用于乳品发酵的具有独特流变性质的嗜热链球菌菌株的遗传簇的制作方法

专利名称：用于乳品发酵的具有独特流变性质的嗜热链球菌菌株的遗传簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于乳品发酵的具有独特流变性质的嗜热链球菌(S. thermophilus) 的遗传簇(genetic cluster)。
背景技术：
单独地、或与其他嗜热链球菌菌株组合、或与其他微生物组合，嗜热链球菌菌株被广泛地用于发酵食品的生产。例如，它们被包括在用于酸奶生产的起始培养物的制剂中。嗜热链球菌的菌株预计通过酸化奶参与了乳凝块的形成以及参与了发酵产品的质地的形成。 因而，嗜热链球菌菌株的一般特征在于它们的功能性质，即，它们的酸化和质地化性质。质地化菌株是一种能够允许获得发酵奶的菌株，所述发酵奶可以由它们的流变性质，例如，粘度和成丝性(ropiness)来描述。迄今为止已知的质地化嗜热链球菌菌株可以根据这些流变性质分成三个组1)高粘度和高成丝性，幻低粘度和低成丝性，以及幻平均粘度和成丝性。然而，感兴趣的是拥有具有能获得高粘度和低成丝性发酵奶的流变性质的嗜热链球菌菌株。因而，本发明要解决的问题之一是提供新的嗜热链球菌菌株，其产生具有高粘度和低成丝性的发酵奶。发明概述在他们的研究期间，本发明人已发现了用于乳品发酵的具有独特流变性质的嗜热链球菌菌株的新的遗传簇用本发明的菌株发酵的奶具有高粘度和低成丝性。发明人还发现，除了这些独特的流变性质之外，这些菌株的基因组令人惊讶地包含具有SEQ ID N0:1的序列的CRISIS基因座，其是迄今为止未知的。CRISPR(聚簇的规律间隔的短回文重复(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic R印eats))是高度多态性的基因座，已知其赋予对噬菌体的抗性(Barrangou 等人，Science. 2007 Mar 23 ；315 (5819) :1709-12 ；Horvath 等人，J Bacteriol. 2008Feb ； 190 (4) :1401-12 ；Deveau 等人，J Bacteriol. 2008Feb ； 190 (4) 1390-400)。CRISIS基因座包含短的、保守的DNA重复，这些DNA重复由类似大小的名为间隔区(spacer)的独特序列分隔。对间隔区核苷酸序列和间隔区排列而言，间隔区含量对任何给定的菌株家族是特异性的(Horvath等人，J Bacteriol. 2008Feb ； 190 (4) :1401-12)。在嗜热链球菌基因组中，取决于菌株，可以同时存在多达三个CRISIS基因座。已经提出的是， CRISPR基因座是嗜热链球菌基因组中最快速进化的区域，因而是对于考虑菌株分化和鉴定非常相关的靶点(Bolotin 等人 Microbiology. 2005 年 8 月；151 (Pt 8) :2551-61 ；Horvath 等人 J Bacteriol. 2008 年 2 月；190 (4) :1401-12)。因此，得益于这种新的CRisra序列，本发明的嗜热链球菌的菌株可以容易地鉴定在它们的基因组中具有相同CRisra序列的嗜热链球菌菌株可以被鉴定为同一菌株家族的成员，从而享有相同的技术性能，即，如上文所描述的独特的流变性质。因而，在第一个方面，本发明涉及嗜热链球菌的菌株，其中用所述菌株发酵的奶具有在用测试A测量时大于约55Pa. s的粘度，以及用测试B测量时小于约0. 015秒的Caber 相对破裂时间(Caber Relative Break-up Time)。在另一个方面，本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的CRisra基因座。本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含CRisra基因座，所述 CRISPR 基因座包含选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :6, SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :11 和SEQ ID NO 12的核苷酸序列。本发明的另一个目的是根据布达佩斯条约以Danisco Deutschland GmbH的名义于2008年10月7日以编号DSM 21892保藏在德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)的嗜热链球菌菌株。