专利名称：一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用悬浮培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用培养基。
背景技术：
白藜芦醇(Resveratrol，Res)，化学名为3，5，4，-三羟基1，2_ 二苯乙烯(3，5， 4' -trihydroxystilbene)，是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。研究发现，Res 可有效抑制血小板的凝集及心血管的异常收缩，降低血脂水平从而起到预防心血管疾病的作用；Res因其抗诱变，抑制与癌症相关的酶活性等作用被视为抑制和治疗癌症的有效药物之一；此外，Res在抗氧化，消除人体自由基，抗病原微生物以及预防老年痴呆症等方面也发挥重要作用，并可广泛地应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域。目前世界上有十余个国家和地区在开发Res原料及其制剂，全球的年生产能力约为50_60t，而市场的年需求量可达100t。而且，随着Res在医药、保健品、化妆品及食品添加剂等领域的进一步的开发和应用，市场需求量会迅速扩大。因此，对Res的研究开发既具有可观的经济前景，又具有良好的社会效益。人类摄取Res目前主要有两种途径，直接食用葡萄和葡萄加工品，二是服用以葡萄、落花生以及中药材植物为原料制取的Res药片及相关保健品。葡萄是人类栽培面积最大的果树树种之一，种质资源极其丰富，且本身Res含量也相对较高，因此，葡萄及葡萄加工品被认为是人类食品中Res的最主要来源。尽管葡萄种质资源丰富，但自然条件下不同葡萄种质间Res含量差异很大，仅有极少数杂交种含量极高。除此之外，同一葡萄属植物的不同器官间Res含量差异较大，在自然条件下，葡萄果皮、种子和果穗轴都含有较高的Res， 叶片中含量较低，而枝条、芽、花、果肉和果汁中的含量极少。目前，仅仅以大面积栽培品种葡萄果实为原料，Res人工提取的效率低，成本将会很高，而采用含量极高的品种为原料进行提取，产量低且受到气候条件的严格限制，而以提取Res为目标栽培自然条件下高Res含量的种质，其经济效益也受到很大的限制。随着植物细胞培养工程技术的发展，人们选择不同的培养方式，改变影响细胞培养的物理化学因素等，可以大大加快植物细胞的生长，提高目的物质的含量，并且不受地理、季节和气候条件的限制，节省野生植物和土地资源，具有生长周期短，经济效益显著等优点。迄今为止，人们已经对1000多种植物进行了细胞培养方面的研究，利用该技术至少能够生产上百种次生代谢物质，而能够实现工业化生产的只有人参、黄连、长春花、紫草等少数几种。目前关于葡萄细胞培养的研究，主要集中在细胞培养筛选突变体、原生质体培养及基因转化等方面，由于技术上的原因，仅有花色素可以利用葡萄细胞培养的方法进行小规模生产，而围绕Res大量生产展开的工作仅在实验水平。尽管利用葡萄细胞培养研究Res 已有报道，但多数学者采用转基因的方法提高细胞中Res的含量，但这种通过转基因技术得到的Res能否正常用于食品及医药工业一直饱受争议。所以，建立一种成熟，纯天然的葡萄高产细胞体系是解决大量生产Res和食品安全之间矛盾有着重要的意义。 目前为止，国内外关于从自然条件下高产Res葡萄基因型及组织器官来着手进行
高产Res细胞生产的研究尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种悬浮培养基。本发明提供的悬浮培养基，是在&基本培养液或NN1969培养液中添加如下物质得到的培养基酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白的终浓度为0. 015-0. 030g/100ml、NAA的终浓度为0. 01-1. 00mg/L、BA的终浓度为0. 05-1. 00mg/L以及碳源的终浓度是2_4g/100ml ；所述&基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述NN1969培养液的溶质是水、溶质如表1所示。表1. &和NN1969基本培养液的溶质
成分B5NN1969KNO32500950NH4NO3-720MgS04-7H20250185KH2P04-68CaCl2.2H20150166KCl--Ca3PO4--NaH2P04-2H20150-MnSO4-H2O1025ZnS04.7H20210
权利要求
1.一种产白藜芦醇细胞的悬浮培养基，它是在&基本培养液或NN1969培养液中添加如下物质得到的培养基酸水解酪蛋白、NAA、BA和碳源；所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白的终浓度为0. 015-0. 030g/100ml、NAA的终浓度为 0. 01-1. 00mg/L、BA的终浓度为0. 05-1. 00mg/L以及碳源的终浓度是2_4g/100ml ；所述4基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述NN1969培养液的溶质是水、溶质如表1所示。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于所述碳源是蔗糖或葡萄糖。
