用于减小核酸扩增反应中的分散的方法

专利名称：：用于减小核酸扩增反应中的分散的方法
技术领域：
：本发明涉及用于扩增核酸的方法。更具体地，本发明涉及用于扩增核酸的方法，其特征在于聚合酶反应通过利用DNA聚合酶温育反应溶液来进行。
背景技术：
：在分子生物学研究中，核酸的扩增通常通过使用DNA聚合酶的酶促方法进行。作为用于扩增核酸的方法，聚合酶链反应(PCR)已被广泛已知。为了扩增目的靶核酸序列，PCR法包括以下三个步骤变性作为模板使用的双链DNA以将其转变为单链DNA的步骤(变性步骤)；针对所述单链DNA将引物退火的步骤(退火步骤)；和利用引物作为起点延伸互补链的步骤(延伸步骤)。在一般的PCR法中，使用热循环仪，且变性步骤、退火步骤和延伸步骤以不同的温度进行。然而，所述以3种不同类型的温度进行的核酸扩增反应需要复杂的温度控制。而且，PCR法也已经引起一些问题，因为随着循环次数的增力Π，时间损失也增加。在前述情况下，已经开发了可以在等温条件下进行的核酸扩增方法。这样的核酸扩增方法的实例包括RCA(滚环循环扩增Pr0C.Natl.Acad.Sci(国家科学院学报)，卷92，4641-4645(1995))，ICAN(等温和嵌合引物起始的核酸扩增)，LAMP(环-介导的等温DNA扩增；BioIndustry(生物工业)，卷18，第2期(2001))，NASBA(基于核酸序列的扩增法；Nature(自然)，350，91-(1991))，和TMA(转录介导的扩增法J.ClinMicrobiol(临床微生物学杂志).卷31，3270-(1993))。SDA法(日本专利公开(Kokai)号5-130870A(1993))是使用核酸外切酶的循环测定法，其是一种用于利用聚合酶延伸反应扩增靶核酸片段的目的位点的扩增方法。这是一种利用与靶核酸片段的所述目的位点特异性杂交的引物作为起点进行聚合酶延伸反应，并同时，容许5’一3’核酸外切酶在其上作用，从而从反向降解引物的方法。代替降解的引物，新引物与该位点杂交，并再用DNA聚合酶进行延伸反应。连续周期性重复这种使用聚合酶的延伸反应和随后的使用核酸外切酶解离延伸的链的降解反应。于此，使用聚合酶的延伸反应和使用核酸外切酶的降解反应可以在等温条件下进行。然而，在该方法中，应该使用了核酸外切酶以及聚合酶。因此，这需要高成本，且还需要设计引物的装置。LAMP方法是扩增靶核酸片段的目的位点的方法，其是近期开发的。该方法使用互补识别靶核酸片段的至少6个特定位点的至少4种类型的引物和不具有5’一3’核酸外切酶活性的链置换型BstDNA聚合酶，并在释放模板上的双链DNA作为单链DNA的同时催化延伸反应，以使得可以在等温条件下将靶核酸片段的目的位点扩增为特定结构。然而，应该使用了识别6个特定位点的至少4种类型的引物，且因此非常难以设计所述引物。ICAN法也是用于扩增靶核酸片段的目的位点的方法，其是近期开发的。这是一种在等温条件下，使用RNA-DNA嵌合引物，具有链置换活性和模板交换活性的DNA聚合酶，和RNA酶H的方法。在所述嵌合引物结合模板后，通过DNA聚合酶合成互补链。其后，RNA酶H裂解嵌合引物-来源的RNA部分，并由裂解位点开始，延伸反应伴随链置换反应和模板交换反应发生。通过重复该反应，扩增基因。然而，该方法也需要使用特殊的引物，即嵌合引物，且因此很难设计该引物。日本专利公开(Kohyo)号11_509406A(1999)描述在等温条件下，通过使目的区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至少一对寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开(Kohyo)号11-509406A(1999)中所述的方法已经引起了问题，因为其需要相当长的反应时间。日本专利公开(Kokai)号2002-233379描述在等温条件下，通过使目的区域内的DNA在存在具有链置换能力的DNA聚合酶的条件下与至少一对寡核苷酸引物反应而对其进行扩增的方法。然而，日本专利公开(Kohyo)号2002-233379中所述的方法已经在显著水平的非特异性扩增产物生成方面引起了问题。
