一种微生物酶法拆分dl-半胱氨酸制备d-胱氨酸和l-色氨酸的方法

专利名称：一种微生物酶法拆分dl-半胱氨酸制备d-胱氨酸和l-色氨酸的方法
一种微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色
氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术生产氨基酸的技术领域，涉及通过微生物酶法拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。
背景技术：
胱氨酸是重要医药中间体，也常用于制备复方氨基酸口服制剂或输液、染化剂、化 妆品、乳制品添加剂、油脂抗氧剂等；还可用于重金属解毒剂、肝炎等药物。胱氨酸具有促 进机体细胞氧化还原能力，增强白血球以防止病原菌感染，可用于治疗白血球减少症、冠心 病，防治脂肪肝、肝硬化，促毛发生长、防皮肤老化，也可用于伤寒痢疾、流感、气喘、神经痛、 湿疹及各种中毒等疾患的治疗。D-胱氨酸为D-半胱氨酸的二聚体，通过还原手段可以有效获得重要的药物中间 体D-半胱氨酸。D-半胱氨酸是一种非天然氨基酸，可广泛应用于医药、食品、化妆品、饲料 等行业，是手性药物的重要中间体，如D-半胱氨酸是合成第三代头孢菌素——头孢米诺钠 的重要原料，在7β位侧链末端引入了 D-半胱氨酸，具有很强的杀菌作用，可以用于治疗 呼吸道感染；由D-半胱氨酸衍生得到的D-青霉胺可作为解毒药，用于重金属的拮抗剂，也 用于类风湿性关节炎及慢性活动性肝炎等免疫性疾病；另外，2-(2，4_ 二酚羟基)-4，5_ 二 氢噻唑_4 (S)-羧酸、N-乙酰-D-半胱氨酸、FK-228, N-(S)-3-烷基庚酰基-D-R-谷氨酰 基_甘氨酰基-D-丙氨酸和阿奇霉素等系列药物均以D-半胱氨酸为原料药物。除此之外， D-半胱氨酸盐还是大肠杆菌的强抑制剂，也可作为急性酒精中毒的缓解剂，同时也是一些 蛋白酶的抑制剂，在炎症以及HIV治疗等方面也具有一定疗效，因此用途十分广泛。D-半胱氨酸盐酸盐的制备工艺比较复杂，通常采用不对称合成方法制备，反应步 骤多，生产控制难度大，需要使用价值昂贵的手性试剂；而酶法拆分反应条件温和，选择性 强，副反应少，收率高，光学纯度高，是D-半胱氨酸的生产的有效方法。L-色氨酸是人和动物体内的重要必需氨基酸，在医药、食品和饲料等领域均具有 非常广泛的用途。近年来，由于饲料工业发展迅速，以及L-色氨酸在医药行业的用途不断 扩大，国内外对于L-色氨酸的需求量日益增加。但由于长期以来L-色氨酸的生产难度高、 价格昂贵，除医药用途外，L-色氨酸在其它领域均未能大量推广应用。L-色氨酸的生产方法主要有蛋白水解提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法 合成法四种。其中，酶法合成法利用化学合成的前体物为原料，既充分发挥了有机合成技 术的优势，又具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易等优点。酶法合 成L-色氨酸的途径主要涉及色氨酸合成酶(EC 4. 2. 1. 20)和色氨酸酶(EC 4. 1. 99. 1)，二 者均可催化L-丝氨酸和吲哚合成L-色氨酸。由于吲哚对色氨酸合成酶具有强烈的抑制作 用，而色氨酸酶对吲哚则具有良好的稳定性，所以近年来人们更为关注色氨酸酶在L-色氨 酸生物合成中的应用。色氨酸酶正常情况下分解L-色氨酸生成丙酮酸、吲哚和氨，但在高浓度丙酮酸和氨的条件下也能有效的催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸。该酶还能催化L-丝氨酸或 L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸。