 ，而后在温度为35°C 、以130r/min的振速 振荡1 2h，得菌悬液A ;三、用无菌注射器取10 20mL的菌悬液A转接装有质量浓度为 10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 0 7. 5、温度为35°C以振速速率 为130r/min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培养中丙酸培养基丙酸质 量浓度小于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养 基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 0 7. 5、温度为35t:及振速速率为130r/min条件下再 次进行富集培养；五、重复步骤四8 10次；得丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合 菌群；六、将丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲垸菌的复合菌群转接含有0. 1 10mmol/L 2_溴 乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7. 0 7. 5、温度为35t:及振速速率为130r/min 条件下进行培养，得丙酸氧化产氢产乙酸菌群；七、在强化培养中含有0. 1 10mmol/L2-溴 乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有0. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7. 0 7. 5、温 度为35°C以振速速率为130r/min条件下进行培养；八、重复步骤七4 8次，即可分离丙酸 氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A与丙酸培养基的体积比为1 : 6;步骤四 中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1 : 6;步骤六中丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲 烷菌的复合菌群与含有0. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1:6; 步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有O. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基 的体积比为1 : 6。 本发明分离得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群不但能够降解丙酸钠，同时产生 气体(气体中有接近一半的甲烷)；分离得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群经培养，产生 大量的乙酸及氢气。 本发明分离出的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群在葡萄糖和丙酸共同存在时，丙酸
氧化产氢产乙酸优势菌群会优先降解葡萄糖，其次才降解丙酸。本发明分离出的丙酸氧化
产氢产乙酸优势菌群对制糖废水进行去除，COD去除率增强，丙酸浓度下降。 本发明既可以降解较高浓度丙酸，以减少"酸化"对系统带来的冲击，同时可以有
效提高高浓度有机废水的处理效能。 本发明分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法简单易行，无需特定环境和要 求。 本发明分离出来的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群接入到丙酸培养基中容易降解 且大大提高了产氢率(产氢率达到20. 4mmol/L-culture，产氢率约为现有产氢菌产氢率的 6 8倍)。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的
任意组合。
具体实施方式
一 本实施方式分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以下步 骤实现一、先以COD浓度为2000 10000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧 折流板反应器为模型，然后在进水pH为7. 0 7. 5、温度为35t:和HRT为48h的条件下对 厌氧活性污泥进行初步驯化；二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后 加入驯化后的第三格室厌氧折流板反应器中30 60mL厌氧活性污泥，封口 ，而后在温度为 35t:、以130r/min的振速振荡1 2h，得菌悬液A ;三、用无菌注射器取10 20mL的菌悬 液A转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 0 7. 5、 温度为35°C以振速速率为130r/min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培 养中丙酸培养基丙酸质量浓度小于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓 度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7.0 7.5、温度为35t:及振速速 率为130r/min条件下再次进行富集培养；五、重复步骤四8 10次；得丙酸氧化产氢产乙 酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、将丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含 有O. 1 10mmol/L 2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7. 0 7. 5、温度为35°C 及振速速率为130r/min条件下进行培养，得丙酸氧化产氢产乙酸菌群；七、在强化培养中 含有0. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有O. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然 后在pH为7. 0 7. 5、温度为35°C以振速速率为130r/min条件下进行培养；八、重复步骤 七4 8次，即可分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A与丙酸培养基 的体积比为l : 6;步骤四中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1 : 6;步骤六中丙酸 氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群与含有0. 1 10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸 培养基的体积比为l : 6;步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有0. 1 10mmol/L2-溴 乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6。 本实施方式步骤一中四格室厌氧折流板反应器以大豆蛋白废水为处理对象其中
