专利名称：用于培养干细胞衍生的心肌细胞的合成表面的制作方法
用于培养干细胞衍生的心肌细胞的合成表面优先权本申请要求2008年1月30日提交的美国临时申请61/062，921的优先权，其内容 作为整体在本文中引用作为参考。领域本发明涉及细胞培养制品及其使用方法，更具体地说，涉及适于支持干细胞衍生 的心肌细胞的培养的制品。背景多能干细胞如人类胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力， 在人体中形成任何成人细胞类型。这种独特的性能提供了用于开发对于大量严重的细胞退 化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、心脏病等的新治疗方法的潜力。例如，不像诸如皮肤或肝脏的 器官，心脏不能再生足量的心肌细胞来进行大修。因此，心脏修补可受益于心肌细胞，其能 从hESC或其它多能干细胞中分化出来，植入心脏中。但是，在开发这种基于hESC的治疗方法的过程中存在阻碍。这些阻碍包括在组织 培养中获得并保持适量的未分化的hESC并控制其分化以产生特定的细胞类型。干细胞培 养，如hES细胞培养通常用少量的来自细胞银行或细胞库的细胞做种，然后在未分化的状 态下扩增直至分化对于给定的治疗用途是所需的。为了达到这点，hESC或其分化的细胞目 前在含有动物衍生的成分的表面或介质(如滋养层、牛胎儿血清或MATRIGEL)存在下培养。 这些用于培养环境的动物衍生的添加物将细胞暴露于潜在有害的病毒或其它传染性试剂 下，这些有害的病毒或其它传染性试剂会转移到患者上或损害hESC的一般性培养和维持。 另外，这些生物产品具有批变异、免疫响应和存储寿命有限的缺点。已经采取一些步骤来在不含动物衍生的成分的介质中或表面上培养hESC。但是， hESC或其分化的衍生物的响应能以预测，因为表面或培养介质的成分改变。当然也有一些 优点。例如，已经在不含限定的血清的介质中培养hESC衍生的心肌细胞。虽然这种培养 体系不是完全排外的培养体系(当使用的基体含有动物衍生的成分如动物胶和MATRIGEL 时)，但是其确实提供了朝向hESC衍生的心肌细胞最终临床应用的步骤。作为进一步的例 子，一些合成表面被证明能够支持人类上皮干细胞分化为上皮细胞。但是，使用的体系依 赖用于细胞培养的血清介质，其仍然会潜在地导致上述对于所有生物动物衍生的成分的问 题。迄今为止，使用化学限定的介质和合成表面的完全不含动物的体系并未被证明可用于 培养干细胞或延伸自干细胞的细胞。简述本发明公开了，尤其是，可用于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的心肌细胞 的合成表面。在一个实施方式中，提供了用于培养干细胞衍生的心肌细胞的方法。该方法包括 在聚合物材料上沉积含有干细胞衍生的心肌细胞的悬浮液，并在细胞培养介质中培养沉积 的干细胞衍生的心肌细胞。所述聚合物材料包含选择的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物 或共聚物。
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在一个实施方式中，提供了干细胞衍生的心肌细胞的培养物。所述培养物包括具 有置于表面上的聚合物材料的制品。该培养物还包括置于聚合物材料上的干细胞衍生的心 肌细胞以及其中培养了干细胞衍生的心肌细胞的培养介质。所述聚合物材料包含选择的一 种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。在一个实施方式中，提供了用于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的心肌细胞 的细胞培养制品。所述制品包括具有表面和置于表面上的聚合物材料的基材。所述聚合物 材料包含选择的一种或多种丙烯酸酯单体的均聚物或共聚物。本文中提供的各种实施方式中的一种或多种提供了一种或多种相比用于培养干 细胞衍生的心肌细胞的现有表面的优点。例如，所述合成表面减少了与具有得自或衍生自 动物源的成分的表面相关的污染组织。这些表面还可提供相比具有生物成分的那些表面改 善的存储寿命。在化学限定的介质中培养干细胞衍生的心肌细胞的能力还减少了潜在的污 染组织。另外，在合成表面或化学限定的介质的能力下，批与批之间的变异会更少，导致培 养结果和预期的再现性改善。在结合附图阅读了本文后，这些及其它优点将从下述具体描 述中容易明白。
图IA-B是合成聚合物层涂覆的制品的侧视图。图2A-C是多壁细胞培养皿的截面图。该培养皿是未涂覆的(图2A)和涂覆的(图 2B-C)。图3是在实施例1中描述的制剂1㈧、制剂18⑶和MATRIGEL(C)的化学限定的 介质中和表面上培养的干细胞衍生的心肌细胞的荧光图像。绿Nkx 2. 5 ；红α -辅肌动蛋白。所述附图无需按比例绘制。图中使用的相同数字表示相同的成分、步骤等。但是， 应明白，在给定的图中使用数字来指代成分并不意味着限制另一张图中标有相同数字的成 分。另外，使用不同的数字指代成分并不意味着标有不同数字的成分不能是相同的或类似 的。
具体实施例方式在以下的详细描述中，对附图的参照构成其一部分，并且通过装置、体系和方法的 若干具体实施方式
进行说明。要理解，其它实施方式也是可期待的，并且可在不偏离本发明 的范围或精神的前提下作出。因此，下述详细描述并非是限制性的。本文中使用的所有科学和技术术语具有本领域使用的普通含义，除非另有说明。 本文中提供定义有助于理解本文中经常出现的某些术语，并不意味着限制本发明的范围。如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一”、“一种”和“该”包括复 数形式的实施方式，除非文本中清楚地另有说明。如本说明书和所附权利要求书中所使用 的，术语“或”通常包括“和/或”，除非文本中清楚地另有说明。除非另有说明，组合物(如溶液)中化合物的比例基于体积比。如本文中使用的，“具有”、“包括”、“包含”等以其开放的形式使用，通常是指“包 括，但不限于”。