色氨酸酶催化丙酮酸、吲哚和氨合成L-色氨酸的途径 中，由于底物吲哚对色氨酸酶抑制作用较弱，且丙酮酸价格不高，因而具有一定的实用性， 但该途径是色氨酸水解的逆反应，要求底物浓度较高，反应平衡不易把握。而以L-丝氨酸 和吲哚为原料合成L-色氨酸的途径中，由于底物L-丝氨酸的价格几乎与L-色氨酸相当， 因此实用性不强。因此利用色氨酸酶催化L-半胱氨酸和吲哚合成L-色氨酸的途径中，由 于底物L-半胱氨酸的生产成本较为低廉，因此该途径具有重要的工业化应用价值。目前DL-半胱氨酸拆分主要是采用化学方法，化学拆分法是使外消旋体与手性试 剂作用生成非对映体，利用非对映体物理、化学性质的差异而将它们分开。以DL-半胱氨酸 为原料，分别采用路线如下⑴以L-酒石酸为拆分剂，经由2，2- 二甲基四氢噻唑-4-羧 酸不对称转化，生成D-2，2- 二甲基四氢噻唑-4-羧酸-L-酒石酸盐，使其在水溶液中水解， 得到D-半胱氨酸。(2)以DL-半胱氨酸为原料，先制备D-4-四氢噻唑-4-羧酸，然后再使 其和羟胺反应得到半胱氨酸，之后利用优先结晶的方法得到旋光异构体。(3)以L-噻唑啉 羧酸为拆分剂，生成DL-半胱氨酸-噻唑啉羧酸盐，利用优先结晶的方法得到D-、L-半胱氨 酸_噻唑啉羧酸盐，之后采用三乙胺处理可得到光学纯度的D-和L-半胱氨酸。而化学拆 分方法具有步骤长，收率低，不利于环保的特点。
酶是有旋光性物质，而且由于它化学反应的专一性，所以可以选择适当的酶作为 外消旋体的拆分试剂。但往往在酶的作用下，对映体之一被消耗掉，这是这种方法的缺点。 2009年，焦庆才等(200910032018.9)以DL-半胱氨酸作为原料，将具有高活力L-色氨酸 酶的基因工程大肠杆菌的菌体细胞与含有DL-半胱氨酸的混合氨基酸或DL-半胱氨酸盐酸 盐的转化液混合，30 45°C下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离了交 换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度D-半胱氨酸和L-色氨酸。而本发明利用 高效表达色氨酸酶的重组枯草芽胞杆菌的发酵液为酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱 氨酸的同时将L-半胱氨酸转化为L-色氨酸，克服了采用菌体细胞温度耐受性低，催化效率 低，产物中混杂有菌体细胞，分离纯化繁琐等缺点。本发明方法不但可以实现DL-半胱氨酸 的拆分和L-色氨酸的制备，而且发酵成本低，转化效率高，分离效果好，具有良好的产业化 价值。

发明内容本发明的目的是解决现有DL-半胱氨酸拆分技术中存在的问题，提供一种微生物 酶法拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸和L-色氨酸的绿色转化方法。本发明涉及基因工程菌枯草芽胞杆菌WB600-pWB980-tnaA发酵液为酶源，以底物 DL-半胱氨酸和吲哚出发，经基因工程分泌表达的色氨酸酶直接催化拆分获得D-半胱氨酸 及副产物L-色氨酸，并经氧化和分离纯化最终获得产物D-胱氨酸和L-色氨酸的工艺路 线。本发明自行构建了高效分泌型表达色氨酸酶的枯草芽胞杆菌基因工程菌株 WB600-pffB980-tnaA,即以大肠杆菌JM109菌株基因组DNA为模板，PCR扩增获得色氨酸酶 基因(Genebank No. X15974. 1)，在枯草芽胞杆菌WB600中进行重组表达，优化后的发酵液 重组表达的色氨酸酶活力可达1000U/mL以上。其中枯草芽胞杆菌受体菌株WB600以及对应的表达载体PWB980均为文献报道和商业化可利用的表达体系。以上述重组菌株的发酵液为酶源，本发明建立了以DL-半胱氨酸和吲哚为底物， 经酶促反应生物拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。