富含丙酸，第三格室厌氧折流板反应器反应生成物中含有一定量的氢气和乙酸，因此第三
格室厌氧折流板反应器厌氧活性污泥中必然存在丙酸氧化产氢产乙酸菌或者菌群。 本实施方式步骤二中厌氧活性污泥取自于具有产氢产乙酸菌和产甲烷菌比较集
中的ABR第三格室。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中大豆蛋白废水 的COD浓度为3000 8000mg/L。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中大豆蛋白废水 的COD浓度为5000mg/L。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
一至三不同的是步骤一中pH为 7. 1 7. 4。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
一至三不同的是步骤一中pH为 7.2。其它步骤及参数与具体实施方式
一至三相同。
具体实施方式
六本实施方式与具体实施方式
一至五不同的是步骤二中厌氧活性 污泥的量为40 50mL。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五相同。
具体实施方式
七本实施方式与具体实施方式
一至五不同的是步骤二中厌氧活性 污泥的量为45mL。其它步骤及参数与具体实施方式
一至五相同。
具体实施方式
八本实施方式与具体实施方式
一至七不同的是步骤二中氮气的纯 度为99.99%。其它步骤及参数与具体实施方式
一至七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至八不同的是步骤二振荡时间 1.5h。其它步骤及参数与具体实施方式
一至八相同。
具体实施方式
十本实施方式与具体实施方式
一至九不同的是步骤三中用无菌注 射器取15mL的菌悬液A转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中。其 它步骤及参数与具体实施方式
一至九相同。
具体实施方式
i^一 本实施方式与具体实施方式
一至十不同的是步骤三中pH为 7. 1 7.4。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十相同。
具体实施方式
十二 本实施方式与具体实施方式
一至十不同的是步骤三中pH为 7.2。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十相同。
具体实施方式
十三本实施方式与具体实施方式
一至十二不同的是步骤三中丙酸 培养基由10g的丙酸钠、lg的NH4C1、0. 6g的NaC1、0. lg的CaCl2 *2H20、0. 2g的1%。12 *6H20、 0. lg的KC1、0. 3g的K2HP04、0. 3g的KH2P04，0. Olg的FeCl2、0. 5g的半胱氨酸、10mL的微量 元素液、10mL的维生素液、2g/L的胰蛋白胨、2g/L的酵母膏用蒸馏水定容至1000mL，并用NaHC03调节pH至7. 5 8. 0。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十二相同。
具体实施方式
十四本实施方式与具体实施方式
十三不同的是微量元素液的每 1L微量元素液由0. Olg的MnS04 7H20，0. 05g的ZnS04 7H20，0. Olg的H3B03， 1. OOg的 N(CH2COOH)3，0. Olg的CaCl2，0. Olg的Na2Mo04，0. 20g的CoCl2 6H20，0. Olg的A1K(S04)2和 余量的蒸馏水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十五本实施方式与具体实施方式
十三不同的是维生素液的每1L 维生素液由0. Olg的钴氨素，O. 025g的核黄素，O. 025g的肌酸，O. 020g的柠檬酸，O. OlOg的 叶酸，O. 050g的吡多醛，O. 025g的抗坏血酸，O. OlOg的对氨基苯甲酸和余量的蒸馏水组成。 其它步骤及参数与具体实施方式
十三相同。
具体实施方式
十六本实施方式与具体实施方式
一至十五不同的是步骤四中pH 为7. 1 7. 4。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十五相同。
具体实施方式
十七本实施方式与具体实施方式
一至十五不同的是步骤四中pH 为7.3。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十五相同。
具体实施方式
十八本实施方式与具体实施方式
一至十七不同的是步骤五中重复 步骤四9次。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十七相同。
具体实施方式
九本实施方式与具体实施方式
一至十八不同的是步骤六中将丙酸 氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含有0.5 8mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸 培养基中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至十八相同。
具体实施方式
二十本实施方式与具体实施方式
一至十八不同的是步骤六中将丙 酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有4mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中。其它步骤及参 数与具体实施方式
一至十八相同。
具体实施方式
二i^一 本实施方式与具体实施方式
一至十八不同的是步骤六中丙 酸氧化产氢产乙酸菌群与含有2mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6。 其它步骤及参数与具体实施方式
一至十八相同。
具体实施方式
二十二 本实施方式与具体实施方式
一至二十一不同的是步骤七中 在筛选培养中含有0. 8 8mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量浓度小于3000mg/ L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含0.8 8mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养 基中。其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十一相同。
具体实施方式
二十三本实施方式与具体实施方式
一至二十二不同的是步骤七中 在筛选培养中含有5mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量浓度小于3000mg/L的条 件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含5mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中。其它 步骤及参数与具体实施方式
一至二十二相同。
具体实施方式
二十四本实施方式与具体实施方式
一至二十三不同的是步骤七中 pH为7.4。其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十三相同。
具体实施方式
二十五本实施方式与具体实施方式