如本文中使用的，术语“丙烯酸酯”包括含有丙烯酸酯部分或甲基丙烯酸酯部分的 化合物。丙烯酸酯部分是下式表示的部分CH2CHC(0)0-。甲基丙烯酸酯部分是下式表示的 部分=CH2C(CH3)C(0)0-。出于本发明的目的，术语“丙烯酸酯”包括表1中公开的具体化合 物。本文中使用的“丙烯酸酯”和“甲基丙烯酸酯”可互换，除了文本清楚地另有说明之外， 例如，当命名具体的化合物或化合物组时。本发明公开了，尤其是，具有用于培养干细胞衍生的心肌细胞的合成表面的制品 以及用于在该表面上培养干细胞衍生的心肌细胞的方法。在一些实施方式中，所述合成表 面与化学限定的介质结合使用以培养干细胞衍生的心肌细胞。所述表面可用于将干细胞如 hESC分化为心肌细胞。1.细胞培养制品参看图1，示出了用于培养细胞的制品100。该制品100包括具有表面15的基底 材料基材10。合成聚合物涂层20置于基底材料基材10的表面15上。尽管未示出，要理 解，合成聚合物涂层20可置于基底材料基材10的一部分上。基底材料10可以是任何适于 培养细胞的材料，包括陶瓷物质、玻璃、塑料、聚合物或共聚物，它们的任意组合，或者材料 之间的涂层。所述基底材料10包括玻璃材料，如钠钙玻璃、耐火玻璃、高硼硅酸耐热玻璃、 石英玻璃；硅；塑料或聚合物，包括树枝状聚合物如聚(氯乙烯)、聚(乙烯醇)、聚(甲基丙 烯酸甲酯)、聚(乙酸乙烯酯-马来酸酐)、聚(二甲基硅氧烷)单甲基丙烯酸酯、环烯烃聚 合物、氟碳聚合物、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯亚胺；共聚物如聚(乙酸乙烯酯-合-马来酸 酐)、聚(苯乙烯-合-马来酸酐)、聚(乙烯-合-丙烯酸)或者它们的衍生物等。适于细胞培养的制品100的例子包括单井和多井板，如6、12、96、384和1536井 板、罐、培养皿、烧瓶、烧杯、板、滚瓶、载玻片如有室的和多室的培养载玻片、试管、盖玻片、 杯、旋转瓶、灌注室、生物反应器和发酵桶。合成聚合物涂层20提供了其上可培养细胞的表面25。所述合成聚合物涂层20包 括聚合的(甲基)丙烯酸酯单体，选自下表1中提供的一组单体。其它材料(未示出)如 肽可加入或结合入合成聚合物表面以产生仿生表面。表1 丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯单体列表
权利要求
一种用于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的心肌细胞的细胞培养制品，包括具有表面的基材；置于所述表面上的聚合物材料，其中所述聚合物材料包括(i)由二丙烯酸四(乙二醇)酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯、1，4 丁二醇二甲基丙烯酸酯或聚(乙二醇)二丙烯酸酯形成的均聚物，或者(ii)由以下物质形成的共聚物二丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸甘油酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸甘油酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸甘油酯和1，4 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸甘油酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯；二甲基丙烯酸三乙二醇酯和1，4 丁二醇二甲基丙烯酸酯；聚(乙二醇)二丙烯酸酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸四乙二醇酯；二丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和新戊二醇乙氧基化二丙烯酸酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，6 己二醇乙氧基化二丙烯酸酯；1，6 己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯；1，6 己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯；1，6 己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1EO/OH)甲基二丙烯酸酯；1，6 己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和1，6 己二醇乙氧基化二丙烯酸酯；新戊二醇二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1EO/OH)甲基二丙烯酸酯；或新戊二醇二丙烯酸酯和1，6 己二醇乙氧基化二丙烯酸酯。
2.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述聚合物材料包括由二丙烯酸四(乙二 醇)酯或二甲基丙烯酸甘油酯形成的均聚物，或者由以下物质形成的共聚物(i) 二甲基丙 烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯，(ii) 二甲基丙烯酸甘油酯和二甲基丙烯 酸三(乙二醇)酯，(iii) 二甲基丙烯酸甘油酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯，(iv) 二丙 烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