本发明还涉及包含根据本发明的菌株的细菌组合物。本发明的再另一个目的是制备发酵的乳制品的方法，其中所述方法包括用根据本发明的嗜热链球菌菌株或用上文定义的细菌组合物发酵奶底物。本发明还涉及可通过上文定义的方法获得的乳制品。本发明还涉及根据本发明的菌株或根据本发明的细菌组合物用于制备发酵的乳制品的用途。本发明的主题还在于包含根据本发明的菌株或上文定义的细菌组合物的乳制品。发明的详细说明在第一个方面，本发明涉及嗜热链球菌的菌株，其中用所述菌株发酵的奶是高粘度和弱成丝性的。一般地，用本发明的菌株发酵的奶具有当用测试A测量时大于约55Pa. s 的粘度，以及当用测试B测量时小于约0. 015秒的Caber相对破裂时间。一般地，用根据本发明的菌株发酵的奶的上文提及的粘度大于约56、57、58、59、60 或611 . S。此外，所述粘度一般低于801 . S。特别地，所述粘度低于75、70或651 . S。再一般地，上述用本发明的菌株发酵的奶具有当用测试B测量时0到0. 015秒的 Caber相对破裂时间。特别地，所述Caber相对破裂时间低于约0. 014,0. 013,0. 012,0. 011 或0. 010秒。在本发明的范围内，涵盖了上述粘度和Caber相对破裂时间的值的任何组合。根据本发明，用本发明的菌株发酵的奶的粘度是通过测试A测量的。在实验小节完全描述了这种测试。简要地，根据测试A测量粘度包括以下步骤1)通过以下操作获得用嗜热链球菌菌株发酵的奶-用3%脱脂奶粉补充的商售半脂UHT奶(脂肪在90°C加热10分钟，-在即将接种之前添加lg/100L(w/v)的甲酸钠，-用在奶基培养基中-80°C保存的嗜热链球菌菌株以1.106CfU/ml奶接种奶，-在水浴中在43°C士 1°C的恒定温度下孵育接种的奶，直到pH值达到4. 60士0. 1， pH值用Cinac系统测量，-将发酵的奶冷却到6°C，然后-在6°C保藏所述发酵的奶14天，2)通过以下操作在8°C 士2°C的温度下测量根据步骤1)获得的发酵的奶的粘度
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— 布氏粘度计(Brookfield Engineering laboratories, Inc.)固定在 helipath支架上，-给所述粘度计装上C型T字转轴(T-barspindle)，-用发酵的奶填满125mL玻璃酸奶罐，-将填满发酵的奶的酸奶罐放入粘度计中，-给粘度计施加IOrpm的速度，然后-在30秒的旋转之后，读取样品的粘度。根据本发明的Cinac系统是例如以下参考文献中描述的CINAC，控制乳起始物的自动系统；Corrieu-G, Picque-D, Perret-B, Quemener-P ；Process Magazine ； 1992 ； no.1068 ；p.24-27。在本发明的含义内，相对破裂时间是当用毛细管破裂拉伸流变仪测量时，在20°C 的温度下，流体丝从^ym的直径开始直到它断裂所需的时间，具有士 8%的标准偏差。根据本发明，发酵的奶的Caber相对破裂时间通过测试B来测量。在实验小节完全描述了这种测试。简要地，根据测试B测量粘度包括以下步骤1)如测试A的步骤1)所描述的获得用嗜热链球菌菌株发酵的奶，2)通过以下操作测量嗜热链球菌菌株发酵的奶的Caber相对破裂时间-将步骤1)获得的发酵的奶的样品加温到20°C，-用标准的塑料匙搅动20次来破坏和勻化胶冻，-将60μ L勻化的发酵的奶置于具有以下设置的毛细管破裂拉伸流变仪(CaBER 1，来自 HAAKE，THERMO ELECTRON Corp.)的两个板之间-板直径6mm-初始高度2mm-最终高度9.65mm-击打速度0.24mm/ms (击打时间40ms)-激光测微器在红外区工作且具有10μ m分辨率的1类激光器，然后-测量样品的相对破裂时间。在另一个方面，本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含具有SEQ ID NO 1的核苷酸序列的CRISIS基因座。本发明的嗜热链球菌菌株的CRisra基因座的序列SEQ ID NO :1 (前导区(leader) 到尾随区(trailer)方向，Horvath 等人，J Bacteriol. 