专利名称：吡啶二羧酸/盐的生产方法
吡啶二羧酸/盐的生产方法本发明涉及通过培养重组微生物发酵生产吡啶二羧酸/盐(dipicolinate)的新 方法，所述微生物表达具有吡啶二羧酸合成酶(dipicolinate synthetase)活性的酶。本 发明还涉及相应的重组宿主和适于制备这样的宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及使用 发酵生产获得的吡啶二羧酸/盐(dipicolinate)制备聚酯或聚酰胺共聚物的方法。
背景技术：
吡啶二羧酸(CAS编号499-83-2)也称为吡啶_2，6_ 二羧酸或DPA，它在不同的技 术领域得以应用，例如作为聚酯或聚酰胺类型共聚物合成的单体，吡啶合成前体，过氧化物 和过酸的稳定剂，所述过氧化物和过酸例如叔丁基过氧化物、二甲基环己酮过氧化物、过氧 乙酸和过氧单硫酸(peroxy-monosulphuric acid)，金属表面抛光液成分，由于存在痕量金 属离子而易于变质的有机材料的稳定剂(螯合效应)，环氧树脂稳定剂和摄影用溶液或乳 液的稳定剂(阻止钙盐沉淀)。公知DPA在细菌内生孢子中生物合成。催化从脱氢吡啶二羧酸/盐 (dehydrodipicolinate)到DPA的生物合成的酶是吡啶二羧酸合成酶。已经从枯草芽孢 杆菌(Bacillus subtilis)分离了所述酶并进一步了表征了所述酶。它由spoVF操纵子 (BG10781, BG10782)编码。尚未描述所述具有商业兴趣的化合物的发酵生产。因此，本发明的目的是提供发酵生产吡啶二羧酸或其相应的盐的合适方法。
图1描述了 PClik5aMCS克隆载体的质粒图谱。图2描述了枯草芽孢杆菌来源的spoVF基因的DNA序列，用下划线标出了 α亚基， 用双下划线标出了 β亚基。图3描述了合成的spoVF基因的DNA序列，用斜体字标出了 N末端sod启动子，用 下划线标出了 α亚基，用双下划线标出了 β亚基，用粗体字标出了 groEL终止子。发明概述教导了通过培养表达吡啶二羧酸合成酶的重组微生物发酵生产吡啶二羧酸/盐 (吡啶二羧酸或其盐)的本发明解决了上述问题，所述酶转化了在所述微生物中以赖氨酸 生物合成途径过程中的中间产物形式形成的二氢吡啶二羧酸/盐。发明详述1、优选的实施方案本发明涉及发酵生产DPA的方法，该方法包含培养至少一种重组微生物，该微生 物优选源自具有利用二氨基庚二酸(DAP)途径以二氢吡啶二羧酸/盐，特别是L-2，3-二 氢吡啶二羧酸/盐为中间产物生产赖氨酸的能力的亲本微生物，且该重组微生物在性质上 或数量上保留了所述亲本微生物的所述能力，并额外具有表达异源吡啶二羧酸合成酶的能 力，因此二氢吡啶二羧酸/盐，特别是L-2，3- 二氢吡啶二羧酸/盐被转化成DPA。所述修饰 的微生物还可保留或不保留其赖氨酸生产能力。
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具体而言，所述亲本微生物是产赖氨酸细菌，优选棒状杆菌。具体而言，所述 亲本微生物是棒杆菌属(Corynebacterium)细菌，如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)所述异源吡啶二羧酸合成酶的起源为原核生物或真核生物。例如，所述异源吡 啶二羧酸合成酶可起源于芽孢杆菌属(Bacillus)细菌，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。所述芽孢杆菌属的酶至少由一个α亚基和至少一个β亚基组成。吡啶二羧酸合成酶α链的蛋白质序列是MLTGLKIAVIGGDARQLEIIRKLTEQQADIYLVGFDQLDHGFTGAVKCNIDEIPFQQIDSIILPVSAT TGEGVVSTVFSNEEVVLKQDHLDRTPAHCVIFSGISNAYLENIAAQAKRKLVKLFERDDIAIYNSIPTVEGTIMLA IQHTDYTIHGSQVAVLGLGRTGMTIARTFAALGANVKVGARSSAHLARITEMGLVPFHTDELKEHVKDIDICINT IPSMILNQTVLSSMTPKTLILDLASRPGGTDFKYAEKQGIKALLAPGLPGIVAPKTAGQILANVLSKLLAEIQAE