3.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述聚合物材料主要由下述物质构成由二 丙烯酸四(乙二醇)酯或二甲基丙烯酸甘油酯形成的均聚物，或者由以下物质形成的共聚 物(i) 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯，( ) 二甲基丙烯酸甘油 酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯，(iii) 二甲基丙烯酸甘油酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯 酸酯，(iv) 二丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
4.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述置于制品表面上的聚合物材料的表面 积大于约5mm2。
5.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述制品由下述方法制造 在挥发性有机溶剂中稀释一种或多种单体；将稀释的单体沉积在制品的基材表面上；蒸发基本上所有的溶剂；以及聚合所述单体形成附着在表面上的聚合物层。
6.如权利要求6所述的制品，其特征在于，所述挥发性溶剂是乙醇。
7.如权利要求1所述的制品，其特征在于，它还包括井，其中，其上沉积所述聚合物材 料的基材的表面位于所述井中。
8.如权利要求1所述的制品，其特征在于，所述制品选自多井板、皮氏培养皿、烧杯、管 和烧瓶。
9.一种干细胞衍生的心肌细胞的培养物，包括 包含置于表面上的聚合物材料的制品；置于所述聚合物材料上的干细胞衍生的心肌细胞；以及 培养介质，其中培养所述干细胞衍生的心肌细胞， 其中，所述聚合物材料包括(i)由二丙烯酸四(乙二醇)酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯、1， 4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯或聚(乙二醇)二丙烯酸酯形成的均聚物，或者 ( )由以下物质形成的共聚物二丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸甘油酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸甘油酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸甘油酯和1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸甘油酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯；二甲基丙烯酸三乙二醇酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯；聚(乙二醇)二丙烯酸酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸四乙二醇酯；二丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯；三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和新戊二醇乙氧基化二丙烯酸酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯；·1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯；·1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯；·1，6_己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1E0/0H)甲基二丙烯酸I,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯； 新戊二醇二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1E0/0H)甲基二丙烯酸酯；或 新戊二醇二丙烯酸酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯。
10.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述聚合物材料包括由二丙烯酸四(乙 二醇)酯或二甲基丙烯酸甘油酯形成的均聚物，或者由以下物质形成的共聚物(i) 二甲基 丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯，(ii) 二甲基丙烯酸甘油酯和二甲基丙 烯酸三(乙二醇)酯，(iii) 二甲基丙烯酸甘油酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯，(iv) 二 丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
11.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述聚合物材料主要由下述物质构成 由二丙烯酸四(乙二醇)酯或二甲基丙烯酸甘油酯形成的均聚物，或者由以下物质形成的 共聚物(i) 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯，( ) 二甲基丙烯酸 甘油酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯，(iii) 二甲基丙烯酸甘油酯和1，4_ 丁二醇二甲基 丙烯酸酯，(iv) 二丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯。