2008Feb ； 190 (4) :1401-12)显示如下重复区为大写字母，间隔区为小写字母5，-GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtaaatttattaatatcatcccatcgatctg GTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACggataaggcgagacaagaacaacttaagcaGTTTTTGTACT CTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgcgaccatgtaacgccggtagaaatagcgGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAA GTAACTGTACAACcaagggagtcgaacccctgacagccaacaaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACA ACcgctatgaatgtcgtattaaaagcttttaaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACgacttaggg cgctaccccttaaaaatagcaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcttatataaaagaaagacag aaatattctaGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACaacaatggctaagaaattcagccctaacgcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACacgtttcctaaatgcatgaaaatcgcaaacgGTTTTTGTACT CTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACcccctacgaaattttaaaacgacccccccgcGTTTTTGTACTCTCAAGATTT AAGTAACTGTACAACtacctacccatggaacgattactatgcagcGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTA CAATgggaagttataattacgaaaaggtagatatGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAACtatgtca ccacgttgcaaccctacaccactGTTTTTGTACTCTCAAGATTTAAGTAACTGTACAAT-3，SEQ ID NO :1含有几乎相同的14个重复区；仅第十二个和第十四个重复区在它们的3'末端处具有一个不同的碱基(T而不是C)。这些重复区限定了 13个间隔区，全部是独特的，并且不同于 GenBank(登记号 CP000023、CP000024、CP000419、DQ072985 到 DQ073008 以及 EF434458 到 EF434504)中存在的或 Horvath 等人(J Bacteriol. 2008Feb ； 190 (4) 1401-12)描述的971个非冗余嗜热链球菌CRISIS间隔区序列。这个观察结果表明，本发明的嗜热链球菌菌株拥有独特的遗传特征，其可以用于明确地鉴定和跟踪这些技术上独特的菌株。本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含具有SEQ ID NO 1的衍生物的核苷酸序列的CRisra基因座。根据本发明，SEQ ID NO 1的衍生物是与SEQ ID NO=I具有至少90%的同一性、 特别是与SEQ ID NO :1具有至少95%的同一性、更特别地与SEQ ID NO :1具有至少98%的同一性，和最特别地与SEQ ID NO :1具有至少99%的同一性的核苷酸序列。为了确定两个核酸序列的同一性百分比，序列被对齐用于最佳比较。例如，缺口 (gap)可被引入第一核酸序列的序列中用于与第二核酸序列的最佳比对(alignment)。然后比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置处相同的核苷酸占据时，则核酸在该位置是相同的。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同核苷酸的数量的函数。因此，同一性[相同的核苷酸的数量/重叠位置的总数]X 100。通过在比较窗口上比较两个最佳地对齐的序列，确定两个序列中存在相同核酸碱基(例如，A、T、C、G) 的位置的数量来产生匹配位置的数量(上述公式中“相同位置的数量”)，匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数(例如，窗口大小)(上述公式中“重叠位置的总数”)，结果乘以100来产生序列同一性的百分比，由此根据这个公式来计算序列同一性的百分比。