专利名称：松针红斑病pcr检测方法
技术领域：
本发明涉及一种松针红斑病PCR检测方法，属于农林业生物技术领域。
背景技术：
松针红斑病也称松穴褥盘孢菌(Dothistroma)枯针病，是世界流行病害，在中国 属重要的森林检疫病害。其病原菌最初来自美洲。目前松针红斑病已被当成南半球及一些 国家人工林中最具危害的病害。美国1964年首次报道这种真菌导致过早落叶造成其东部 大平原黄松栽植失败，经济损失重大。据报道该病害在加拿大、新西兰、智利、英国、肯尼亚、 坦桑尼亚和乌干达等45个国家使60多个松树种、变种和杂交种受害。该病害导致受害树 木生长迟缓，发病严重可致树木死亡。我国1980年首次在东北林业大学凉水实验林场中的樟子松幼苗、人工幼林和天 然林中发现该病害。被感染的松树主要有樟子松、红松、赤松、偃松及红皮云杉等。据调查黑 龙江省大、小兴安岭地区、内蒙古，吉林及云南等地都有过发生的报道，严重地区发病率达 100%。松针红斑病菌的寄主范围广、适生范围大、危害严重、难以根除、易于人为传播，是危 险性很大的林业检疫有害生物，并且有扩散蔓延趋势，对我国的松树资源构成很大的威胁。该病害的国内外一直采用传统的形态与危害症状的鉴定，但该病害的发生由于地 域广，受环境因素的影响该病原菌的形态变化比较大，危害症状出现比较慢，造成早期鉴定 困难。核糖体基因转录间隔区ITS是由GOnZalea1990年提出后逐步发展起来的全新 的分子标记检测技术，ITS区段既具保守性，又在科、属、种水平上均有特异性序列，通过对 ITS区设计特异性引物，来诊断和检测植物病原菌，尤其是对植物病原真菌的分子检测已越 来越被广泛应用。2003年杨佩文等应用真菌核糖体基因ITS区段通用引物ITSl和ITS4，对 十字花科蔬菜根肿病菌(Plasmodiophora brassicae) rDNA进行PCR扩增，测序分析和特异 引物的设计，获得根肿菌一特异性分子片段并对不同寄主植物进行了检测。张薇等对分离 自苏南丘陵地区的苜蓿菌核病菌株NJl的rDNA，利用ITS区段通用引物ITS4和ITS5进行 PCR，经同源性比较，并结合病原菌致病性测定和形态学特征观察，将发病症状较相似、形态 学上不容易区分且均能够侵染豆科植物造成菌核病的S. trifoliorum, S. sclerotiorum和 S. minor 3种病原菌区分开，，并将其鉴定为三叶草核盘菌(Sclerolinia trifoliorum)。由 于这种方法快速、准确和简便，已成为研究病原真菌系统进化和病害诊断的强有力辅助工 具，也越来越受到植物病理学家们的重视。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中松针红斑病生物学检测所需要周期长，一般需要 30-50天，早期鉴定困难的问题，提供一种松针红斑病的PCR检测方法，对松针红斑病进行 PCR扩增检测，该方法用时短、准确率高、灵敏性高。上述的目的通过以下的技术方案实现包括如下步骤取1 μ L松针红斑病DNA溶液， 加入反应液Taq聚合酶lyL、10XPCR Buffer5 μ L、dNTP 4 μ L、上游引物1 μ L、下游引物 1 μ L、无菌去离子水36. 25 μ L进行PCR扩增反应；然后取8 μ LPCR扩增产物，在1. 0 %琼 脂糖凝胶上进行电泳，电压50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果如果存在分子量约为 ISObp的DNA条带，则证明所检病原为松针红斑病病原菌。所述的松针红斑病PCR检测方法，所述的Taq聚合酶的浓度为5U/y L，所述的 10XPCR Buffer 中 Tris-HCL 为 lOOmM，KCL 为 500mM，MgCL2 为 15mM，dNTP 为 2. 5mM，上游 引物为20 μ M，下游引物为20 μ Μ，所述的上游引物序列为5，CGACCTCCAACCCTT 3’，所述的 下游引物序列为5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，。所述的松针红斑病PCR检测方法，所述的PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ； 94°C变性Imin ；54°C退火Imin ；72°C延伸Imin ；29个循环，最后72°C延伸7min。本发明的有益效果1、本发明设计出一对检测松针红斑病的特异性引物primer ffl/primer W2，利 用特异性引物及PCR过程快速、准确检测松针红斑病，要求提取发病组织DNA浓度仅达到 0. 68fg/y L以上既可检测出，检测过程只需要简便的PCR和琼脂糖电泳操作，扩增产物带 型清晰，结果稳定，说明primerWl/primerW2引物具有很高的特异性，在实际应用中仅根据 扩增产物的有无便可对目标病害进行检测，为该病害的早期诊断和防治提供科学依据。目 前国内未见有针对松针红斑病进行PCR方法检测与早期诊断的研究报道。2、松针红斑病易与松针褐斑病(Lecanosticta acicola)、环境胁迫危害、根腐病 等引起的危害混淆。目前对松针红斑病的鉴定主要还是依据传统的形态学方法，该病原菌 在人工培养基上生长缓慢，早基症状不明显时鉴定困难，存在费时、近似种难以区分等诸多 弊端，不适合快速鉴定的要求。而核糖体DNA(rDNA)的编码区序列具有保守性，分析真菌核 糖体基因是进行真菌分类鉴定和系统发育的有效方法。近年来，利用PCR扩增病原菌核糖 体ITSGnternal transcribedspacer)基因区段进行种类鉴定、检测及病害诊断技术得到 了快速发展。由于这种方法快速、准确和简便，因而，越来越受到植物病理学家们的重视。本 发明设计而成的一对特异性引物，首次将PCR技术用于松针红斑病的分子检测与预警，成 功扩增出预期的片段。不仅能对病原菌的纯培养物进行分类鉴定和病菌监测，而且对病原 菌所致的真菌病害的病组织检测也能达到很好的效果。这为开展松针红斑病分子监测与疫 病的快速诊断技术术奠定了基础，对植物病害的防治具有一定意义。本发明对准确鉴定和 快速检测检疫性松针红斑病是很重要的突破。