EGK(SEQ ID NO 2)吡啶二羧酸合成酶β链的蛋白质序列是MSSLKGKRIGFGLTGSHCTYEAVFPQIEELVNEGAEVRPVVTFNVKSTNTRFGEGAEWVKKIEDLTGYE AIDSIVKAEPLGPKLPLDCMVIAPLTGNSMSKLANAMTDSPVLMAAKATIRNNRPVVLGISTNDALGLNGTNLMRLM STKNIFFIPFGQDDPFKKPNSMVAKMDLLPQTIEKALMHQQLQPILVENYQGND(SEQ ID NO 3)吡啶二羧酸合成酶α亚基的计算分子量为31，947Da，β亚基的计算分子量为 21，869Da。在本发明方法的其他实施方案中，异源吡啶二羧酸合成酶包含至少一条具有根据 SEQ ID NO :2的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性(例如至少85、90、92、95、96、97、98 或99%的序列同一性)的序列的α亚基；及至少一条具有根据SEQ ID NO 3的氨基酸序 列或与其具有至少80%同一性(例如至少85、90、92、95、96、97、98或99%的序列同一性) 的序列的β亚基。具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶可被核酸序列编码，该核酸序列适应具有赖氨酸 生产能力的所述亲本微生物的密码子使用。例如，具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶可被核酸序列编码，该序列包含a)根据SEQ ID NO 1的spoVF基因序列，或b)包含根据SEQ ID NO 4的基本上从残基193至残基1691的编码序列的合成 spoVF基因序列；或c)编码如上所述的吡啶二羧酸合成酶或其α和/或β亚基的任何核苷酸序列。在此处所述的方法的另一个实施方案中，以合适方式将所述重组微生物赖氨酸生 物合成途径的至少一个基因，例如1、2、3或4个基因失调(deregulate)，例如为了进一步支 持形成DPA。所述至少一个失调的基因可以选自天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶 (aspartatesemialdehyde dehydrogenase)、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原 酶、丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、 6_磷酸葡萄糖酸内酯酶、果糖1，6-二磷酸酶(biphosphatase)、高丝氨酸脱氢酶、烯醇 丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰CoA合成酶、甲基丙二酰辅酶A变位酶、四氢吡啶二羧酸琥珀 酉先酶(succinylase)、琥拍酉先氨基酮基庚二酸转氨酶(succinyl-amino-ketopimelatetransaminase)、琥拍酉先二氨基庚二酸脱琥拍酉先酶(succinyl-diamino-pimelate desuccinylase)、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶和二氨基庚二酸脱羧酶。根据另一个实施方案，利用公知方法从发酵肉汤分离因此生产出的吡啶二羧酸/
Τττ . ο本发明还涉及-包含如上所定义的吡啶二羧酸合成酶编码序列的核酸序列；-表达盒，其包含如上所述的至少一条核酸序列，该序列有效连接到至少一条调控 性核酸序列；-重组载体，其包含至少一个如上所述的表达盒；及-原核或真核宿主，其用至少一个如上所述的载体转化。优选地，所述宿主可选自重组棒状杆菌细菌，尤其是重组棒杆菌属，特别地重组谷 氨酸棒杆菌。根据另一个实施方案，本发明涉及制备聚合物如聚酯或聚酰胺共聚物的方法，该 方法包含a)用如上所述的方法制备吡啶二羧酸/盐；b)分离吡啶二羧酸/盐；及c)用至少一种其他的多价可共聚的(copolymerizable)共聚单体聚合所述吡啶 二羧酸/盐，所述可共聚的共聚单体例如选自多元醇和多胺或其混合物。