在这种比较中，序列可以是长度相同，或可以是长度不同的。用于确定比较窗口的序列最佳比对可以通过Smith和Waterman (1981)的局部同源性算法、Needleman和 Wunsh(1972)的同源性比对算法、通过Pearson和Lipman(1988)方法的相似性检索、这些算法的计算机化的实现(Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0 中的 GAP、BESTFIT、FASTA 禾口 TFASTA, Genetic Computer Group, 575, Science Drive, Madison, Wisconsin)或通过目测来进行。一般地，与SEQ ID NO 1具有至少90%同一性的衍生物包含例如每个间隔区和重复区平均数量3个的突变，即，81个突变。技术人员容易理解的是，“每个间隔区和重复区平均数量3个的突变”是指一个或多个重复区或间隔区可以包含超过3个突变，即，4、5、6、 7或更多个，而其他间隔区或重复区可以包含少于3个突变，例如，2、1或0个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量895-81 = 814
重叠位置的总数895同一性百分比(814/895)*100 = 90.9%。一般地，与SEQ ID NO 1具有至少95%同一性的衍生物包含例如每个间隔区平均数量3个的突变，即，39个突变。技术人员容易理解的是，“每个间隔区平均数量3个的突变”是指一个或多个间隔区可以包含超过3个突变，S卩，4、5、6、7或更多个，而其他间隔区可以包含少于3个突变，例如，2、1或0个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量895-39 = 856重叠位置的总数895同一性百分比(856/895)*100 = 95.6%。一般地，与SEQ ID NO 1具有至少98%同一性的衍生物包含例如每个间隔区平均数量1个的突变，即，13个突变。技术人员容易理解的是，“每个间隔区平均数量1个的突变”是指一个或多个间隔区可以包含超过1个突变，例如，2、3、4、5、6、7或更多个，而其他间隔区可能不包含任何突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量895-13 = 882重叠位置的总数895同一性百分比(882/895)*100 = 98. 5%0一般地，与SEQ ID NO :1具有至少99%的同一性的衍生物在它的序列中，特别是间隔区中，包含例如一个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量895-1 = 894重叠位置的总数895同一性百分比(894/895)*100 = 99. 8% .如在此使用的，“突变”是指核苷酸序列的核苷酸的缺失、替换或插入。因此，其基因组包含对应上文定义的SEQ ID NO :1的衍生物序列的CRISIS序列的嗜热链球菌菌株，将具有根据本发明的流变性质。此外，由于SEQ ID NO=I的13个间隔区全部是独特的并且不同于迄今为止已知的其他嗜热链球菌CRisra间隔区序列，在嗜热链球菌菌株的基因组中由上述重复区分隔的至少三个上述连续间隔区的检出足以鉴定根据本发明的嗜热链球菌菌株，即，具有上文提及的流变性质的嗜热链球菌菌株。至少三个间隔区/重复区的检出不是随意的。实际上， 当前对CRISIS序列进化的方式的理解表明，嗜热链球菌菌株(与根据本发明的菌株不相关的)含有这些间隔区中的一个的概率是显著的；含有这些连续间隔区中的两个是罕有的， 含有这些连续间隔区中的三个是非常少见的。因而本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含CRisra 基因座，所述 CRISPR 基因座包含选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO 12的核苷酸序列。这些序列SEQ ID NO :2到12，对应CRISPR基因座的由2个重复区分隔的3个连续间隔区。