一至二十四不同的是步骤七中 丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有0.6 6mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为 1 : 6。其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十四相同。
具体实施方式
二十六本实施方式与具体实施方式
一至二十五不同的是步骤七中 丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有3mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为l : 6。
7其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十五相同。 具体实施方式
二十七本实施方式与具体实施方式
一至二十六不同的是步骤八中 重复步骤七5 7次。其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十六相同。
具体实施方式
二十八本实施方式与具体实施方式
一至二十七不同的是步骤八中 重复步骤七6次。其它步骤及参数与具体实施方式
一至二十七相同。
具体实施方式
二十九本实施方式分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以 下步骤实现一、先以COD浓度为8000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧折流 板反应器为模型，然后在进水pH为7. 2、温度为35t:和HRT为48h的条件下对厌氧活性污 泥进行初步驯化；二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后加入驯化后 的第三格室厌氧折流板反应器中50mL厌氧活性污泥，封口，而后在温度为35t:、以130r/ min的振速振荡2h，得菌悬液A ;三、用无菌注射器取15mL的菌悬液A转接装有质量浓度为 10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 3、温度为35。C以振速速率为130r/ min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培养中丙酸培养基丙酸质量浓度小 于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌 血清瓶中，然后在pH为7. 2、温度为35°C以振速速率为130r/min条件下再次进行富集培 养；五、重复步骤四10次；得丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、将丙酸氧 化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含有5mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基 中，然后在PH为7. 2、温度为35°C以振速速率为130r/min条件下进行筛选培养，得丙酸氧 化产氢产乙酸菌群；七、在筛选培养中含有5mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量 浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有5mmol/L2-溴乙烷磺酸 钠的丙酸培养基中，然后在pH为7.4、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下进行培 养；八、重复步骤七9次，即可分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A 与丙酸培养基的体积比为l : 6;步骤四中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1 : 6; 步骤六中丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群与含有5mmol/L2-溴乙烷磺酸钠 的丙酸培养基的体积比为l : 6;步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有5mmol/L2-溴 乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6。 本实施方式四格室厌氧折流板反应器选用哈尔滨中药二厂运行了 26个月的四格 厌氧折流板反应器。 本实施方式分离出的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群厌氧折流板反应器第三格室 的活性污泥中获得的。 本实施方式分离得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群能够在30天内将浓度为 8000mg/L丙酸钠降解到浓度低于400mg/L，同时产生160mL的气体，其中CH4占总体积的 49. 14%，丙酸的平均降解速率为269. 5mg/L'd，降解率为95. 8%，比丙酸转化率22. lmmo1/ gMLVSS d，单位丙酸产甲烷率0.41mol/mo1 ;添加2-溴乙烷磺酸钠后，分离得到的丙酸 氧化产氢产乙酸优势菌群经30天培养，乙酸产量达到3362mg/L，产氢率达到20. 4mmo1/ L—culture。 本实施方式分离出的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群只能降解少量的丁酸，说明本 实施方式得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群对底物有较强的专一性；在葡萄糖和丙酸共 同存在时，丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群会优先降解葡萄糖，其次才降解丙酸。当以个数
8比9 : 1的比例将厌氧活性污泥和产氢产乙酸优势菌群投入到5000mg/L葡萄糖培养基中 时，其单位葡萄糖产甲烷率为1.415mol/mol，较对照系统提高了 1. 98倍；以同样比例接种 到COD为12000mg/L的制糖废水中时，其COD去除率较对照系统提高了 8. 6%，丙酸浓度较 对照系统降低了 60.8%。
具体实施方式
三十本实施方式分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以下 步骤实现一、先以C0D浓度为5000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧折流板 反应器为模型，然后在进水pH为7. 0、温度为35t:和HRT为48h的条件下对厌氧活性污泥 进行初步驯化；二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后加入驯化后 的第三格室厌氧折流板反应器中60mL厌氧活性污泥，封口，而后在温度为35t:、以130r/ min的振速振荡2h，得菌悬液A ;三、用无菌注射器取20mL的菌悬液A转接装有质量浓度为 10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 2、温度为35。