专利名称：岩藻糖化化合物的合成的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产岩藻糖化化合物以及与之相关的细胞的方法。
背景技术：
人乳由碳水化合物，蛋白，脂类，激素，和微量营养物的复合混合物组成，能提供婴儿发育所需的全部养分。此外，人乳还包含若干保护剂。除了免疫球蛋白之外，人乳包含一系列具有保护特性的复合的低聚糖。除了主要的碳水化合物成分乳糖之外，人乳低聚糖 (HMO)成分还包括超过130种不同的复合低聚糖。复合低聚糖的这种结构多样性及其大量存在，对人类来说是独一无二的。相反，在牛乳中仅存在微量的、种类更少的复合低聚糖，因此，常用的婴儿乳粉缺少所述低聚糖。临床资料表明，母乳喂养的婴儿腹泻、呼吸道疾病和中耳炎的发病率都低于乳粉喂养的婴儿。长期以来，人乳的这种保护性作用都一直归因于分泌性免疫球蛋白的存在，不过，业已认识到HMOs可能是母乳喂养婴儿防御病原体的主要物质。很多复合HMOs表现出与细胞表面糖缀合物，如Lewisx(Lex)组织-血型抗原 Gal ( β 1-4) [Fuc-(α 1-3)] GlcNAc (β 1) (Newburg, 2001)具有同源性，它通常起着病原体受体的作用。因此，通过分泌可溶性诱饵，模拟细胞表面糖缀合物结构，自然形成了预防感染的有效机制。例如，也已证实HMOs可显著降低致病性大肠杆菌(Escherichia coli) (Cravioto et al.，1991)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae) (Coppa et al.，2006)，肺炎链球菌 (Streptococcus pneumoniae) (Andersson et al.，1986)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni) (Ruiz-Palacios et al.，2003)的毒力，并且还能够中和毒素，如大肠杆菌 (E. coli)的热稳定性肠毒素(Crane et al.，1994)。除了上面提到过的在肠道中的局部作用之外，HMOs还能够通过进入系统循环在婴儿体内诱发系统性作用(tooth et al.，2001)。HMOs对蛋白-碳水化合物相互作用的影响，例如，对选择素-白细胞结合的影响， 可以调节抗原免疫反应，并且减轻炎症反应(Bode，2006，Kunz & Rudloff，2006)。复合低聚糖是人乳中紧随乳糖和脂肪之后的第三大成分。它们在其还原末端几乎都共同具有乳糖，而在非还原端具有岩藻糖和/或唾液酸。它们由3-32个单糖组成，并且大多包含岩藻糖，具有1-15个岩藻糖单元。因此，岩藻糖化的低聚糖表现出作为生物活性食品成分的巨大潜力，其具有抗感染和预防感染属性。能催化岩藻糖残基从供体鸟苷二磷酸活化的L-岩藻糖(GDP-L-岩藻糖)向若干受体分子转移的岩藻糖基转移酶(FucTs)，是在动物，植物，真菌和细菌中表达的(Ma et al.，2006)。它们是按照岩藻糖的加成位点进行分类的，因而区分为α 1，2，al，3/4，和 α l，6FucTs。除了最初负责HMOs和血型抗原的生物合成的人FucTs之外，业已公开了若干种细菌FucTs。业已充分证明了人类胃病原体幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的FucT 活性，它用含有岩藻糖的Lewis抗原修饰其脂多糖(LPS) (Wang et al.，2000)。尚不清楚 Lewis抗原结构在H. pylori感染期间的确切作用，不过，已讨论过有关规避宿主免疫系统、 附着和集落化的分子模拟(Bergman et al.，2006)。
由于HMOs作为健康促进食品添加剂的巨大潜力，人们对它的节省成本的大规模生产存在极大兴趣。与耗费劳力并且需要多个保护和脱保护步骤的从人乳中提取HMOs 和化学合成相比，通过细菌发酵工艺进行生物催化生产是十分有利的(Kretzschmar & Stahl, 1998) 0最近十年，业已公开了通过重组Ε. coli或in vitro酶促转化合成HMO的若干石if究(Albermann et al. , 2001,Dumon et al. , 2006, Dumon et al. , 2001, Dumon et al., 2004，Koizumi et al.，2000)。不过，生产岩藻糖化的低聚糖的瓶颈是供体核苷糖⑶P-岩藻糖的获取问题。这种高能量分子目前无法通过化学或酶促合成以有效方式或节省成本的方式获得。