12.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述培养介质是化学限定的介质。
13.如权利要求9所述的培养物，其特征在于，所述干细胞衍生的心肌细胞是人类胚胎 干细胞衍生的心肌细胞。
14.一种培养干细胞衍生的心肌细胞的方法，包括将包含干细胞衍生的心肌细胞的悬浮液沉积在聚合物材料上；以及 在细胞培养介质中培养所述沉积的干细胞衍生的心肌细胞，其中，所述聚合物材料包括(i)由二丙烯酸四(乙二醇)酯、二甲基丙烯酸甘油酯、二甲基丙烯酸三乙二醇酯、1， 4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯或聚(乙二醇)二丙烯酸酯形成的均聚物，或者 ( )由以下物质形成的共聚物二丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯； 二甲基丙烯酸甘油酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸甘油酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸甘油酯和1，4-丁二醇二甲基丙烯酸酯； 二甲基丙烯酸甘油酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯； 二甲基丙烯酸三乙二醇酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯； 聚(乙二醇)二丙烯酸酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸四乙二醇酯； 二丙烯酸四(乙二醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯； 三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和新戊二醇乙氧基化二丙烯酸酯； 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二丙烯酸四(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸二(乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯； 二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯； 二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯；二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯；(1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和聚(乙二醇)二丙烯酸酯；(1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷苯甲酸酯二丙烯酸酯；(1，6_己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1E0/0H)甲基二丙烯酸(1,6-己二醇丙氧基化物二丙烯酸酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯；新戊二醇二丙烯酸酯和三羟甲基丙烷乙氧基化(1E0/0H)甲基二丙烯酸酯；或新戊二醇二丙烯酸酯和1，6_己二醇乙氧基化二丙烯酸酯。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在细胞培养介质中培养所述沉积的干细 胞衍生的心肌细胞包括在化学限定的介质中培养心肌细胞。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二丙烯酸四(乙二 醇)酯形成的均聚物。
17.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二甲基丙烯酸二 (乙二醇)酯和新戊二醇二甲基丙烯酸酯形成的共聚物。
18.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二甲基丙烯酸甘 油酯形成的均聚物。
19.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二甲基丙烯酸甘 油酯和二甲基丙烯酸三(乙二醇)酯形成的共聚物。
20.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二甲基丙烯酸甘 油酯和1，4_ 丁二醇二甲基丙烯酸酯形成的共聚物。
21.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述聚合物材料包含由二丙烯酸四(乙二 醇)酯和三羟甲基丙烷三丙烯酸酯形成的共聚物。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述干细胞衍生的心肌细胞是人类胚胎 干细胞衍生的心肌细胞。
全文摘要
适于培养干细胞衍生的心肌细胞的合成表面包含由一种或多种丙烯酸酯单体形成的丙烯酸酯聚合物。在许多情况下，所述丙烯酸酯表面适于在化学限定的介质中培养干细胞衍生的心肌细胞。
文档编号C12N5/077GK101939418SQ200980103922
公开日2011年1月5日 申请日期2009年1月29日 优先权日2008年1月30日
发明者C·B·绍戈本, R·勃兰登布格尔, 周悦 申请人:杰龙公司;康宁股份有限公司