最后，本发明涉及根据本发明生产的吡啶二羧酸/盐作为聚酯或聚酰胺类型共聚 物的合成中的单体；吡啶合成前体；过氧化物和过酸的稳定剂，所述过氧化物和过酸例如 叔丁基过氧化物、二甲基环己酮过氧化物、过氧乙酸和过氧单硫酸；金属表面抛光液成分； 由于存在痕量金属离子而易于变质的有机材料的稳定剂(螯合效应)；环氧树脂稳定剂和 摄影用溶液或乳液的稳定剂(具体而言，通过阻止钙盐沉淀)的用途。2、特定术语的解释除非另外指明，否则认为表述“吡啶二羧酸/盐(dipicolinate)”、“卩比啶二羧酸 (dipicolinic acid) ”、“批啶二羧酸盐(dipicolinic acid salt) ”和 “DPA” 的意思相同。 根据本发明获得的吡啶二羧酸/盐产品可以是游离酸的形式、所述酸的部分盐或完整盐的 形式，或酸及其盐的混合物形式。吡啶二羧酸“盐”包含例如金属盐，如吡啶二羧酸锌，吡啶二羧酸的单碱金属盐或 双碱金属盐，如一钠盐、二钠盐、一钾盐和二钾盐以及碱土金属盐如钙盐或镁盐。术语“二氢吡啶二羧酸/盐”包含其任何立体异构形式，要么为单独的，即纯立体 异构形式，或为组合立体异构体。具体而言，所述术语指要么单独即纯立体异构形式的或与 另一种立体异构体组合的L-2，3- 二氢吡啶二羧酸/盐。术语“二氢吡啶二羧酸/盐”还涉 及游离酸、所述酸的部分盐或完整盐或酸和其盐的混合物。如上所述，“盐”如就吡啶二羧酸 所定义的那样被定义。需要以其最宽的意思理解“失调”，并包含利用本领域技术人员公知的不同手段增 加或减少酶(靶酶)活性的彻底关闭。合适的方法包含例如增加或减少生物体中基因和/ 或酶分子的拷贝数目，或修饰影响其酶活性的酶的另一个特征，这然后产生对于所讨论的 代谢途径的所需效应，具体而言，所述代谢途径为赖氨酸生物合成途径或与其相连的任何途径或酶反应。合适的遗传操作也可包括但不限于改变或修饰与特定基因表达相关的调控 序列或位点(例如通过移除强启动子、可诱导启动子或多个启动子)；修饰特定基因的染色 体位置；改变毗连特定基因的核酸序列如核糖体结合位点或转录终止子；减少特定基因的 拷贝数；修饰特定基因的转录和/或特定基因产物翻译中涉及的蛋白质(例如，调控蛋白 质、阻抑制子、增强子、转录激活子等)，或任何其他本领域常规的失调特定基因表达的常规 方法(包括但不限于使用反义核酸分子，或其他敲除或阻断靶蛋白表达的方法)。术语“异源”或“外源”指此处所述的蛋白质、核酸和相应的序列，如此处所限定地， 其被引入到遗传操作的微生物中或被其生产(转录的或翻译的)且该微生物在进行所述操 作前不含有或不生产所述序列。具体而言，所述微生物在进行所述操作前可不含有或表达 所述异源酶活性，或可含有或表达具有可比较活性或特异性的内源酶，该酶被不同编码序 列或具有不同氨基酸序列的酶所编码，且所述内源酶可转化与所述外源酶的底物一样的底 物。本发明的“亲本”微生物是具有赖氨酸生产能力的任何微生物，所述生产利用一种 途径，如具体而言的二氨基庚二酸脱氢酶(DAP)途径，其中以二氢吡啶二羧酸/盐特别是 L-2，3- 二氢吡啶二羧酸/盐作为中间产物。“源自亲本微生物的”微生物指利用任何类型操作修饰的微生物，所述操作选自化 学的、生物化学的或微生物的技术，特别是遗传工程技术。所述操作产生至少一种所述亲本 微生物生物特征的改变。例如，异源酶的编码序列可被引入所述生物体。通过所述改变，至 少一个特征可被加到所述亲本微生物、在所述亲本微生物中被替换或从所述亲本微生物删 除。所述改变可例如产生所述微生物改变的代谢特征，因此，例如，所述微生物表达的酶的 底物(所述亲本微生物根本不利用该底物或以不同的效率地利用该底物)以特征性方式 (例如，假如与亲本微生物相比较，以不同的量、比例或以不同的效率)被代谢，和/或所述 修饰的微生物以特征性方式(例如，假如与亲本微生物相比较，以不同的量、比例或以不同 的效率)形成代谢终产物或中间产物。“中间产物”理解为产物，其在化学或生物化学过程中以不必是在分析上可直接检 测的浓度短暂地或连续形成。所述“中间产物”可利用次级的、化学的或生物化学的反应， 特别是利用如此处所定义的“批啶二羧酸合成酶”催化的反应从所述生物化学过程中移除。术语“批啶二羧酸合成酶”指具有转化产赖氨酸途径代谢产物为吡啶二羧酸/盐 的能力的任何起源的任何酶。