报道岩藻糖化化合物生产系统的大部分出版物认为其取决于E. coli的内源 GDP-岩藻糖库，不过，这种糖库是极有限的，并且仅仅被用于诱导合成含岩藻糖的外多糖 colanic 酸(Grant et al. ,1970)。例如，Albermarm等人QOO1)将重组酶用于酶促合成。⑶Ρ_ β _L_岩藻糖是通过将 ⑶P-D-甘露糖转化成⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖制备的。用⑶P-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3，5表异构酶-4-还原酶进行处理，以便生成⑶P- β -L-岩藻糖，通过制备型HPLC进行纯化。Koizumi及其同事利用N-乙酰乳糖胺(LacNAc)合成Lex的另一种方法涉及通过产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)由补充的GMP相结合生产GTP，通过⑶P-甘露糖合成⑶P-岩藻糖，以及通过在分离的E. coli菌株中超量表达H. pyloria l，3-FucT，从而将LacNAc岩藻糖化(Koizumi et al.，2000)。由于这种细菌偶合法不得不用到穿透化作用，而因此会杀伤细胞，连续和大规模的发酵工艺是不适合采用这种方法的。仍然需要至少克服了现有技术的某些缺陷的生产岩藻糖化化合物的方法。
发明内容
本发明的一种实施方案是一种生产能产生岩藻糖化化合物的、经遗传学修饰过的细胞的方法，包括以下步骤-转化所述细胞，以便表达岩藻糖激酶-转化所述细胞，以便表达岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶。-转化所述细胞，以便表达岩藻糖基转移酶根据本发明的方法，生产出遗传学修饰过的细胞。对所述细胞进行转化，以表达岩藻糖激酶，岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶和岩藻糖基转移酶。将基因导入细胞的方法为本领域技术人员所熟知。在一种优选实施方案中，所述遗传学修饰过的细胞选自下列菌属构成的一组微生物埃希氏菌属，克氏杆菌属，螺杆菌属，芽孢杆菌属，乳杆菌属，链球菌属，乳球菌属，毕赤酵母属，酵母属和克鲁维酵母属。在本发明的实施方案中，所述岩藻糖激酶和藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶活性物合并为一个双功能酶。适合转化的、编码岩藻糖激酶，岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶和/或双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶的基因可以从下列各属微生物中获得类杆菌属，黏胶球形菌属，瘤胃球菌属，Solibacter，拟南芥属，稻属，小立碗藓属，葡萄属，斑马鱼属，牛属，马属，猕猴属，黑猩猩属，人属，家鼠属，鼠属和非洲爪蟾属。合适的岩藻糖基转移酶基因来源可选自下列各属的生物螺杆菌属，埃希氏菌属，耶尔森氏菌属，肠球菌属，志贺氏菌属，克氏杆菌属，沙门氏菌属，类杆菌属，网柄菌属，拟南芥属，果蝇属，人属，牛属，鼠属，家鼠属，原鸡属，犬属和猪属。根据所述基因的来源和用于表达的细胞，进行密码子优化可能有助于增加表达。某些细胞具有使岩藻糖分解代谢的途径。在这种情况下，建议使该分解代谢途径失活。合适的方法包括使选自下列一组的一个或多个基因失活岩藻糖-ι-磷酸酯醛缩酶基因，岩藻糖异构酶基因和降解岩藻糖(fuculose)激酶基因。可以通过本发明的遗传学修饰过的细胞制备的合适的岩藻糖衍生化合物是岩藻糖基乳糖，优选2 ‘-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖或乳糖二岩藻四糖。本发明是在细胞中用岩藻糖做原料合成，而不是像Albermarm等人.Q001)披露的那样，利用重组酶由GDP-D-甘露糖合成。本发明的另一个实施方案是通过本发明的方法获得的遗传学修饰过的细胞。为了生产岩藻糖化化合物，在合适的培养条件下，在含有岩藻糖核受体底物的培养基中培养本发明的遗传学修饰过的细胞。合适的受体底物包括，例如，单糖_、二糖-或低聚糖或肽，例如，乳糖，2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖。通过所述生产方法获得的优选岩藻糖化化合物是岩藻糖基乳糖，优选2 ‘-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖或乳糖二岩藻四糖。