3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于所述悬浮培养基中，酸水解酪蛋白、 NAA、BA和碳源的终浓度是如下1)或2)或3):1)酸水解酪蛋白的终浓度为0.015-0. 025g/100ml、NAA的终浓度为0. 01-0. lmg/L、BA 的终浓度为0. 05-0. lmg/L以及碳源的终浓度是2-4g/100ml ；2)酸水解酪蛋白的终浓度为0.025-0. 03g/100ml、NAA的终浓度为0. 1-1. 00mg/L、BA 的终浓度为0. 1-1. 0mg/L以及碳源的终浓度是2-4g/100ml ；3)酸水解酪蛋白的终浓度为0.025g/100ml、NAA的终浓度为0. lmg/L、BA的终浓度为 0. lmg/L以及碳源是终浓度是3g/100ml。
4.一种制备产白藜芦醇细胞的方法，包括以下步骤1)将葡萄外植体置于愈伤组织的诱导培养基中培养，得到愈伤组织；2)将步骤1)中得到的愈伤组织转入增殖培养基中培养，获得愈伤组织；3)将步骤幻中获得的愈伤组织在权利要求1-3任一所述的悬浮培养基中悬浮培养，得到含有愈伤组织的培养液；4)往步骤幻中的含有愈伤组织的培养液中加入甲基茉莉酸进行诱导处理，得到产白藜芦醇细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述外植体是叶片、种子或果皮；所述外植体优选是叶片。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述叶片选自‘植168’、‘贝达’、‘酶露辄’ 或‘京秀’品种；所述叶片优选来自‘植168’或‘贝达’品种。
7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于所述诱导培养基是在&基本培养液或NN1969培养液中添加蔗糖、2，4-D、BA和凝胶剂得到的培养基；所述诱导培养基中蔗糖的终浓度为3g/100ml、2，4-D的终浓度为0. 05-2. 00mg/L、BA的终浓度为 0. 05-1. 00mg/L ；所述&基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述NN1969培养液的溶质是水、溶质如表1所示。
8.根据权利要求4-7任一所述的方法，其特征在于所述增殖培养基是在&基本培养液或NN1969培养液中添加蔗糖、酸水解酪蛋白、2，4-D、KT、BA和凝胶剂得到的培养基；所述增殖培养基中蔗糖的终浓度为3g/100ml、酸水解酪蛋白的终浓度为 0. 015g/100ml-0. 030g/100ml、2，4-D 的终浓度为 0. 01-1. 00mg/L、KT 的终浓度为 0. 1-2. 00mg/L、BA 的终浓度为 0. 05-1. 00mg/L ；所述&基本培养液的溶剂是水、溶质如表1所示；所述NN1969培养液的溶质是水、溶质如表1所示。
9.根据权利要求4-8任一所述的方法，其特征在于所述悬浮培养的条件是摇床转速 110-130rmp，温度25士2°C，培养周期是14天。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述加入甲基茉莉酸进行诱导处理是在所述悬浮培养的第7天进行；所述甲基茉莉酸的浓度是0-50 μ mol · L—1 (不包括0)，优选是 0. 5-50 μ mol · L—1，更优选是5. 0 μ mol · Γ1 ；所述诱导处理时间为2天。
全文摘要
本发明公开了一种产白藜芦醇细胞的制备方法及其专用悬浮培养基，本发明的专用悬浮培养基是在B5基本培养液或NN1969培养液中添加如下物质得到的培养基酸水解酪蛋白、NAA、KT、BA和碳源；其中酸水解酪蛋白的终浓度为0.015-0.030g/100ml、NAA的终浓度为0.01-1.00mg/L、KT的终浓度为0.1-2.00mg/L、BA的终浓度为0.05-1.00mg/L。本发明将外植体先诱导愈伤组织；再将愈伤组织转入增殖培养基中培养；然后利用紫外线照射的诱导方法确定高产白藜芦醇的葡萄基因型。然后再确定高产白藜芦醇的器官类型。最后通过悬浮培养，大量扩繁细胞并诱导处理，最终获得高产白藜芦醇细胞。
文档编号C12N5/04GK102191214SQ201010122050
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月10日 优先权日2010年3月10日
发明者刘 文, 刘春艳, 吴本红, 李绍华, 段伟, 王立军, 范培格 申请人:中国科学院植物研究所