发明内容本发明的一个目的是提供用于扩增核酸的方法，其不要求复杂的温度控制且其可以在不使用特殊酶或特殊引物的条件下进行。本发明的另一个目的是提供用于扩增核酸的方法，其中反应中的分散(dispersion)得到抑制。作为针对实现前述目的的深入研究的结果，本发明人已经成功地特异性扩增靶核酸序列和进一步抑制扩增速率的分散，这是通过将反应溶液温育在扩增反应中高度特异性所必需的温度(Tl)下，和然后将反应溶液温育在扩增反应中的高效率所必需的温度(T2)下进行，由此完成本发明。本发明提供用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤(1)和(2)(1)在温度(Tl)下温育反应溶液的步骤，所述反应溶液含有至少一种类型的脱氧核苷酸三磷酸酯，至少一种类型的DNA聚合酶，至少2种类型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步骤(1)后，在温度(T2)下温育所述反应溶液的步骤，所述温度(T2)高于温度(Tl)并在50°C以上至100°C以下之间。优选地，温度(Tl)在10°C以上至50°C以下之间。优选地，温度(Tl)和温度(T2)之间的温度差异在5°C以上。优选地，步骤(1)在60分钟内进行。优选地，步骤⑵在60分钟内进行。优选地，只有寡核苷酸引物的3’_端区域与作为模板的核酸片段基本互补。优选地，寡核苷酸引物仅在一个连续位点处与起模板作用的核酸片段基本互补。优选地，所述反应溶液另外包括至少0.01%以上的表面活性剂。优选地，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。优选地，所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。优选地，所述反应溶液还包括二价阳离子。优选地，所述反应溶液还包括解链温度调节剂。优选地，所述解链温度调节剂是二甲亚砜，甜菜碱，甲酰胺，或甘油，或它们中的两种以上类型的混合物。优选地，所述DNA聚合酶具有链置换活性。优选地，具有链置换活性的聚合酶选自由源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的5，一3，核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的DNA聚合酶组成的组。按照本发明，扩增靶核酸序列的特异性可以通过在扩增反应中高度特异性所必需的温度(Tl)下温育反应溶液，和然后在扩增反应中高效率所必需的温度(T2)下温育反应溶液而提高。而且，作为反应中提高的特异性的结果，可以减小检测扩增产物所需时间的分散。此外，按照本发明，由于靶核酸序列可以在不要求复杂的温度控制、不要求使用特殊的酶和复杂的引物设计的条件下扩增，所以可以提供以高灵敏度简单快速扩增核酸的方法。附图简述图1显示关于CYP2C9基因的实施例中使用的引物的位置关系。图2显示通过使反应溶液A(无步骤(1)的温育)在60°C反应60分钟和然后进行随时间荧光检测获得的结果。图3显示通过使反应溶液B(有步骤(1)的温育(11=25°0，10分钟)在601(=T2)反应60分钟和然后进行随时间荧光检测获得的结果。图4显示通过使反应溶液C(有步骤(1)的温育(11=25°0，20分钟)在601(=T2)反应60分钟和然后进行随时间荧光检测获得的结果。图5显示通过使反应溶液D(有步骤(1)的温育(11=25°0，30分钟)在601(=T2)反应60分钟和然后进行随时间荧光检测获得的结果。图6显示通过使用样品进行电泳获得的结果，所述样品是通过使反应溶液A(无步骤⑴的温育)在60°C(=T2)反应60分钟获得的。图7显示通过使用样品进行电泳获得的结果，所述样品是通过使反应溶液B(有步骤(1)的温育(Tl=250C)，10分钟)在60°C(=T2)反应60分钟获得的。图8显示通过使用样品进行电泳获得的结果，所述样品是通过使反应溶液C(有步骤(1)的温育(Tl=250C)，20分钟)在60°C(=T2)反应60分钟获得的。图9显示通过使用样品进行电泳获得的结果，所述样品是通过使反应溶液D(有步骤(1)的温育(Tl=250C)，30分钟)在60°C(=T2)反应60分钟获得的。具体实施例方式在下文中，更详细地描述本发明。按照本发明用于扩增核酸的方法包括以下步骤⑴和(2)(1)在温度(Tl)温育反应溶液的步骤，所述反应溶液含有至少一种类型的脱氧核苷酸三磷酸酯，至少一种类型的DNA聚合酶，至少2种类型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步骤(1)后，在温度(T2)温育所述反应溶液的步骤，所述温度(T2)高于温度(Tl)并在50°C以上至100°C以下。