这是在E. coli中利用外部添加L-岩藻糖有效合成⑶P-岩藻糖的第一份报道，该方法在E. coli中建立了岩藻糖"补救途径"。不过，该方法还可以转用到其他感兴趣的便于培养的微生物上，转用到食品或制药行业(例如，Lactobacillus spp.)。新发现的这种方法的应用，提供了能生产除2 ’ -岩藻糖基乳糖和3-岩藻糖基乳糖之外的低聚糖的全新的前景，而不需要依赖于高成本的、耗费劳力的提供GDP-岩藻糖(体外)或内源的高度调节的⑶P-岩藻糖的生物合成途径(体内)。在所谓的"岩藻糖补救途径"中，首先通过岩藻糖激酶将岩藻糖磷酸化成岩藻糖-1-磷酸酯。然后通过岩藻糖-I-P-鸟嘌呤基转移酶的作用将岩藻糖-1-磷酸酯转化成 GDP-岩藻糖。最近，披露了具有岩藻糖激酶和L-岩藻糖-I-P-鸟嘌呤基转移酶活性的第一种细菌酶Fkp (Coyne et al.，2005)。肠道细菌脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)利用这种酶生产GDP-岩藻糖，这种糖被用于以岩藻糖残基修饰荚膜多糖和糖蛋白的反应。
图1表示主要的复合人乳低聚糖(HMOs) 2’ -岩藻糖基乳糖和3_岩藻糖基乳糖的结构。图2表示通过偶联酶反应测定Fkp活性和测定NADH氧化作用的光度计分析示意图；Fkp =双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶，PK =丙酮酸激酶，LDH =L-乳酸脱氢酶，PEP =磷酸烯醇丙酮酸。图3表示通过偶联酶反应测定FucT活性和测定NADH氧化作用的光度计分析的示意图；FucT =岩藻糖基转移酶，PK =丙酮酸激酶，LDH = L-乳酸脱氢酶，PEP =磷酸烯醇丙酮酸。图4表示在诱导之后的蛋白形成。泳道1-4 在分别来自E. coliBW25113ΔfucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP(泳道 1) , E.coli BW25113 Δ fucA(DE3) pET-futAco (泳道 2)，Ε. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pCOLA-fkp-fucP+pETfutAco(泳道 3)和 Ε. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP+pCAW55 (泳道 4)的粗制提取物中表达可溶性 Fkp (105，7kDa)和 / 或 FutAco (49, 3kDa)或 FucT2 (35，9kDa)；泳道 5 I^ageRuler 预染色的蛋白梯O^ermentas，Germany)；在重新悬浮在6M尿素中的分别来自 E.coli BW25113ΔfucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP(泳道6)，E·coli BW25113 AfucA(DE3) pET-futAco (泳道 7), Ε. coli BW25113 Δ fucA (DE3) pCOLA-fkp-fucP+pETfutAco (泳道 8) 和 Ε. coli BW25113 Δ fucA (DE3) pC0LA-fkp-fucP+pCAW55 (泳道 9)的细胞碎片中表达不溶性 Fkp 和 / 或 FutAco 或 FucT2。图5表示3H-岩藻糖的放射性薄层色谱法(放射性-TLC)，用丁醇丙酮乙酸 水(35 35 7 23)展开，并且利用放射性-TLC读数器分析。图 6 表示来自 E.coli BW25113 Δ fucA (DE3) pC0LADuet-l pETDuet-1 的细胞提取物的放射性-TLC，示出了岩藻糖和降解岩藻糖(fuculose)及降解岩藻糖(fuculose)磷酸酯，不过，fuculose-Ι-磷酸酯的降解由于fuculose-Ι-磷酸酯醛缩酶基因(fucA)的基因组剔除而受到抑制。图 7 表示来自 E. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP 的细胞提取物的放射性-TLC，示出了来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)的双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶Fkp所生成的积聚的GDP-岩藻糖、以及岩藻糖和降解产物 fuculose 禾口 fuculose-Ι- 粦酸酉旨。