专利名称：一种小鼠胰腺干/祖细胞的离体筛选扩增技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型高效的离体筛选扩增小鼠胰腺干/祖细胞技术，具体涉及到
采用胶原酶部分消化后两次转接富集胰腺干/祖细胞，挑取单细胞集落纯化，及进一步扩 增具有强增殖和分化能力的成体小鼠胰腺干/祖细胞的方法。
背景技术：
糖尿病是一种由于胰岛13细胞缺乏或功能缺陷引起的，以血糖增高为特征的代 谢疾病。近年来，随着世界各国社会经济的发展和居民生活水平的提高，糖尿病的发病率和 患病率逐年提高，糖尿病已成为当今医学三大难症之一。糖尿病不仅影响患者的生活质量， 也给病人带来沉重的心理负担，而且糖尿病并发症对患者的健康和生命构成威胁。最近的 临床试验表明，胰岛移植结合免疫抑制治疗可以彻底治愈I型糖尿病，但供体的严重缺乏 制约了这一治疗途径的广泛应用。 胰腺干/祖细胞是一类具有高增殖能力并可以定向分化为胰岛13细胞的多能细 胞，利用胰腺干/祖细胞离体扩增和分化为P细胞可以有效解决移植供体来源不足问题， 因而成为细胞替代疗法治疗糖尿病的基础。但成体胰腺干/祖细胞做为移植供体细胞的来 源目前主要存在以下障碍(l)成体胰腺组织中干/祖细胞比率极低，缺少公认的标志性分 子，难于通过流式细胞术筛选和富集；(2)利用离体培养方法筛选胰腺干/祖细胞过程中， 多种细胞混杂，尤其是成纤维细胞生长旺盛，从而导致上皮来源的胰腺干/祖细胞难于被 纯化和大量扩增。因此，首先富集胰腺干/祖细胞，在培养过程中排除成纤维细胞污染，进 一步纯化胰腺干/祖细胞并大量扩增是离体条件下获得充足胰腺干/祖细胞的关键环节。
发明内容
本发明利用模式动物小鼠建立了一种新型高效的胰腺干/祖细胞筛选方法，通过
胶原酶部分消化富集获得胰腺干/祖细胞，根据不同类型细胞贴壁速度不等的原理，采用
了两次转接、反复贴壁的方法有效筛除了成纤维细胞，并进一步挑取具有强增殖能力的单
细胞集落，最终筛选获得一群均质的，具有典型干/祖细胞特性的胰腺上皮细胞。
具体步骤如下 —、小鼠胰腺组织的取材 1.取1 2只健康成年小鼠，颈椎脱臼法处死，用70% 75%乙醇浸泡5分钟，超
净台内打开小鼠腹腔，沿脾脏下方至十二指肠回弯处，用剪刀小心剪下淡粉色的胰腺组织。
2.在体视显微镜下剔除胰腺上的脂肪、血管、系膜及淋巴结，PBS缓冲液清洗两 遍。 3.将胰腺移入干净的3.5cm培养皿中，用弯头剪剪成约lmm3大小的组织块，加入 适量PBS缓冲液清洗一次，去除组织及细胞碎片。
二、胰腺单细胞的分离 1.向盛有胰腺组织的培养皿加入1 2mL 0. 8mg/mL胶原酶IV消化液以及20ul
30. lmg/mL的DNA酶I，置于37。C培养箱消化20min。 2.加入1.5 2mL冷PBS缓冲液，用带有剪去尖部枪头的移液器反复吹打组织，使
从组织块上消化下来的单细胞尽可能解离释放出来，自然沉降约10 15秒，收集含单细胞
的上清于15mL离心管中，重复清洗组织块操作4 5次后弃掉未消化的组织块。 3.将收集到的上清液置于水平离心机中，800 900rpm/min离心5min。弃去上清
液、上层的细胞碎片、DNA絮状缠绕物及中间层血细胞，保留最下层乳白色的胰腺实质细胞层。 三、胰腺干/祖细胞的筛选与纯化 1.用含10%胎牛血清(FBS)的D/F12培养基重悬细胞沉淀，将胰腺单细胞悬液接 种于1个6cm培养皿中，37t: 5% C02培养箱中培养40min。 2.将未贴壁的细胞连同培养基一起转接到2个新6cm培养皿中，培养过夜，原培养 皿中已贴壁细胞主要为成纤维细胞，弃掉此培养皿。 3.将第一次转接后过夜培养的皿中仍未贴壁细胞及其培养基一起转接到另外2 个新6cm培养皿中，进行再过夜培养，第一次转接后过夜培养贴壁的细胞换成扩增培养基 继续培养。 4.24h后，弃去第二次转接后再过夜培养的皿中未贴壁的细胞及其培养基，贴壁细 胞换成扩增培养基继续培养，每3天更换1/2原培养基。 5.扩增培养基为添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100iig链霉素、2X FBS 、 2 % B27 、 20ng/mL表皮生长因子、10ii g/mL胰岛素、501111101/1^ -巯基乙醇的DMEM/F12