本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含CRisra基因座，所述 CRISPR 基因座包含选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO :6, SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO :11 和SEQ ID NO 12的核苷酸序列的衍生物。根据本发明，SEQID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO: 12 的衍生物是分别与 SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO :7,SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10,SEQ ID NO :11 或 SEQ ID NO: 12具有至少90%的同一性、特别是至少94%的同一性、更特别地至少96%的同一性、最特别地至少99%的同一性的核苷酸序列。同一性百分比如上文描述的计算。一般地，与SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 12之一具有至少90%同一性的衍生物包含例如每个间隔区和重复区平均数量3个的突变，BP, 15个突变。技术人员容易理解的是， “每个间隔区和重复区平均数量3个的突变”是指一个或多个重复区或间隔区可以包含超过 3个突变，即，4、5、6、7或更多个，而其他间隔区或重复区可以包含少于3个突变，例如，2、1 或0个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量163-15 = 148重叠位置的总数163同一性百分比(148/163)*100 = 90.8%。一般地，与SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 12之一具有至少94%同一性的衍生物包含例如每个间隔区平均数量3个的突变，即，9个突变。技术人员容易理解的是，“每个间隔区平均数量3个的突变”是指一个或多个间隔区可以包含超过3个突变，即，4、5、6、7或更多个，而其他间隔区可以包含少于3个突变，例如，2、1或0个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量163-9 = 154重叠位置的总数163同一性百分比(154/163)*100 = 94.4%。一般地，与SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 12之一具有至少96%同一性的衍生物包含例如每个间隔区和重复区平均数量1个的突变，即，5个突变。技术人员容易理解的是， “每个间隔区和重复区平均数量1个的突变”是指一个或多个重复区或间隔区可以包含超过 1个突变，例如，2、3、4、5个，而其他间隔区或重复区可能不包含任何突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量163-5 = 158重叠位置的总数163同一性百分比(158/163)*100 = 96. 9% 一般地，与SEQ ID NO 2到SEQ ID NO 12之一具有至少99%的同一性的衍生物在它的序列中，特别是间隔区中，包含例如一个突变。因而如下计算同一性百分比相同位置的数量163-1 = 162
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重叠位置的总数163同一性百分比(162/163)*100 = 99. 3%0因此，其基因组包含对应如上文定义的SEQ ID NO 2到12的任一个的衍生物序列的CRisra序列的嗜热链球菌菌株，将具有根据本发明的流变性质。在嗜热链球菌菌株的基因组中SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 12或其衍生物的存在可以由技术人员通过任何已知的方法容易地检测。例如，技术人员可以容易地使用在间隔区的序列中选定的引物进行PCR，或用对应间隔区的探针进行DNA-DNA杂交，或对菌株的基因组中一个或几个CRISIS基因座进行测序。因而，本发明还涉及预测菌株的菌株家族成员性的方法，所述菌株的基因组包含 SEQ ID NO 1到SEQ ID NO 12或其衍生物的核苷酸序列。一般地，属于上文定义的嗜热链球菌菌株的遗传簇的菌株具有独特的流变性质。 在本发明的意义上，独特的流变性质是指菌株所产生的发酵的奶，当用测试A测量时具有大于约55Pa. s的粘度，当用测试B测量时具有小于约0. 015秒的Caber相对破裂时间；测试A和B是如上文定义的。