具体而言，所述术语指利用其将二氢吡啶二羧酸/盐化合物， 特别是L-2，3- 二氢吡啶二羧酸/盐转化为DPA的酶。“重组宿主”可以是任何原核细胞或真核细胞，其含有克隆载体或表达载体。该术 语也可包括那些已经被遗传工程化以在宿主细胞染色体或基因组中含有克隆基因的原核 细胞或真核细胞。合适宿主的例子参见Sambrook等人，MOLECULAR CLONING =A LABORATORY MANUAL， 二片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)。术语“重组微生物”包括微生物(例如细菌、酵母、真菌等)或微生物菌株，其已经 被遗传改变、修饰或工程化(例如遗传工程化)以便其与其来源的天然发生微生物或“亲 本”微生物相比显示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响了 微生物的编码核酸序列时)。如此处所用，“基本纯的”蛋白质或酶指所需的纯化的蛋白质基本不含污染性细胞组分，如聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单条带所证实的。术语 “基本纯的”进一步描述了分子，其通过本领域技术人员使用的一个或更多个纯度或同质性 特征而言是同质的。例如，基本纯的吡啶二羧酸合成酶将在标准实验偏差内显示参数的恒 定的和可重复的特征，所述参数例如下述分子量、色谱迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封 闭的或非封闭的N-末端、HPLC洗脱曲线、生物活性和其他此类参数。然而，该术语并不意 味着排除吡啶二羧酸合成酶和其他化合物的人工的或合成的混合物。此外，该术语并不意 味着排除任选地从重组宿主分离而来的吡啶二羧酸合成酶融合蛋白质。3、本发明的其他实施方案3.1其他基因的失调如果与至少一种如下所列的其他基因的失调相结合，将能进一步改良用表达枯草 芽孢杆菌spoVF操纵子的重组谷氨酸棒杆菌赖氨酸生产者进行的吡啶二羧酸/盐的发酵生产。酶(基因产物)基因失调天冬氛酸激酶ask NCgI 0247通过点突变(Eggeling等人， (编著)，Handbook of Corynebacterium glutamicum，笫 20.2.2 页 (CRC press, 2005))和放大释 奴馈抑制天冬氣酸半搭脱氢酶asd NCgI 0248放大(EP1108790)二氢吡咬二羧酸合酶dapA NCgI 1896放大(EP0841395)二氢吡焚二羧酸还原酶dapB NCgI 1898通过突变或其他方式弱化、敲 除或沉默丙酮酸欺化酶pycA NCgI 0659通过点突变(EP1108790)和 放大释M馈抑制磷酸稀醇丙酮酸羧化酶ppc NCgI 1523放大(EP358940)葡糖-6-磷_氢酶zwf NCgI 1514通过点突变 (US2003/0175911)和放大释 奴馈抑制转酮醇酵tkt NCgI 1512放大(W00104325)转醛醇酶tal NCgI放大 CW00104325)
权利要求
发酵生产吡啶二羧酸/盐的方法，该方法包含培养重组微生物，该微生物来自于亲本微生物，其具有通过二氨基庚二酸(DAP)途径以L 2，3 二氢吡啶二羧酸/盐作为中间产物生产赖氨酸的能力，以及额外具有表达异源吡啶二羧酸合成酶的能力，以使L 2，3 二氢吡啶二羧酸/盐转化为吡啶二羧酸或其盐。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物是生产赖氨酸的细菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生产赖氨酸的细菌是棒状杆菌细菌。
4.根据权利要求3所述的方法，其中细菌是棒杆菌属(Corynebacterium)。
5.根据权利要求4所述的方法，其中细菌是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述异源吡啶二羧酸合成酶是原核或真 核来源的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述异源吡啶二羧酸合成酶来源于芽孢杆菌属 (Bacillus)，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的细菌。