在本发明中，扩增反应效率在温度Tl时低，且在温度T2时高。同时，重要的是，寡核苷酸引物针对起模板作用的核酸片段杂交的特异性在温度Tl时高。在这样的条件下，温度Tl和温度T2之间的关系是Tl<T2。优选地，温度Tl和温度T2之间的差异在5°C以上。更优选地，温度Tl和温度T2之间的差异在10°C以上。进一步优选地，温度Tl和温度T2之间的差异在20°C以上。温度T2在50°C以上至100°C以下。另外，温度Tl不受特别的限制，且其优选在10°C以上至50°C以下。优选地，步骤(1)在60分钟内进行。步骤(1)更优选地在5-60分钟内，进一步优选地在10-60分钟内，和更进一步优选地15-60分钟内进行。优选地，步骤(2)在60分钟内进行。步骤(2)更优选地在5-60分钟内，进一步优选地在10-60分钟内，和更进一步优选地15-60分钟内进行。本发明的扩增方法可以通过任何机制进行，条件是其以温度(Tl)和以温度(T2)进行。例如，可以仅扩增夹在引物之间的区域。另外，还可以通过经由用引物延伸的核酸序列的重组现象来扩增高分子量产物。而且，还可以通过经由加入到所述引物中的Tag序列的重组现象来扩增高分子量产物。以下，将在下文中描述本发明中使用的成分。(1)脱氧核苷酸三磷酸酯脱氧核苷酸三磷酸酯用作延伸反应的底物。具体地，优选使用dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物。脱氧核苷酸三磷酸酯可以包括dNTP的类似物(例如，7-脱氮-dGTP，等)。另外，所述脱氧核苷酸三磷酸酯(dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物)的终浓度在0.lmM-3.OmM，优选0.75mM_3.OmM，更优选1.OmM-2.OmM，和特别优选1.OmM-1.5mM的范围内。(2)DNA聚合酶在本发明中，使用具有链置换能力的聚合酶。术语“链置换能力”在本说明书中用于意指利用核酸序列作为模板进行DNA复制，同时置换DNA链从而释放与模板链退火的互补链的活性；即进行链置换的活性。所述具有链置换能力的聚合酶的具体实例包括源自嗜热脂肪芽孢杆菌的5’一3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌的5’一3’核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸热脂环酸杆菌的DNA聚合酶，但实例不仅限于此。所述具有链置换能力的聚合酶可以是天然存在的蛋白或通过遗传工程生成的重组蛋白。(3)二价阳离子在本发明中，为了所用酶等的金属需求而使用二价阳离子。作为这样的二价阳离子，可以使用镁盐、钙盐、和其他金属盐。例如，可以使用氯化镁、乙酸镁、硫酸镁等。所述二价阳离子的终浓度在优选lmM-20mM，和更优选2mM-10mM的范围内。(4)表面活性剂在本发明中，可以将表面活性剂加入到反应溶液中。使用这样的表面活性剂，可以获得本发明的有利效果，即防止核酸的非特异性扩增。本发明中使用的表面活性剂的类型不受特别的限制。本发明中可以使用的表面活性剂的实例包括阴离子表面活性剂诸如烷基苯磺酸钠，十二烷基硫酸钠(SDS)，辛基磺基琥珀酸盐或硬脂酸皂；非离子型表面活性剂诸如蔗糖脂肪酸酯，POE失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，等)，脂肪酸链烷醇酰胺，POE烷基醚(Brij35，Brij58，等)，POE烷基苯基醚TritonX-100，TritonX-114,NonidetP40，等)，壬基苯酚，月桂醇，聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，POE烷基胺或POE脂肪酸二苯基醚；和阳离子表面活性剂诸如十六烷基氯化吡啶鐺，月桂基二甲基苄基氯化铵或硬脂基三甲基氯化铵。所用表面活性剂的量不受特别的限制，条件是可以实现本发明的效果。所用表面活性剂的量是优选0.01%以上，更优选0.05%以上，和进一步优选0.1%以上。所用表面活性剂的量的上限不受特别的限制。通常是10%以下，优选5%以下，和更优选以下。在所述表面活性剂中，使用非离子型表面活性剂是特别优选的。