本发明提供的微生物酶法拆分DL-半胱氨酸生产D-胱氨酸和L-色氨酸的方法， 具体包括以表达色氨酸酶的基因工程重组菌的发酵液为酶源，酶促反应过程中，向反应体 系中加入底物DL-半胱氨酸用量为5g/L至50g/L ；底物吲哚用量为3g/L至30g/L ；辅酶磷 酸吡哆醛的用量为0. 05g/L至0. 25g/L。在40至60°C下，pH值为7至9，经酶法转化反应 2至6h，产生D-半胱氨酸和L-色氨酸，进一步通入空气氧化后得到D-胱氨酸。本发明分离拆分氧化后获得的D-胱氨酸的纯化方法是将上述反应液调节pH至 5. 0，对D-胱氨酸进行等电点沉淀。本发明所产生的L-色氨酸的分离纯化方法是，等电点 沉淀后的上清液，采用S-8型大孔树脂去除其中残留的吲哚，再用NKA-II型大孔树脂吸附 L-色氨酸，经50%乙醇洗脱，减压浓缩干燥，获得L-色氨酸。在本发明实施例中，采用柱前衍生化HPLC法来测定D/L-半胱氨酸的含量， 衍生化试剂为Marfey试剂，即1_氟-2,4- 二硝基苯基-5-L-丙氨酰胺(l-fluoro-2, 4-dinitrophenyl-5-L-alanine amide, FDAA)。它含有一个手性碳原子，在与含手性碳原 子的氨基酸反应时，由于空间位阻的影响，可以有效地抑制氨基酸发生消旋化反应，因此可 以将两种不同构型的同一氨基酸衍生为非对映异构体，从而达到分离鉴定的目的。柱前衍 生化方法如下以100 μ L 10mmol/L Na2CO3溶液(pH9)溶解半胱氨酸，使其终浓度为10 40mmol/L，随后加入到的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入2N HCl 20 μ L 终止反应，20 μ L进样用于HPLC分析。色谱条件C18色谱柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α， 250X4. 6mm)，以A相水(含0. 1 % TFA)、B相乙腈(含0. 1 % TFA)为流动相，梯度洗脱 0. Omin, 55% Affi ； 11. Omin，47% A相；室温，检测波长340nm，流速为lmL/min。连续进样5 次，计算峰面积并取平均值，以D/L半胱氨酸浓度(X，mmol/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐 标绘制标准曲线。酶促反应所产生的D-半胱氨酸经稀释10倍后取100 μ L，按上述方法进 行衍生后，以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量。在本发明实施例中，采用高效液相色谱法来测定L-色氨酸的含量，具体方法 如下分别取50 200mg/L浓度的L-色氨酸标准液20 μ L进样，色谱条件C18色谱 柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α, 250 X 4. 6mm)，流动相甲醇lmmol/L 磷酸 二氢钾 (30 70)，室温，检测波长225nm，流速为lmL/min。连续进样5次，计算峰面积并取平均值， 以L-色氨酸浓度(X，mg/L)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产 生的L-色氨酸和精制后的L-色氨酸，经高效液相色谱检测后与标准曲线相比较即可进行 精确定量。本发明的有益效果本发明以底物吲哚和DL-半胱氨酸出发，利用高效表达色氨 酸酶的枯草芽胞杆菌WB600-pWB980-tnaA的发酵液为酶源，酶法拆分DL-半胱氨酸生产 D-胱氨酸和L-色氨酸。由于采用发酵液直接进行酶法拆分，温度耐受性好，催化效率高，产 物中不含有菌体细胞，分离纯化简单，而且发酵成本低，因此本发明在D-胱氨酸和L-色氨 酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。