8.根据权利要求7所述的方法，其中异源吡啶二羧酸合成酶包含至少一个具有根据 SEQ ID NO :2的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列的α亚基，和至少一个具有 根据SEQ ID NO :3的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的序列的β亚基。
9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶由核酸 序列编码，该核酸序列适应所述具有产生赖氨酸能力的亲本微生物的密码子使用。
10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶由核 酸序列编码，该核酸序列包含a)根据SEQID NO 1的spoVF基因序列，或b)包含根据SEQID NO 4的基本上从残基193至残基1691的编码序列的合成spoVF 基因序列；或c)编码如权利要求7和8任一项所定义的吡啶二羧酸合成酶的任何核苷酸序列。
11.根据权利要求1到10任一项所述的方法，其中在所述重组微生物中，赖氨酸生物合 成途径的至少一个基因被失调。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一个被失调的基因选自天冬氨酸激 酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、二氢吡啶二羧酸合酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、丙酮酸羧化酶、磷 酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、转酮醇酶、转醛醇酶、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、 果糖1，6_ 二磷酸酶、高丝氨酸脱氢酶、烯醇丙酮酸磷酸羧激酶、琥珀酰CoA合成酶、甲基丙 二酰辅酶A变位酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰氨基酮基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨 基庚二酸脱琥珀酰酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱氢酶和二氨基庚二酸脱 羧酶。
13.根据权利要求1到12任一项所述的方法，其中从发酵肉汤中分离因此生产的吡啶二羧酸/盐。
14.包含如权利要求10中定义的吡啶二羧酸合成酶的编码序列的核酸序列。
15.表达盒，其包括至少一个如权利要求14中所述的核酸序列，该序列被有效地连接 到至少一个调控核酸序列。
16.重组载体，其包含至少一个如权利要求15中所述的表达盒。
17.原核或真核宿主，其用至少一个如权利要求16中所述的载体转化。
18.根据权利要求17所述的宿主，其选自重组棒状杆菌细菌，特别是重组棒杆菌属。
19.根据权利要求18所述的宿主，其是重组谷氨酸棒杆菌。
20.制备聚合物的方法，该方法包含a)通过权利要求1到12任一项所述的方法制备吡啶二羧酸/盐；b)分离吡啶二羧酸/盐；及c)用至少一种其他的多价可共聚的共聚单体聚合所述吡啶二羧酸/盐。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述可共聚的共聚单体选自多元醇和多胺及其 混合物。
全文摘要
本发明涉及通过培养重组微生物发酵生产吡啶二羧酸/盐的新方法，所述微生物表达具有吡啶二羧酸合成酶活性的酶。本发明还涉及相应的重组宿主和适于制备这样的宿主的重组载体、表达盒和核酸，以及使用通过发酵生产获得的吡啶二羧酸/盐制备聚酯或聚酰胺共聚物的方法。
文档编号C12P17/12GK101939440SQ200980104121
公开日2011年1月5日 申请日期2009年2月4日 优先权日2008年2月4日
发明者A·赫罗尔德, C·克洛普罗格, H·施罗德, O·策尔德尔, W·K·曾 申请人:巴斯夫欧洲公司