C以振速速率为130r/ min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培养中丙酸培养基丙酸质量浓度小 于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌 血清瓶中，然后在pH为7.5、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下再次进行富集培 养；五、重复步骤四10次；得丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、将丙酸氧 化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含有8mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基 中，然后在pH为7.0、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下进行筛选培养，得丙酸氧 化产氢产乙酸菌群；七、在筛选培养中含有8mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量 浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有8mmol/L2-溴乙烷磺酸 钠的丙酸培养基中，然后在pH为7.3、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下进行培 养；八、重复步骤七7次，即可分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A 与丙酸培养基的体积比为l : 6;步骤四中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1 : 6; 步骤六中丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群与含有0. 1 10mmol/L2-溴乙烷 磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6;步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有8mmo1/ L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6。 本实施方式四格室厌氧折流板反应器选用哈尔滨工大环保有限公司运行了 18个 月的四格厌氧折流板反应器。 本实施方式分离出的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群厌氧折流板反应器第三格室 的活性污泥中获得的。 本实施方式分离得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群能够在30天内将浓度为 5000mg/L丙酸钠降解到浓度低于400mg/L，同时产生175mL的气体，其中CH4占总体积的 51. 6%，丙酸的平均降解速率为278. 5mg/L d，降解率为96. 4%，比丙酸转化率23. 4mmo1/ gMLVSS d，单位丙酸产甲烷率O. 48mol/mo1 ;添加2-溴乙烷磺酸钠后，分离得到的丙酸 氧化产氢产乙酸优势菌群经30天培养，乙酸产量达到3418mg/L，产氢率达到21. 4mmo1/ L—culture。 本实施方式得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群在葡萄糖和丙酸共同存在时，丙
酸氧化产氢产乙酸优势菌群会优先降解葡萄糖，其次才降解丙酸。当以个数比9 : i的
比例将厌氧活性污泥和产氢产乙酸优势菌群投入到5000mg/L葡萄糖培养基中时，其单位 葡萄糖产甲烷率为1.518mol/mol，较对照系统提高了 2. 12倍；以同样比例接种到COD为
912000mg/L的制糖废水中时，其COD去除率较对照系统提高了 8. 8 % ，丙酸浓度较对照系统 降低了 61.4%。
具体实施方式
三十一 本实施方式分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以 下步骤实现一、先以COD浓度为10000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧折流 板反应器为模型，然后在进水pH为7. 5、温度为35t:和HRT为48h的条件下对厌氧活性污 泥进行初步驯化；二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后加入驯化后 的第三格室厌氧折流板反应器中40mL厌氧活性污泥，封口，而后在温度为35t:、以130r/ min的振速振荡1. 5h，得菌悬液A ;三、用无菌注射器取15mL的菌悬液A转接装有质量浓 度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7.0、温度为35。C以振速速率为 130r/min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培养中丙酸培养基丙酸质量 浓度小于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基 的灭菌血清瓶中，然后在pH为7. 4、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下再次进行富 集培养；五、重复步骤四9次；得丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、将丙酸 氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含有10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养 基中，然后在pH为7.2、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下进行筛选培养，得丙酸 氧化产氢产乙酸菌群；七、在筛选培养中含有10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质 量浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有10mmol/L2-溴乙烷 磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7. 2、温度为35t:以振速速率为130r/min条件下进行 培养；八、重复步骤七6次，即可分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A 与丙酸培养基的体积比为l : 6;步骤四中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1 : 6; 步骤六中丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群与含有10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠 的丙酸培养基的体积比为l : 6;步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有10mmol/L2-溴 乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1 : 6。 本实施方式四格室厌氧折流板反应器选用哈尔滨工大环保有限公司运行了 15个 月的四格厌氧折流板反应器。 本实施方式分离出的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群厌氧折流板反应器第三格室 的活性污泥中获得的。 