图1 :D_半胱氨酸标准曲线A =FDAA衍生的D-半光氨酸标准品色谱图；B =D-半胱氨酸定量分析标准曲线；1 衍生试剂FDAA ；2 =FDAA-D-半胱氨酸图2 :L-色氨酸标准曲线A =L-色氨酸标准品色谱图；B =L-色氨酸定量分析标准曲线图3 色氨酸酶专一性分析A =DL-半胱氨酸标准准品衍生色谱图；B =L-色氨酸衍生色谱图；C 反应液衍生色 谱图；1 衍生试剂FDAA ；2 =FDAA-D-半胱氨酸；3 =FDAA-L-半胱氨酸；4 =FDAA-L-色氨酸图4 重组枯草芽孢杆菌发酵液为酶源的转化条件分析A 反应时间与L-半胱氨酸转化率的关系；B pH 与L-半胱氨酸转化率的关系；C 反应温度与与L-半胱氨酸转化率的关系；D 辅酶PLP与L-半胱氨酸转化率的关系；E 底 物吲哚与L-半胱氨酸转化率的关系；F 底物DL-半胱氨酸与L-半胱氨酸转化率的关系图5 =D-胱氨酸的纯度分析1 衍生试剂 FDAA ；2 =FDAA-D-胱氨酸
图6 :L_色氨酸纯化及纯度分析A 洗脱曲线；B 纯度分析图。
具体实施方式实施例1基因工程菌枯草芽胞杆菌的构建及色氨酸酶的高效表达根据大肠杆菌K12菌株的色氨酸酶基因序列，设计色氨酸酶基因上游引物Pl 5，-CCG AAGCTT ATG GAA AAC TTT AAA CAT CTC C-3，和下游引物P2 5'-CCC GGA TCC TFA AAC TFCTTT CAG TTT TGC GG-3，，以大肠杆菌JM109菌株的基因组DNA为模板，PCR扩增获 得色氨酸酶基因，并分别构建重组表达质粒pWB980-tnaA。将重组质粒转化至枯草芽孢杆菌WB600，构建得到色氨酸酶基因工程菌株。将阳性重组菌株接种于4mL含有卡那霉素20 μ g/mL的LB培养基中过夜培养，随 后以2%转接量接入50mL含有卡那霉素20 μ g/mL的新鲜LB培养基中，37°C振荡培养24h， 离心去除菌体，取上清液，测定相应的色氨酸酶活力，每毫升发酵液的酶活力可达510U。实施例2柱前衍生HPLC法测定D/L-半胱氨酸的含量柱前衍生化方法如下以100 μ L 10mmol/L Na2CO3溶液(pH9)溶解半胱氨酸，使其 终浓度为10 40mmol/L，随后加入到1 %的FDAA 200 μ L丙酮溶液中，40°C孵育Ih后，加入 2NHC1 20 μ L终止反应，20 μ L进样用于HPLC分析。色谱条件C18色谱柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α，250X4. 6mm)，以 A 相水(含 0. 1% TFA)、B 相乙腈(含 0. 1% TFA)为流动相，梯 度洗脱0. Omin, 55% Affi ； 11. Omin，47% A相；室温，检测波长340nm，流速为lmL/min。连 续进样5次，计算峰面积并取平均值，以D-半胱氨酸浓度(X，mmol/L)为横坐标，峰面积(Y) 为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的D-半胱氨酸经稀释10倍后取100 μ L，按上述方法进行衍生后，以HPLC测定，依据标准曲线进行精确定量。如图1。实施例3
HPLC法测定L-色氨酸的含量精确配置50 200mg/L浓度的L-色氨酸标准液，分别取20 μ L进样，采用HPLC法 测定L-色氨酸的含量。色谱条件C18色谱柱(Phenomenex Luna 5 μ，100Α，250 X 4. 6mm)， 流动相甲醇O.OOlmol/L磷酸二氢钾(30 70)，室温，检测波长225nm，流速为lmL/min。 连续进样5次，计算峰面积并取平均值，以L-色氨酸浓度(X，mg/L)为横坐标，峰面积(Y) 为纵坐标绘制标准曲线。酶促反应所产生的L-色氨酸和精制后的L-色氨酸，经高效液相色谱检测后与标 准曲线相比较即可进行精确定量。如图2。