图1是樟子松红斑病PCR引物检测结果电泳图。
具体实施例方式实施例1 樟子松红斑病(Dothistromapini)PCR 检测(1)材料取样取樟子松松针红斑病针叶，自来水冲洗干净后剪取发病部位组织0. 1-0. 2g。(2)提取发病松针组织总DNA (采用TIANGEN公司的快捷型植物基因组DNA提取试剂盒对DNA抽提)
加液氮充分研磨带病斑松针，加入400 μ L缓冲液FPl和6 μ L的foise A(IOmg/ μ L)，旋涡振荡lmin，室温放置IOmin ；加130 μ L缓冲液FP2，充分混勻，旋涡振荡lmin，12，OOOrmp离心5min，将上清转
至新的离心管中；向上清液加入350 μ L异丙醇，12，OOOrmp离心2min，弃上清，保留沉淀；加500μ L70%乙醇，旋涡振荡k，12，OOOrmp离心2min，弃上清，晾干至无酒精 味；加入40 μ L洗脱缓冲液，65°C水浴IOmin溶解DNA，用于PCR检测。(3)松针红斑病PCR检测松针红斑病的特异性引物上游5，CGACCTCCAACCCTT 3，(primer wl)下游5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，(primer w2)反应体系反应总体积50 μ L 包括Taq 聚合酶(5U/μ L) 1 μ L，10 X PCR Buffer (Tris-HCL 为 IOOmM, KCL 为 500mM, MgCL2 为 15mM)5y L, dNTP (各 2. 5mM) 4 μ L ；上游弓丨物(20 μ Μ) 1 μ L ； 下游引物(20 μ Μ) 1 μ L ；模板DNAl μ L ；补无菌去离子水(ddH20) 36. 25 μ L。PCR扩增反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性Imin力4°C退火Imin ；72°C延伸 Imin ；29个循环，最后72°C延伸7min ；PCR反应产物电泳检测取8 μ LPCR扩增产物，在1. O %琼脂糖凝胶上进行电泳，电 压50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果如果存在分子量约为ISObp的DNA条带，则证 明所检病害为松针红斑病病原菌，而健康组织无此条带，如图1所示。
权利要求
1.一种松针红斑病PCR检测方法，其特征是该方法包括如下步骤取1 μ L松针红斑 病DNA溶液，加入反应液Taq聚合酶lyL、10XPCR Buffer5 μ L、dNTP 4 μ L、上游弓丨物1 μ L、 下游引物1 μ L、无菌去离子水36. 25 μ L进行PCR扩增反应；然后取8 μ LPCR扩增产物，在 1. 0%琼脂糖凝胶上进行电泳，电压50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果存在分子量 约为ISObp的DNA条带，则证明所检病原为松针红斑病病原菌。
2.根据权利要求1所述的松针红斑病PCR检测方法，其特征是所述的Taq聚合酶 的浓度为 5U/ μ L，所述的 10XPCR Buffer 中 Tris-HCL 为 lOOmM，KCL 为 500mM，MgCL2 为15mM，dNTP为2. 5mM,上游引物为20 μ Μ,下游引物为20 μ Μ,所述的上游引物序列为 5，CGACCTCCAACCCTT 3，，所述的下游引物序列为 5，CGCTGCGTTCTTCAT 3，。
3.根据权利要求1所述的松针红斑病PCR检测方法，其特征是所述的PCR扩增反应 程序为94°C预变性5min ；94°C变性Imin ；54°C退火Imin ；72°C延伸Imin ；29个循环，最后 72°C 延伸 7min。
全文摘要
松针红斑病PCR检测方法。松针红斑病一直采用传统的形态与危害症状的鉴定，但该病害的发生由于地域广，受环境因素的影响该病原菌的形态变化比较大，危害症状出现比较慢，造成早期鉴定困难。本发明的方法包括取1μL松针红斑病DNA溶液，加入反应液Taq聚合酶1μL、10×PCR Buffer5μL、dNTP 4μL、上游引物1μL、下游引物1μL、无菌去离子水36.25μL进行PCR扩增反应；然后取8μLPCR扩增产物，在1.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压50-100V，30分钟后在紫外光下检测结果如果存在分子量约为180bp的DNA条带，则证明所检病原为松针红斑病病原菌。本发明用于松针红斑病的早期诊断。
文档编号C12Q1/68GK102121050SQ20101003244
公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月8日 优先权日2010年1月8日
发明者严善春, 王占斌, 王志英 申请人:东北林业大学, 严善春, 王占斌, 王志英