一般地，根据本发明的菌株是根据布达佩斯条约以Danisco Deutschland GmbH的名义于2008年10月7日以编号DSM 21892保藏在位于hhoffenstr. 7B, D-38124Braunscheiwg, Germany的德国微生物菌种保藏中心的嗜热链球菌菌株，或保持了相同的流变性质的其突变体。为了获得这样的突变菌株，本领域的技术人员可以使用普通的诱变技术，例如，UV 照射或暴露于诱变化学产品(乙基-甲烷-磺酸酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、核苷酸碱基类似物例如溴尿嘧啶以及吖啶等等)，但是可以想到，任何其他有效的诱变剂将是合适的。在一个实施方式中，所述突变菌株是噬菌体不敏感的。菌株对噬菌体的敏感性的谱(也称为溶菌型)由对所述噬菌体的所有的敏感性和抗性构成。例如，在W02008040734 中充分描述了测定嗜热链球菌菌株的溶菌型和由此它对噬菌体感染的敏感性的方法。根据常规的诱变技术，诱变之后是适当地选择具有本发明的菌株的独特流变性质的菌株，其可以通过上文定义的测试A和B来测量。本发明的一个特定对象是根据布达佩斯条约以Danisco Deutschland GmbH的名义于2008年10月7日以编号DSM 21892保藏在德国微生物菌种保藏中心的嗜热链球菌菌株。本发明还涉及包含根据本发明的菌株的细菌组合物。细菌组合物是指不同菌株， 特别是起始培养物或发酵剂的混合物。根据本发明的优选的菌株的混合物是嗜热链球菌与其他嗜热链球菌的混合物，或嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种(LactcAacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)的混合物，或嗜热链球菌与其他乳杆菌和/或与双歧杆菌的混合物，或嗜热链球菌与乳球菌的混合物，或嗜热链球菌与乳细菌和/或酵母菌的其他菌株的混合物。本发明的另一个目的是制备发酵的乳制品的方法，其中所述方法包括用根据本发明的嗜热链球菌菌株或用上文定义的细菌组合物发酵奶底物。
—般地，所述奶底物是脱脂或不脱脂的天然或重构的奶，或奶基培养基或基于乳品来源的产品的培养基。这种奶底物可以包含通常用于制备奶甜品的物质。一般地，所述通常用于制备奶甜品的物质是固体物质，例如如水果、巧克力薄片或谷类，以及甜食或液体巧克力。本发明还涉及可通过上文定义的方法获得的乳制品。本发明还涉及根据本发明的菌株或根据本发明的细菌组合物用于制备发酵的乳制品的用途。本发明的主题还在于包含根据本发明的菌株或上文定义的细菌组合物的乳制品。在本发明的意义内，“乳制品”是指发酵的奶、酸奶、成熟的奶油、干酪、清爽干酪(fromage frais)、奶饮料、乳制品滞留物、加工干酪、奶油甜品、松软干酪(cottage cheese)或婴儿奶。更一般地，根据本发明的乳制品包括动物和/或植物来源的奶。下文通过随后的实施例更好地说明本发明。这些实施例仅以说明本发明的主题的方式给出，它们决不构成限制。附图的简要说明

图1 在六份发酵的奶中，感官性质“成丝性”水平和用CaBERl测量的相对破裂时间(RBT)之间的关系。图2 用14种不同的嗜热链球菌菌株发酵的14份奶的流变特性、粘度和相对破裂时间。实施例新鲜的发酵奶的成丝性和粘度评估新鲜的发酵奶的制备根据以下实验条件制备了发酵奶奶基质的制备商售的半脂UHT牛奶(脂肪1.5^^/4+3%脱脂奶粉在90°C热处理10分钟。在即将接种之前，添加lg/100L(w/v)的甲酸钠。接种接种用_80°C保存在奶基培养基中的菌株进行。接种率是1. 106CfU/ml奶基质。发酵:孵育温度设置在43°C 士 1°C，在发酵期间在水浴中保持恒定。Cinac系统(CINAC， 用于乳起始物控制的自动系统；Corrieu-G，Picque-D, Perret-B, Quemener-P ；Process Magazine ； 1992 ；no. 1068 ；p. 24-27)用于 pH 值变化的在线测量。在 pH 4. 60 士 0. 1 下，发酵的产品冷却到6°C，然后在6°C保存14天。对于成丝性的评估，进行两种不同的技术。第一种基于拉伸流变学测量，第二种基于感官评估。拉伸流变仪CaBER 1评估新鲜的发酵奶的拉伸性质的描述和原理拉伸流变测定法的构思类似于剪切流变测定法。但是不是通过在剪切中施加已知的力和测量产生的位移来获得剪切粘度，而是在拉伸中进行类似的操作。所述力是单方向施加的。这个原理容许测量给定产品的质地的弹性成分。