图 8 表示来自 Ε. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP pET-futAco 的细胞提取物的放射性-TLC，示出了由幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的密码子优化岩藻糖基转移酶，通过由双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶(Fkp) 提供的GDP-岩藻糖生成的、积累的3-岩藻糖基乳糖。岩藻糖和降解产物fuculose及 fuculose-Ι-磷酸酯仅少量存在；⑶P-岩藻糖数量由于3-岩藻糖基乳糖的产生而显著减少。图9表示来自阴性对照菌株E. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pC0LADuet-l pETDuet-1 的细胞裂解液的HPAED分析，示出了细胞内L-岩藻糖，乳糖，甘油和L-鼠李糖，但没有岩藻糖基乳糖。图10表示生产3-岩藻糖基乳糖的菌株E. coli BW25113 Δ fucA(DE3) pC0LA-fkp-fucP pET-futAco的细胞裂解液(保留时间大约为llmin)；另外，可以看到 L-岩藻糖，乳糖，甘油和L-鼠李糖峰。图 11 表示来自菌株E. coli BW25113 Δ fucA(DE3)pC0LA-fkp-fucP pCAW55 的细胞裂解液的HPAED分析，示出了 2'-岩藻糖基乳糖(保留时间大约为22min)的生成。另外， 可以看到L-岩藻糖，乳糖，甘油和L-鼠李糖。图 1 和 b 表示 GDP-岩藻糖在 E. coli JM109 (DE3) Δ fucA(图 12a)和 E. coli JM109 (DE3) AfucA pC0LA-fkp-fucP (图12b)中的表达借助电化学检测的HPLC-分析。
具体实施例方式下面通过非限定性例子对本发明做进一步说明
例 1表达质粒的构建和生产菌株的开发为了成功阻止外部添加的岩藻糖降解，必须删除E. coli菌株BW25113基因组中编码关键分解代谢酶fuculose-Ι-磷酸酯醛缩酶的基因fucA gene。为了构建fucA缺失，采用了他人的方法(Datsenko & Warmer，2000)。为了利用T7启动子进行异源基因表达，利用λ DE3溶原化试剂盒(Novagen)，将诱导型T7 RNA聚合酶整合到所述缺失菌株E. coli BW25113AfucA 中。得到的菌株被命名为 E. coli BW25113 Δ fucA(DE3)。利用 pCOLADuet-1 和 pETDuet-1 表达载体(Novagen)构建质粒 pCOLA-fkp-fucP 和 pET-futAco。在表 2 中示出了用于所述构建的所有引物。通过PCR用引物fkp-Ncol-正向和fkp-Notl-反向来扩增基因 fkp (GeneBank 保藏号 AY849806)，使用脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis) ATCC 25 )的基因组 DNA。大肠杆菌(Escherichia coli)K12 的 fucP 基因(GeneBank 保藏号CP000948)是用E. coli T0P10的基因组DNA (Invitrogen，USA)扩增的，使用了引物FucP-Nde I-正向和FucP-Xho I-反向。利用标明的限制位点分别将fkp和fucP插入 pCOLADuet-Ι的第一和第二多克隆位点(MCS)。得到的质粒被命名为pCOLA-fkp-fucP。对 H. pylori菌株沈695的futA基因(GeneBank保藏号AE000511)进行密码子优化，以便在 E.coli中表达，并且是由GeMcript公司(Piscataway，NJ, USA)合成制备的。利用引物 FutAco-NcoI-正向和FutAco-BamHI-反向扩增所述基因，并且插入pETDuet-Ι的第一 MCS， 得到pET-futAco。通过限制性分析和测序检验克隆基因的正确插入，使用在Duet载体手册 (Novagen)中列举的推荐的引物 pACYCDuetUPl，pET-上游，DuetDOWN-I，DuetUP2 和 T7-终止子。含有来自幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) NCTC364的编码α 1，2_岩藻糖基转移酶的基因 fucT2 的质粒 pCAW55 是由 C. Albermann 捐赠的(Institute for Microbiology, University of Stuttgart)，而它是以载体 ρJ0E2702 (Stumpp et al. ,2000)为基础的。基因fucT2是通过限制位点Ndel/^stl插入的，并且由L-鼠李糖-诱导型启动子rhaPBAD控制。通过电穿孔(Dower et al.，1988)用所述表达载体转化Ε. coli BW25113 Δ fucA(DE3)。 表1中列出了用于本研究的所有细菌菌株。表1.使用的细菌菌株和质粒