实施例4色氨酸酶发酵将实施例1中的重组枯草芽孢杆菌接种于4mL含有卡那霉素20 μ g/mL的LB培养 基中过夜培养，随后以2%转接量接入120mL含有卡那霉素20 μ g/mL的新鲜LB培养基中， 37°C培养12h ；最后将该种子全部接种于6升发酵培养基中，37°C发酵12h，发酵培养基配方 为0. 5%可溶性淀粉、酵母粉、0.4%玉米浆。收集发酵液过滤去除菌体，得重组枯草芽 孢杆菌发酵液。测定相应的色氨酸酶活力，每毫升发酵液的酶活力可达1020U。实施例5色氨酸酶专一性分析以上述实例4中重组枯草芽孢杆菌发酵液为酶源，在每升发酵液中加入底物 DL-半胱氨酸的加入量为IOg ；底物吲哚用量为5g ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. Ig ；转化温度 为45°C ；转化pH值为8 ；转化时间为3h。采用上述的HPLC方法检测D-半胱氨酸和L-色 氨酸的含量，以确定色氨酸酶的底物专一性。结果如图3所示，催化反应后的反应液中几乎没有L-半胱氨酸色谱峰，取而代之 的是相对应的L-色氨酸峰，同时D-半胱氨酸几乎没有损失，证明该色氨酸酶具有较好的专一性。实施例6以枯草芽孢杆菌发酵液为酶源，考察L-半胱氨酸的转化率以上述实例4中重组枯草芽孢杆菌发酵液为酶源，分别在每升发酵液中加入底 物DL-半胱氨酸的加入量为5 50g ；底物吲哚用量为3 30g ；辅酶磷酸吡哆醛的量为 0. 05g 0. 25g ；转化温度为20 60°C ；转化pH值为6 10 ；转化时间为1 6h。(以上 各参数具体取值如图4中各点所示，此处略)考察不同的转化条件对L-半胱氨酸转化率的 影响，并采用实施例3中的方法检测L-色氨酸的含量。图4A 考察反应温度与L-半胱氨酸转化率的关系；底物DL-半胱氨酸用量为25g ； 底物吲哚用量为IOg ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. Ig ；转化PH值为7 ；转化时间为2h。图4B 考察pH与L-半胱氨酸转化率的关系；底物DL-半胱氨酸用量为25g ；底物 吲哚用量为IOg ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. Ig ；转化温度为50°C ；转化时间为2h。图4C 考察反应时间与L-半胱氨酸转化率的关系；底物DL-半胱氨酸用量为25g ； 底物吲哚用量为IOg ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. Ig ；转化温度为50°C ；转化pH值为8。
图4D 考察辅酶PLP与L-半胱氨酸转化率的关系；底物DL-半胱氨酸用量为25g ；底物吲哚用量为IOg ；转化温度为50°C ；转化pH值为8 ；转化时间为3h。图4E 考察底物吲哚与L-半胱氨酸转化率的关系；底物DL-半胱氨酸用量为25g ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. 15g ；转化温度为50°C ；转化pH值为8 ；转化时间为3h。图4F 考察底物DL-半胱氨酸与L-半胱氨酸转化率的关系；底物吲哚用量为15g ；辅酶磷酸吡哆醛的量为0. 15g ；转化温度为50°C ；转化pH值为8 ；转化时间为3h。实施例7以枯草芽孢杆菌发酵液为酶源，酶促反应生产D-半胱氨酸和L-色氨酸根据实施例6确定的拆分条件，以上述实例4中重组枯草芽孢杆菌发酵液为酶源， 在1升发酵液中加入磷酸吡哆醛0. 15g，吲哚15g，DL-半胱氨酸20g，反应温度50°C，pH8， 转化时间3h，进行DL-半胱氨酸的拆分。过滤后得酶促反应后的转化液，其中D-半胱氨酸 含量为IOg ；产生的L-色氨酸产量为16. 4g，底物DL-半胱氨酸中的L-半胱氨酸的摩尔转 化率为97. 3%，吲哚的摩尔转化率为62. 7%。实施例8D-胱氨酸的氧化与分离将实施例7的转化液中通入空气，搅拌下氧化20h，调pH至D-胱氨酸的等电点 5. 