在非离子型表面活性剂中，具有强亲水性的非离子型表面活性剂是优选的，且在HLB值方面，具有12以上的HLB值的非离子型表面活性剂是优选的。所述HLB值更优选是14以上。优选应用的HLB值的上限是20。HLB值的上限更优选是17或以下，和进一步优选是14-17。在结构上，本发明中使用的表面活性剂优选选自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。在所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯中，仅具有一个脂肪酸酯的那些是优选的。这种化合物的实例通过以下结构式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>R具有12-18个碳原子的烷基基团烷基基团的位置不受特别的限制。还可以优选使用以下结构。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(x+y+z+w=20，R具有12-18个碳原子的烷基基团)由上述通式表示的表面活性剂包括称为聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯的非离子型表面活性剂。所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯非离子型表面活性剂的实例包括聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单棕榈酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单硬脂酸酯，和聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇单油酸酯。(产品名吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，等)。使用的所述非离子型表面活性剂的量不受特别的限制。优选是0.01%以上，更优选0.05%以上，和进一步优选0.以上。(5)寡核苷酸引物本发明中使用的寡核苷酸具有基本与模板DNA互补的核苷酸序列，并容许DNA链从其3’端开始延伸。因此，由于所述寡核苷酸具有基本与模板DNA互补的核苷酸序列，所以其可以与作为模板使用的DNA退火。作为本发明中使用的寡核苷酸，可以使用由脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的寡核苷酸，且所述寡核苷酸还可以包括修饰的核糖核苷酸或修饰的脱氧核糖核苷酸。优选地，只有寡核苷酸引物的3’-端区域与起模板作用的核酸片段基本互补。优选地，寡核苷酸引物仅在一个连续位点处与起模板作用的核酸片段基本互补。优选地，将以下核苷酸序列作为标记物加入到寡核苷酸引物的5’端侧，所述核苷酸序列存在于与寡核苷酸引物的3’端侧部分(其是其中寡核苷酸与模板核酸退火的部分)基本同源的序列的3’端侧上，在起模板作用的核酸片段的核苷酸序列上。寡核苷酸的长度不受特别的限制。所述长度由通常约10-100个核苷酸，优选约15-50个核苷酸，和更优选约15-40个核苷酸组成。所述寡核苷酸可以通过使用可商购的DNA合成仪(例如，由AppliedBiosystems(应用生物系统)制造的394型DNA合成仪，等)的亚磷酰胺(phosphoamidite)法合成。反应溶液中使用的所述寡核苷酸的量是优选0.1μM以上，更优选1μM以上，和特别优选1.5μΜ以上。(6)起模板作用的核酸片段本发明中起模板作用的核酸(DNA或RNA)可以是基因组DNA，cDNA,合成DNA，mRNA，和总RNA中的任意一种。可以使用由可能包含起模板作用的核酸的样品制备的核酸，或可以直接使用可能包含起模板作用的核酸的样品。所述包含起模板作用的核酸的样品的类型不受特别的限制。所述样品的实例包括体液(例如，全血、血清、尿液、脑脊髓液、精液、唾液，等)；组织(例如，癌组织，等)；生物体来源的样品诸如拭子和细胞培养物；含有核酸的样品诸如病毒、细菌、霉菌、酵母、植物、和动物；其中可能混合微生物的样品(例如，食品，等)，和环境诸如土壤和排水中存在的样品。当由前述样品制备核酸时，用于制备所述核酸的方法不受特别的限制。例如，可以应用本领域中技术人员已知的方法，诸如用表面活性剂处理、超声波处理、和使用玻璃珠纯化。