毛细管破裂拉伸流变仪(来自HAAKE，THERMO ELECTRON公司的CaBER 1装置)是被设计以评估产品的拉伸粘度的装置。它由Cambridge Polymer Group (G. H. Mckinley等人 J. Rheo. 2000 44(3) :653-70 ;S. L. Anna 等人 J. Rheo. 200145 (1) :115-38)开发。为了测量拉伸粘度，60 μ 1新鲜的发酵奶置于2个平行的圆板之间。通过向上移动顶版，产物进行快速的拉伸，形成流态丝。然后，激光测微器测量变细的细丝的直径。逐渐变细的流态丝的中点直径在顶板到达它的最终位置之后开始测量。装置记录流态丝的变细(每秒1000次测量)。细丝直径随时间的改变可以进行制图。这容许测定细丝的起始直径和它的破裂时间。发明人开发了具体的方案来评估新鲜的发酵奶的破裂时间值。如上所述制备新鲜的发酵奶。样品加温到20°C。通过使用标准塑料匙搅动(20次搅动)来破坏和勻化胶冻。 样品的等分量使用 Multipette Plus (Eppendorf)和 0. 5ml combitips (Eppendorf)采集。 60 μ 1置于CaBER的2个平板之间。使用以下的CaBER设置平板直径:6mm初始高度2mm最终高度9.65mm击打速度0. 24mm/ms (击打时间40ms)对于每个样品，进行4次测量。用于鉴定样品的拉伸粘度的数据是相对破裂时间 (RBT)。RBT是流态丝从55 μ m的直径开始直到它破裂所需的时间。所述方法的标准偏差被计算为是士8%。通过感官品尝的成丝性评估“成丝性”描述指标(descriptor)的训练感官品尝过程涉及3位专业鉴定者。这些鉴定者被要求在盲条件(发酵奶被编号)下评估产品的具体质地描述指标“成丝性”。如下评估“成丝性”将一匙发酵奶在杯子上几厘米倾斜，评估产品连续地运动和形成不破裂的丝状粘质的能力。发酵奶从“无成丝性”发酵奶(没有丝状粘质)的等级0到高“成丝性”发酵奶(长的不破裂的丝状粘质)的等级4分级。然后，由3名鉴定者认可一致的等级。报告这种感官等级。为了在“成丝性”描述指标的评估中训练专业鉴定者，使用3种参考菌株制备了 3 种发酵奶。-等级0用菌株CNCM 1-2429制备的发酵奶的成丝性-等级2用菌株CNCM 1-2423制备的发酵奶的成丝性-等级4用菌株CNCM 1-2980制备的发酵奶的成丝性新鲜的发酵奶的测试根据上文描述的方案生产六种新鲜的发酵奶。通过用如下六个单独的菌株分别接种来获得新鲜的发酵奶DSM 21892、CNCMI-3617、DSM 18344,CNCM I-2429,CNCM H423和 CNCM 1-2980。菌株CNCM 1-2429、CNCM 1-2423、CNCM 1-2980 和 CNCMI-3617 是例如在 2007 年 10月2日由Danisco A/S提交的公开的专利申请W008/040734中提及的。菌株DSM 18344 是例如在2007年6月8日由Danisco A/S提交的W007/144770中提及的。用CNCM 1- 获得的发酵奶的成丝性评估为等级0，如所预计的。类似地，用 CNCM I-M23和CNCM H980获得的发酵奶分别评估为等级2和等级4 (参见图1)；因而证实从其它发酵奶获得的数据。用DSM 21892制备的发酵奶的成丝性评估得到0的感官等级。 用CNCM 1-3617和DSM 18344制备的发酵奶的成丝性评估的感官等级分别是1和3 (参见图1)。感官的成丝性水平与RBT值相关还使用CaBERl对测试的六份发酵奶测量RBT值。总体上，感官的成丝性提高与 Caber相对破裂时间的提高相关(图1)。这个结果表明，两个参数是紧密联系的。用DSM 21892制备的发酵奶的相对破裂时间值与用菌株CNCM 1-2429制备的发酵奶的相对破裂时间值一样低(即，< 0.01 )。参考的高成丝性菌株CNCM H980具有高水平的这个参数 (0. 118s)。用菌株DSM 21892发酵的奶呈现独特的流变特性，其可以是高稠度和弱成丝性的。布氏粘度计(Brookfield Engineering laboratories, Inc.)用于评估粘度。装置安装在 helipath 支架(Brookfield Engineering laboratories, Inc.)上。粘度计装备有C型T字转轴，施加的速度是lOrpm。在8°C 士2°C的温度下测量粘度，在旋转30秒后读取。一般认为的是，粘度水平与感官品尝过程所评估的稠度特征水平直接相关(参见专利 WO 2004/085607 A2)。图2报告了用14种不同的嗜热链球菌菌株产生的14份新鲜的发酵奶的粘度和相对破裂时间响应(RBT)的相对定位。