0，在此条件下析出D-胱氨酸结晶，过滤收集沉淀，约获得9. 27g D-胱氨酸晶体，采用与 实施例2相同的方法进行检测，产物D-胱氨酸纯度达到98. 6%。如图5。实施例9L-色氨酸的分离纯化收集实施例8中等电点沉淀后的转化液，直接上样于S-8型大孔树脂柱 (40X2. 6cm)，流速1. 5mL/min,以吸附溶液中残留的吲哚，流出液再上样于NKA-II大孔树 脂柱(40X2. 6cm)，流速1. OmL/min，用水充分洗涤后以50%乙醇洗脱，洗脱速度lmL/min。 收集洗脱液，并检测洗脱液中L-色氨酸的含量，合并L-色氨酸洗脱峰，经过减压浓缩干燥 处理后获得L-色氨酸白色粉末15. 24g，采用实施例3的高效液相色谱检测，产物纯度达到 98. 9%。如图 6。
权利要求
一种微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色氨酸的方法，其特征在于该方法包括以表达色氨酸酶的基因工程重组菌的发酵液为酶源，以DL-半胱氨酸和吲哚为底物，在40至60℃下，pH值为7至9，经酶法转化反应2至6h，产生D-半胱氨酸和L-色氨酸，进一步氧化后得到D-胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述重组色氨酸酶基因工程菌的发酵液 的宿主菌为枯草芽胞杆菌WB600，表达载体为分泌型pWB980-tnaA重组表达载体，重组色氨 酸酶菌体细胞的发酵液中表达有高活性的色氨酸酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于以所述的重组枯草芽孢杆菌发酵液为酶 源，在每升发酵液中底物DL-半胱氨酸的加入量为5至50g ；底物吲哚用量为3至30g ；辅酶 磷酸吡哆醛的量为0. 05g至0. 25g。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于每升发酵液中，底物DL-半胱氨酸的用量 优选为20g ；底物吲哚用量优选为15g ；辅酶磷酸吡哆醛的优选用量为0. 15g ；优选转化温 度为50°C ；优选转化pH值为8 ；优选转化时间为3h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于D-胱氨酸的纯化方法是酶促转化液通 入空气氧化5至24h，使产生的D-半胱氨酸氧化为D-胱氨酸，再调节pH为5使D-胱氨酸 等电点结晶析出，收集沉淀得D-胱氨酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于L-色氨酸的纯化方法是，权利要求5等电 点结晶后的上清液，采用S-8型大孔树脂去除其中残留的吲哚，再采用NKA-II型大孔树脂 吸附L-色氨酸，经50%乙醇洗脱、减压浓缩干燥，获得L-色氨酸。
全文摘要
一种微生物酶法拆分DL-半胱氨酸制备D-胱氨酸和L-色氨酸的方法。本发明利用高效表达色氨酸酶的重组枯草芽胞杆菌的发酵液为酶源，以DL-半胱氨酸和吲哚为底物，经酶促反应拆分DL-半胱氨酸产生D-半胱氨酸和L-色氨酸。酶促反应液通过氧化使D-半胱氨酸氧化为D-胱氨酸，再调节pH为5等电点结晶析出D-胱氨酸，收集沉淀得D-胱氨酸。L-色氨酸纯化方法是，采用S-8型大孔树脂去除上述等电点结晶后的上清液中残留的吲哚，再采用NKA-II型大孔树脂吸附其中的L-色氨酸，经50％乙醇洗脱、减压浓缩干燥，获得L-色氨酸；本发明提供了一种新的D-胱氨酸和L-色氨酸的绿色生产工艺路线。
文档编号C12R1/125GK101812488SQ20101003135
公开日2010年8月25日 申请日期2010年1月14日 优先权日2010年1月14日 公开号201010031351.0
发明者侯洁, 张奇, 张玺, 段静静, 白芳, 高智慧, 黎霞 申请人:天津启仁医药科技有限公司