可以通过苯酚提取、层析法、凝胶电泳、密度梯度离心等，从样品中纯化核酸。当扩增具有源自RNA的序列的核酸时，本发明的方法可以利用通过关于前述作为模板的RNA的反转录反应合成的cDNA作为模板来进行。所述反转录反应中使用的引物可以是具有与特定模板RNA互补的核苷酸序列的引物，或寡dT引物或具有随机序列的引物。反转录中使用的所述引物的长度是优选约6-100个核苷酸，和更优选约9-50个核苷酸。反转录反应中使用的酶的类型不受特别的限制，条件是当RNA作为模板使用时，其具有cDNA合成活性。本文中可以使用的所述酶的实例包括禽类成髓细胞性白血病病毒反转录酶(AMVRTase)，莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLVRTase)，和劳斯相关病毒2反转录酶(RAV-2-RTase)。而且，还可以使用也具有反转录活性的链置换型DNA聚合酶。在本发明中，双链DNA诸如基因组DNA或核酸扩增片段或单链DNA诸如通过反转录反应从RNA制备的cDNA可以用作模板DNA。前述双链DNA可以通过变性转化为单链DNA，并可以然后用于本发明的方法。否则，所述双链DNA可以在不进行所述变性的条件下直接用于本发明的方法。(7)预处理起模板作用的核酸片段本发明中起模板作用的核酸可以在经历预处理后，作为扩增模板使用。所述预处理中使用的试剂可以包括，例如表面活性剂、抗凝血药、蛋白酶、和脂质降解酶。该液体可以是酸性或碱性的。所述预处理过程可以包括将核酸片段加热到高温(例如，98°C)的步骤或用变性试剂对其进行处理的步骤。而且，其还可以包括在加热到高温后，将所述核酸片段骤冷到4°C以下的温度的步骤。(8)解链温度调节剂可以将解链温度调节剂加入到本发明的反应溶液中。所述解链温度调节剂的具体实例包括二甲亚砜(DMSO)，甜菜碱，甲酰胺，甘油，四烷基铵盐，和这些化合物中两种以上类型的混合物。使用的所述解链温度调节剂的量不受特别的限制。当解链温度调节剂是DMS0，甲酰胺，或甘油时，通常可以以10%以下的百分比包含在反应溶液中。甜菜碱或四烷基铵盐可以以约0.2-3.0M，和优选约0.5-1.5M的浓度添加到反应溶液中。(9)缓冲成分本发明中使用的反应溶液可以包括缓冲成分。所述缓冲成分的类型不受特别的限制。例如，可以使用N-二(羟乙基)甘氨酸，tricine,H印es，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，磷酸盐(磷酸钠，磷酸钾，等)，等。缓冲成分的终浓度是5mM-100mM，和特别优选10mM-50mM的范围内。缓冲成分的PH值取决于扩增反应中使用的酶的最适pH。通常是pH6.0-9.0，和特别优选是PH7.0-9.0。(10)荧光染料本发明中使用的反应溶液可以包括荧光染料。所述荧光染料的类型不受特别的限制。例如，可以使用SYBR绿I等。(11)本发明的用于扩增核酸的方法的应用按照本发明的扩增核酸的方法可以在用于检测核酸，标记、确定核苷酸序列，检测核苷酸突变(包括检测单核苷酸多态性等)，等。由于本发明的用于扩增核酸的方法不需要使用能够控制温度的反应容器，因此扩增反应可以利用大量反应溶液进行。通过本发明的扩增核酸的方法获得的扩增产物可以通过本领域中技术人员已知的方法检测。例如，根据凝胶电泳，可以通过使用溴化乙锭染色凝胶来检测特定大小的反应产物。作为用于检测扩增产物的检测系统，可以使用荧光偏振、免疫测定、荧光能量转移、酶标记(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶，等)、荧光标记(例如，荧光素、罗丹明，等)、化学发光、生物发光等。还可能利用Taqman探针或分子信标(MolecularBeacon)检测扩增产物。还可能利用用生物素等标记的标记核苷酸来检测扩增产物。在这种情形中，扩增产物中包含的生物素可以利用荧光标记的抗生物素蛋白或酶标记的抗生物素蛋白检测。而且，使用本领域中技术人员已知的氧化还原嵌入剂，可以用电极检测扩增产物。此外，扩增产物还可以利用sra检测。通过检测焦磷酸镁，可以检测核酸扩增。在这种情形中，扩增产物可以通过本领域中技术人员已知的其他方法，诸如检测浊度来检测。本发明将在以下实施例中更加具体地描述。然而，这些实施例不意欲限制本发明的范围。实施例<实施例1>核酸的扩增反应(1)制备含有靶核酸片段的核酸样品溶液将3.Ong人血液来源的DNA在98°C加热3分钟，以生成单链。