菌株CNCM I-2429,CNCM 1-2423,CNCM I-2980,CNCM 1-3617 是例如在 2007 年 10 月2日由Danisco A/S提交的公开的专利申请W008/040734中提及的。作为一般趋势，新鲜的发酵奶的粘度随着RBT值线性地提高，除了菌株DSM 21892 之外，其保持了低RBT值，尽管粘度变得显著地高，超过55Pa. s。结论迄今为止从未预期的，这些独特的流变性质的组合，S卩，低成丝性和高粘度，为根据本发明的菌株赋予了非常有前途的应用，特别是对于具有从未提出过的独特的和新的质地的新乳制品的开发。参考文献在整个申请中，各种参考文献描述了本发明所属技术领域的现有技术状况。这些参考文献的公开内容通过引用合并在本公开中。
权利要求
1.嗜热链球菌的菌株，其中用所述菌株发酵的奶具有当用测试A测量时大于约55 .S 的粘度和当用测试B测量时小于约0. 015秒的Caber相对破裂时间。
2.嗜热链球菌的菌株，其中所述菌株的基因组包含具有SEQID NO :1或其衍生物的核苷酸序列的CRISIS基因座，所述衍生物具有与SEQ ID NO :1至少90%的同一性，特别是与 SEQ ID NO :1至少95%的同一性，更特别地与SEQ ID NO :1至少98%的同一性，以及最特别地与SEQ ID NO 1至少99%的同一性。
3.嗜热链球菌的菌株，其中所述菌株的基因组包含CRisra基因座，所述CRisra基因座包含选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7, SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :11 禾口 SEQ ID NO :12 或其衍生物的核苷酸序列，所述衍生物具有与SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO 12至少90%的同一性、特别是至少94%的同一性、更特别地至少96%的同一性、最特别地至少99%的同一性。
4.根据权利要求2或3的菌株，其中用所述菌株发酵的奶具有当用测试A测量时大于约55Pa. s的粘度和当用测试B测量时小于约0. 015秒的Caber相对破裂时间。
5.根据权利要求1-4的任一项的菌株，其中所述菌株是根据布达佩斯条约以Danisco Deutschland GmbH的名义于2008年10月7日以编号DSM 21892保藏在德国微生物菌种保藏中心的嗜热链球菌菌株或其突变体。
6.根据布达佩斯条约以DaniscoDeutschland GmbH的名义于2008年10月7日以编号DSM 21892保藏在德国微生物菌种保藏中心的嗜热链球菌菌株。
7.细菌组合物，包含权利要求1-6的任一项中定义的菌株。
8.一种制备发酵的乳制品的方法，其中所述方法包括用权利要求1-6的任一项中定义的菌株或用权利要求7中定义的细菌组合物发酵奶底物。
9.根据权利要求8的方法，其中所述奶底物是脱脂或不脱脂的天然或重构的奶，或奶基培养基或基于乳品来源的产品的培养基。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所述奶底物包含通常用于制备奶甜品的物质，特别是固体物质，例如，水果、巧克力薄片或谷物；甜食或液体巧克力。
11.可通过权利要求8-10的任一项中定义的方法获得的乳制品。
12.权利要求1-6的任一项中定义的菌株或权利要求7中定义的细菌组合物用于制备发酵的乳制品的用途。
13.包含权利要求1-6的任一项中定义的菌株或权利要求7中定义的细菌组合物的乳制品。
14.根据权利要求11或13的乳制品，其中所述乳制品是发酵的奶、酸奶、成熟的奶油、 干酪、清爽干酪、奶饮料、乳制品滞留物、加工干酪、奶油甜品、松软干酪或婴儿奶。
15.根据权利要求11、13或14的乳制品，其中所述乳制品包含动物和/或植物来源的奶。
全文摘要
本发明涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中用所述菌株发酵的奶是高粘度和弱成丝性的。本发明还涉及嗜热链球菌菌株的遗传簇，其中所述菌株的基因组包含具有SEQ ID NO1的核苷酸序列的CRISPR基因座。
文档编号C12N15/00GK102264895SQ200980151315
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月14日 优先权日2008年12月12日
发明者克里斯托夫·弗雷莫, 埃莉斯·马努里, 帕斯卡尔·富尔卡谢, 菲利普·霍瓦特 申请人:丹尼斯科公司