权利要求
1.一种用于生产能产生岩藻糖化能力的遗传学修饰过的细胞的方法，包括以下步骤-转化所述细胞，以便表达岩藻糖激酶-转化所述细胞，以便表达岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶-转化所述细胞，以便表达岩藻糖基转移酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述遗传学修饰过的细胞是选自下列各属微生物 埃希氏菌属，克氏杆菌属，螺杆菌属，芽孢杆菌属，乳杆菌属，链球菌属，乳球菌属，毕赤酵母属，酵母属和克鲁维酵母属。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述岩藻糖激酶和岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶组合成双功能酶。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶是选自来自下列各属微生物的双功能岩藻糖激酶/岩藻糖-ι-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶类杆菌属，黏胶球形菌属，瘤胃球菌属，Solibacter，拟南芥属，稻属，小立碗藓属，葡萄属，斑马鱼属，牛属，马属，猕猴属，黑猩猩属，人属，家鼠属，鼠属和非洲爪蟾属。
5.如权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述岩藻糖基转移酶是选自来源于下列各属微生物的岩藻糖基转移酶螺杆菌属，埃希氏菌属，耶尔森氏菌属，肠球菌属，志贺氏菌属，克氏杆菌属，沙门氏菌属，类杆菌属，网柄菌属，拟南芥属，果蝇属，人属，牛属，鼠属，家鼠属，原鸡属，犬属和猪属。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，为适用于岩藻糖，所述细胞的分解代谢途径是失活的。
7.如权利要求6所述的方法，其中，为适用于岩藻糖，所述分解代谢途径的失活是通过选自下列一个或几个基因失活而实现的岩藻糖-ι-磷酸酯醛缩酶基因，岩藻糖异构酶基因和降解岩藻糖(fuculose)激酶基因。
8.如权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述岩藻糖化化合物是岩藻糖基乳糖，优选2 ‘-岩藻糖基乳糖，3-岩藻糖基乳糖或乳糖二岩藻四糖。
9.通过权利要求1-8中任意一项所述的方法获得的遗传学修饰过的细胞。
10.一种用于生产岩藻糖化化合物的方法，包括以下步骤在合适的培养条件下，在包括岩藻糖和受体底物的培养基中培养权利要求9所述的细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述受体底物是单糖、二糖或低聚糖或肽。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中，所述受体底物是乳糖，2'-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖。
13.如权利要求10-12中任意一项所述的方法，其中，所述岩藻糖化化合物是岩藻糖基乳糖，优选2 ‘-岩藻糖基乳糖或3-岩藻糖基乳糖，或乳糖二岩藻四糖。
全文摘要
一种用于生产能产生岩藻糖化能力的遗传学修饰过的细胞的方法，包括以下步骤-转化所述细胞，以便表达岩藻糖激酶-转化所述细胞，以便表达岩藻糖-1-磷酸酯鸟嘌呤基转移酶-转化所述细胞，以便表达岩藻糖基转移酶。
文档编号A23L1/29GK102257128SQ200980151270
公开日2011年11月23日 申请日期2009年12月18日 优先权日2008年12月19日
发明者埃里克·许夫纳, 尤利娅·帕尔克特, 斯蒂芬·詹内怀恩 申请人:詹内怀恩生物技术股份有限公司