随后，在以下条件下扩增CYP2C9基因中的序列。〈引物〉设计引物，以靶向CYP2C9基因。各个引物的序列显示如下。引物(1)(正向)5，-GGTCCAGAGATACC-3，(SEQIDNO1)引物(2)(反向)5，-CAGGCTGGTGGGGAGA-3，(SEQIDNO2)前述引物和CYP2C9基因的位置关系的详细信息显示在图1中。(2)制备反应溶液制备具有以下组成的反应溶液。〈反应溶液的组成〉IOXBst缓冲液(DF)LOyLIOOmMMgS040.6μL10%(ν/ν)吐温200.1μL100%DMSO0.5μL25mM各种dNTP0.56μLSYBR绿I(2000-倍稀释)0·2μL50μM引物(1)0·64μL50μM引物(2)0·64μLBst.聚合酶0.4yL在(1)中获得的核酸片段样品3.Ong纯化水4.96μL_10.0μL(3)温育反应溶液(步骤⑴)在以上⑵中制备的反应溶液在室温(Tl=250C)下温育0-30分钟。反应溶液A不温育(0分钟)反应溶液B温育10分钟反应溶液C温育20分钟反应溶液D温育30分钟(4)核酸的扩增反应(步骤(2))利用实时荧光检测器(Μχ3000ρ；由Stratagene制造)，以上(3)中获得的反应溶液在60°C(=T2)反应60分钟，并随时间检测荧光。关于反应溶液A的结果显示在图2中。关于反应溶液B的结果显示在图3中。关于反应溶液C的结果显示在图4中。关于反应溶液D的结果显示在图5中。应当注意，实验以N=4进行(即，对四份相同的样品进行实验)。发现可以实时检测来自核酸样品来源的样本的核酸扩增反应。于此，利用Μχ3000ρ分析软件计算在前述图表中荧光水平达到250时的时间(Ct值)。作为结果，获得表1中所示的结果。表1:T1=25°C，Τ2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Ct值的分散通过设定温育时间而减小。即，扩增速率中的分散减小。(5)扩增产物的电泳利用3wt%琼脂糖凝胶和0.5ΧΤΒΕ缓冲液(50mMTris，45mM硼酸，0.5mMEDTA,ρΗ8.4)，以IOOV将扩增反应后获得的样品进行电泳60分钟。关于反应溶液A的结果显示在图6中。关于反应溶液B的结果显示在图7中。关于反应溶液C的结果显示在图8中。关于反应溶液D的结果显示在图9中。在没有进行温育(图6)的样品的情形中，它们展现出不同的条带图谱(N=4)。在另一方面，在温育10分钟(图7)的样品的情形中，四份样品中的两份(样品a和d)展现出相同的条带图谱。而且，在温育20分钟(图8)和30分钟(图9)的样品的情形中，所有样品展现出几乎相同的图谱(N=4)。由电泳图谱的结果，发现作为温育结果而产生的扩增产物也变得均一。即，发现扩增反应的特异性得到提高。<实施例2>温育温度的改变(1)制备含有靶核酸片段的核酸样品溶液将3.Ong人血液来源的DNA在98°C加热3分钟，以生成单链。随后，在以下条件下扩增CYP2C9基因中的序列。〈引物〉设计引物，以靶向CYP2C9基因。各个引物的序列显示如下。引物(1)(正向)5，-GGTCCAGAGATACC-3，(SEQIDNO1)引物(2)(反向)5，-CAGGCTGGTGGGGAGA-3，(SEQIDNO2)前述引物和CYP2C9基因的位置关系的详细信息显示在图1中。(2)制备反应溶液制备具有以下组成的反应溶液。〈反应溶液的组成〉IOXBst缓冲液(DF)LOyLIOOmMMgS040.6μL10%(ν/ν)吐温200.1μL100%DMSO0.5μL25mM各种dNTP0.56μLSYBR绿I(2000-倍稀释)0·2μL50μM引物(1)0·64μL50μM引物(2)0·64μLBst.聚合酶0.4yL在(1)中获得的核酸片段样品3.Ong纯化水4.96μL_10.0μL(3)温育反应溶液(步骤⑴)在以上⑵中制备的反应溶液在(Tl=)301，401或501下温育5，10或15分钟。(4)核酸的扩增反应(步骤(2))利用实时荧光检测器(Μχ3000ρ；由Stratagene制造)，以上(3)中获得的反应溶液在60°C(=T2)反应60分钟，并随时间检测荧光。实验以Ν=4进行(即，对四份相同的样品进行实验)。发现可以实时检测来自核酸样品来源的样本的核酸扩增反应。于此，利用Μχ3000ρ分析软件计算在前述图表中荧光水平达到250时的时间(Ct值)。作为结果，获得表2-4中所示的结果。