培养基。 6.第一次和第二次转接后贴壁的细胞大部分为形态如铺路石状的胰腺上皮细胞， 其间偶尔掺杂成纤维细胞；扩增培养3 5d后，上皮细胞迅速增殖，在培养皿底壁可见一些 含有100个细胞左右的小集落，而成纤维细胞生长处于劣势；培养7 10d后，可见多于300 个细胞的大集落。 7.扩增培养15d后，培养皿内出现多于500个细胞的大集落，此时通过挑取上皮细 胞集落方法进一步纯化胰腺干/祖细胞利用0. 125%胰蛋白酶消化液对单个大细胞集落 进行点状消化，收集集落内细胞，接种于48孔板培养孔中，加入含10% FBS的D/F12培养 基，37t: 5% C02培养箱中培养过夜。24h后，弃去孔板中未贴壁的细包及其培养基，换成扩
增培养基继续培养。 四、胰腺干/祖细胞的大量扩增和保存 1.挑取至48孔培养板中的集落细胞经扩增培养3d，纯净的上皮细胞成集落样生 长，逐渐在培养孔底壁大范围汇合，3d后布满培养孔，此时可将孔内细胞传代至6cm培养皿 中。 2.弃去孔内培养基，加入0. 8mLPBS缓冲液冲洗一次，加入50 y L 0. 125%胰蛋白
酶消化液，室温消化lmin，加入含10% FBS的D/F12培养基，吹打3 4次，使细胞脱壁，将
细胞接种于1个6cm培养皿中，吸打均匀，37t: 5% C02培养箱中培养过夜。 3. 24h后，弃去培养皿中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养，约
7d后，细胞布满培养皿底壁，此时可对细胞按上述方法进行l : 3传代，并可按常规方法大
量冻存。
具体实施例方式
1.超净台和无菌间用紫外照射灭菌40min，然后关闭紫外设备，打开排风系统， 5min后进入无菌间。 2.取3个直径3.5cm的培养皿，置于超净台，其中两个加入2mL冷PBS (4°C )，置 于冰袋上，备用。 3.准备两套无菌手术器械，置于超净台，备用。 4.颈椎脱臼法处死l只小鼠，将其置于75X乙醇中浸泡3min，消毒后带入无菌间。
5.将小鼠左腹面向上，平置于干净的10cm玻璃皿中，在超净台将小鼠腹腔打开， 暴露内脏，小心的将胰腺取下，置于盛有冷PBS的3. 5cm培养皿中。 6.盛有胰腺组织的小皿移至体视显微镜下，用尖头镊子剔除脂肪、血管、系膜以及 淋巴结，然后将胰腺移至另一盛有冷PBS的3. 5cm培养皿中洗涤一次。
7.将剔净的胰腺组织移入第三个培养皿，用弯头剪将胰腺组织剪成O. 1咖3大小的 组织块，加入2mLPBS清洗一次，以去除组织及细胞碎片。 8.加入1 2mL 0. 8mg/mL胶原酶IV消化液以及20ul 0. lmg/mL的DNA酶I，置 于37。C培养箱消化20min。 9.将培养皿从培养箱中取出，用移液器加入1. 5 2mL冷PBS，将枪头剪成合适 大小，反复吹打组织，使组织块及细胞团中的单细胞尽可能多的解离释放出来，经自然沉降 10 15秒，吸取上清，收集于15mL离心管中。 10.重复步骤9清洗组织块的操作5次左右，弃掉未消化的组织块，将收集到的上 清液置于水平离心机中，800 1000rpm/min离心5min。 11.弃去上清液，上层的细胞碎片、死细胞来源的DNA絮状缠绕物等，以及中间层 的血细胞，保留最下层乳白色的实质细胞。 12.用含10% FBS的D/F12培养基重悬细胞沉淀，将胰腺单细胞悬液接种于一个 6cm培养皿中，37t: 5% C02培养箱中培养40min。 13.将未贴壁的细胞连同培养基一起转接到2个新6cm培养皿中，培养过夜，弃去 已贴壁细胞。 14. 24h后，将转接后过夜培养的皿中仍未贴壁的细胞及其培养基再次转接到另外 2个新6cm培养皿中，再进行过夜培养，第一次转接后贴壁的细胞换成扩增培养基继续培养。 15.24h后，弃去第二次转接后孔板中未贴壁的细胞及其培养基，对贴壁细胞换成 扩增培养基继续培养，每3天更换1/2原培养基。 16.扩增培养基的配制DMEM/F12培养基，添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉
素-lOOii g链霉素、2X FBS、2% B27、20ng/mL表皮生长因子、10ii g/mL胰岛素、50iimo1/
LP-巯基乙醇，4t:贮存，备用。如15天内没有用完需按原比例补加谷氨酰氨。 17.扩增培养15d左右，用10iiL枪头吸取3 5iiL0. 125%胰蛋白酶消化液，对