本实施方式分离得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群能够在30天内将浓度为 10000mg/L丙酸钠降解到浓度低于400mg/L，同时产生158mL的气体，其中CH4占总体积的 49. 08%，丙酸的平均降解速率为270. 3mg/L *d，降解率为95. 6%，比丙酸转化率21. 8mmo1/ gMLVSS d，单位丙酸产甲烷率O. 40mol/mo1 ;添加2-溴乙烷磺酸钠后，分离得到的丙酸 氧化产氢产乙酸优势菌群经30天培养，乙酸产量达到3348mg/L，产氢率达到20. 2mmo1/ L—culture。 本实施方式得到的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群在葡萄糖和丙酸共同存在时，丙 酸氧化产氢产乙酸优势菌群会优先降解葡萄糖，其次才降解丙酸。当以个数比9 : l的 比例将厌氧活性污泥和产氢产乙酸优势菌群投入到5000mg/L葡萄糖培养基中时，其单位 葡萄糖产甲烷率为1.412mol/mol，较对照系统提高了 1. 96倍；以同样比例接种到COD为 12000mg/L的制糖废水中时，其COD去除率较对照系统提高了 8. 4%，丙酸浓度较对照系统 降低了 60.3%。
权利要求
丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的方法按以下步骤实现一、先以COD浓度为2000～10000mg/L的大豆蛋白废水为进水，再以四格室厌氧折流板反应器为模型，然后在进水pH为7.0～7.5、温度为35℃和HRT为48h的条件下对厌氧活性污泥进行初步驯化；二、将装有数颗玻璃球120mL的灭菌血清瓶中通入氮气，然后加入驯化后的第三格室厌氧折流板反应器中30～60mL厌氧活性污泥，封口，而后在温度为35℃、以130r/min的振速振荡1～2h，得菌悬液A；三、用无菌注射器取10～20mL的菌悬液A转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7.0～7.5、温度为35℃以振速速率为130r/min条件下进行富集培养，得富集后菌悬液；四、在富集培养中丙酸培养基丙酸质量浓度小于1000mg/L的条件下，将富集后菌悬液转接装有质量浓度为10000mg/L丙酸培养基的灭菌血清瓶中，然后在pH为7.0～7.5、温度为35℃及振速速率为130r/min条件下再次进行富集培养；五、重复步骤四8～10次；得丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、将丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群转接含有0.1～10mmol/L 2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7.0～7.5、温度为35℃及振速速率为130r/min条件下进行培养，得丙酸氧化产氢产乙酸菌群；七、在强化培养中含有0.1～10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的质量浓度小于3000mg/L的条件下，将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接含有0.1～10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基中，然后在pH为7.0～7.5、温度为35℃以振速速率为130r/min条件下进行培养；八、重复步骤七4～8次，即可分离丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群；其中步骤三中菌悬液A与丙酸培养基的体积比为1∶6；步骤四中富集后菌悬液与丙酸培养基的体积比为1∶6；步骤六中丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群与含有0.1～10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1∶6；步骤七中丙酸氧化产氢产乙酸菌群与含有0.1～10mmol/L2-溴乙烷磺酸钠的丙酸培养基的体积比为1∶6。
2. 根据权利要求1所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于步骤 一中大豆蛋白废水的C0D浓度为3000 8000mg/L。
3. 根据权利要求1或2所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于 步骤一中pH为7. 1 7. 4。
4. 根据权利要求3所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于步骤 二中氮气的纯度为99. 99%。
5. 根据权利要求1、2或4所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在 于步骤二中振荡时间为1. 5h。
6. 根据权利要求5所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于步骤 二中厌氧活性污泥的量为40 50mL。
7. 根据权利要求1、2、4或6所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征 在于步骤三中丙酸培养基由10g的丙酸钠、lg的NH4C1、0. 6g的NaC1、0. lg的CaC12 *2H20、 0. 2g的Mg C12 6H20、0. lg的KC1、0. 3g的K2HP04、0. 3g的KH2P04，0. Olg的FeC12、0. 5g 的半胱氨酸、10mL的微量元素液、10mL的维生素液、2g/L的胰蛋白胨、2g/L的酵母膏用蒸馏 水定容至1000mL，并用NaHC03调节pH至7. 5 8. 0。
8. 根据权利要求7所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于微量 元素液的每1L微量元素液由0. Olg的MnS04 *7H20，0. 05g的ZnS04 *7H20，0. Olg的H3B03，`1. 00g的N(CH2C00H)3，0. Olg的CaC12，0. Olg的Na2Mo04，0. 20g的CoC12 6H20，0. Olg的A1K(S04) 2和余量的蒸馏水组成。
9.根据权利要求7所述的丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，其特征在于维生 素液的每1L维生素液由0. Olg的钴氨素，O. 025g的核黄素，O. 025g的肌酸，O. 020g的柠檬 酸，0. OlOg的叶酸，0. 050g的吡多醛，0. 025g的抗坏血酸，0. OlOg的对氨基苯甲酸和余量的 蒸馏水组成。
全文摘要
丙酸氧化产氢产乙酸优势菌群的分离方法，它涉及一种产氢产乙酸菌的分离方法。它解决了现有分离方法存在分离困难及培养出的产氢产乙酸菌产氢率低的问题。分离方法一、对厌氧活性污泥进行初步驯化；二、制菌悬液A；三、富集后菌悬液；四、将富集后菌悬液再次富集培养；五、制丙酸氧化产氢产乙酸菌和产甲烷菌的复合菌群；六、制丙酸氧化产氢产乙酸菌群；七、将丙酸氧化产氢产乙酸菌群转接丙酸培养基中进行培养；八、重复步骤七4～8次，即可分离。本发明方法分离容易，操作简单，分离出优势菌群的产氢率约为现有产氢菌产氢率的6～8倍。本发明优势菌群既可降解较高浓度丙酸，也可有效提高高浓度有机废水的处理效能。
文档编号C12R1/01GK101768562SQ200910312919
公开日2010年7月7日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者刘崇, 李建政, 王硕, 郑国臣, 马超 申请人:哈尔滨工业大学