使用Ct值的标准偏差来评估扩增速率的分散。通过在30°C，40°C和50°C下温育15分钟或以下而获得的标准偏差分别小于在不温育下获得的标准偏差(3.6分钟)。S卩，通过进行温育而减小扩增速率的分散。表2:T1=30°C，T2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3:T1=40°C，T2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110>富士胶片株式会社<120>用于减小核酸扩增反应中的分散的方法<130>FA9175A<160>2<210>1<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>1ggtccagagatacc14<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2caggctggtggggaga1权利要求用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤(1)和(2)(1)在温度(T1)下温育反应溶液的步骤，所述反应溶液含有至少一种类型的脱氧核苷酸三磷酸酯，至少一种类型的DNA聚合酶，至少2种类型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步骤(1)后，在温度(T2)下温育所述反应溶液的步骤，所述温度(T2)高于所述温度(T1)并在50℃以上至100℃以下之间。2.按照权利要求1的方法，其中所述温度(Tl)在10°C以上至50°C以下之间。3.按照权利要求1的方法，其中在所述温度(Tl)和所述温度(T2)之间的温度差异在5°C以上。4.按照权利要求1的方法，其中所述步骤(1)在60分钟内进行。5.按照权利要求1的方法，其中所述步骤⑵在60分钟内进行。6.按照权利要求1的方法，其中只有所述寡核苷酸引物的3’-端区域与所述起模板作用的核酸片段基本互补。7.按照权利要求6的方法，其中所述寡核苷酸引物仅在一个连续位点处与所述起模板作用的核酸片段基本互补。8.按照权利要求1中任一项的方法，其中所述反应溶液另外包括至少0.01%以上的表面活性剂。9.按照权利要求8的方法，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。10.按照权利要求9的方法，其中所述非离子型表面活性剂选自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。11.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括二价阳离子。12.按照权利要求1的方法，其中所述反应溶液还包括解链温度调节剂。13.按照权利要求12的方法，其中所述解链温度调节剂是二甲亚砜，甜菜碱，甲酰胺，或甘油，或它们的两种以上类型的混合物。14.按照权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶具有链置换活性。15.按照权利要求1的方法，其中所述具有链置换活性的聚合酶选自由以下组成的组源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的5’一3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的DNA聚合酶。全文摘要本发明公开了用于减小核酸扩增反应中的分散的方法。本发明的目的是提供用于扩增核酸的方法，其不要求复杂的温度控制且可以在不使用特殊酶或特殊引物的条件下进行。本发明提供用于扩增核酸的方法，其包括以下步骤(1)和(2)(1)在温度(T1)下温育反应溶液的步骤，所述反应溶液含有至少一种类型的脱氧核苷酸三磷酸酯，至少一种类型的DNA聚合酶，至少2种类型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步骤(1)后，在温度(T2)下温育所述反应溶液的步骤，所述温度(T2)高于温度(T1)并在50℃以上至100℃以下之间。文档编号C12P19/34GK101824449SQ20101000350公开日2010年9月8日申请日期2010年1月12日优先权日2009年1月13日发明者三好隼人,岩木义英申请人:富士胶片株式会社