细胞集落(300 500细胞大小)进行点状消化，吸打8 15次，挑取细胞集落，接种于48
孔板培养孔中，加入含10% FBS的D/F12培养基，吸打均匀，37t: 5% C02培养箱中培养过夜。
18.24h后，弃去孔板中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养。
19.3d后细胞布满培养孔底壁，弃去孔内培养基，加入0.8mL PBS缓冲液冲洗一 次，加入50ii L 0. 125%胰蛋白酶消化液，室温消化lmin，加入含10% FBS的D/F12培养基， 吹打3 4次，使细胞脱壁，将细胞接种于1个6cm培养皿中，吸打均匀，37t: 5% C02培养 箱中培养过夜。 20.24h后，弃去培养皿中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养。
21.约7d后，细胞布满培养皿底壁，弃去皿中培养基，加入2mL PBS缓冲液冲洗一 次，加入500ii L 0. 125%胰蛋白酶消化液，室温消化1 2min，加入含10% FBS的D/F12培 养基，吹打5 8次，使细胞脱壁，将细胞平均接种于3个6cm培养皿中，吸打均匀，37°C 5% (A培养箱中培养过夜。 22.24h后，弃去培养皿中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养。平 均每7天按同样方法对细胞进行1:3传代。
附图是采用胶原酶部分消化后两次转接富集筛选胰腺干/祖细胞，并挑取单细胞 集落扩增胰腺干/祖细胞的具体流程。
权利要求
一种小鼠胰腺干/祖细胞的离体筛选扩增技术，其特征在于通过胶原酶部分消化、两次转接，挑取细胞集落的方法筛选和扩增出具有强增殖能力及多向分化潜能的成体胰腺干/祖细胞的技术方法。步骤如下(1)胶原酶部分消化向剪碎的胰腺组织块中加入0.8mg/ml胶原酶IV消化液及0.1mg/mL的DNA酶I，体积以没过组织为准，37℃孵育20分钟对胰腺组织进行部分消化。(2)胰腺干/祖细胞筛选用含10％胎牛血清的D/F12培养基重悬细胞沉淀，将胰腺单细胞悬液接种于一个6cm培养皿中，37℃5％CO2培养箱中培养40min，将未贴壁的细胞连同培养基一起转接到2个新6cm培养皿中，培养过夜；24h后，将经过夜培养皿中仍未贴壁的细胞及其培养基一起第二次转接到另外2个新6cm培养皿中，再进行过夜培养，第一次转接过夜培养贴壁的细胞换成扩增培养基(添加有2mmol/L谷氨酰氨、100IU青霉素-100μg链霉素、2％胎牛血清、2％B27、20ng/mL表皮生长因子、10μg/mL胰岛素、50μmol/Lβ-巯基乙醇的DMEM/F12培养基)继续培养；24h后，弃去第二次转接再过夜培养皿中未贴壁细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养，每3天更换1/2原培养基；扩增培养15d左右。(3)挑取两次转接后获得的大上皮细胞集落进一步筛除成纤维细胞10μL枪头吸取3～5μL 0.125％胰蛋白酶消化液，对准两次转接后获得的一个大上皮细胞集落(300～500个细胞大小)进行点状消化，吸打8～15次，收集细胞接种于48孔板培养孔中，加入含10％胎牛血清的D/F12培养基，吸打均匀，37℃5％CO2培养箱中培养过夜。24h后，弃去孔板中未贴壁的细胞及其培养基，换成扩增培养基继续培养。
全文摘要
本发明公开了一种新型、高效的小鼠胰腺干/祖细胞离体筛选扩增技术，包括小鼠胰腺组织的取材、胰腺单细胞的分离、胰腺干/祖细胞的富集与纯化、胰腺干/祖细胞的大量扩增等步骤。本发明的技术关键是通过胶原酶部分消化富集胰腺干/祖细胞，通过两次转接方法有效地筛除成纤维细胞，最后通过胰蛋白酶点状消化挑取细胞集落的方法纯化胰腺干/祖细胞并大量扩增，最终筛选获得一群均质的，具有强增殖能力及多向分化潜能的胰腺上皮干/祖细胞。
文档编号C12N5/071GK101735977SQ20101003245
公开日2010年6月16日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者张丽新, 滕春波, 王法 申请人:东北林业大学;滕春波;王法