专利名称：一种编码转录调控因子的基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种编码转录调控因子的基因在改良黄原胶高产菌株中的应用。
背景技术：
黄原胶(Xanthan gum)是一种由野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)所产生的胞外多糖(extracellular polysaccharide, EPS)聚合物，由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过β-(1 — 4)糖苷键连接成主链骨架，一条由甘露糖— 1， 4)_葡萄糖醛酸— 1，幻_甘露糖组成的侧链通过—幻糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基，组成一个“五糖单元”(Swings & Civerolo，1993)。“五糖单元”侧链的甘露糖残基不同程度地被乙酰化或丙酮酰化。不同来源的菌株和不同培养条件所产生的黄原胶的结构基本相同，但侧链的酰基化程度不同，因而乙酸和丙酮酸的含量不同，黄原胶的质量也就不同(Cadmus et al. ,1976 ；Stankowski et al.，1993)。工业生产上通常采用野油菜黄单胞菌野油菜变种(Xanthomonascampestris pv. campestris,简称Xcc)作为生产菌种进行发酵生产黄原胶。黄原胶是目前仅次于抗生素和溶剂的第三大类发酵产品，具有良好的假塑性和流变性，被作为悬浮剂、增稠剂、乳化剂等广泛应用于二十多个工业行业的一百多种产品的生产中。目前全球对黄原胶的年消耗量超过5万吨，并且每年仍以10%的速度增长(Becker et al. , 1998 ；Garcia-Ochoa et al. , 2000 ；Swings & Civerolo,1993)。由于黄原胶具有巨大的商业价值，其生物合成机理的研究从上世纪八十年代起在国际上就受到人们的重视，已发现黄原胶合成的一些重要途径和所需的酶系统。目前已鉴定Xcc染色体上有三簇基因与黄原胶合成有关参与糖核苷等衍生物前体形成的一个 35. 3kb 的基因簇(Harding et al.，1993 ；Koplinet al.，1992)，参与“五糖单元”的顺序性组装、残基修饰、重复单元间的聚合以及黄原胶分泌的gum基因簇(Harding et al. , 1987 ； Ielpi et al.，1993)，以及一个包含三个基因但在黄原胶合成过程的具体作用尚未十分清楚的基因簇(Lu et al.，2007)。尽管人们已对黄原胶的生物合成机理作了较多的研究，但有关黄原胶生物合成的调控、影响黄原胶生物合成的产量和质量的其他代谢途径等问题仍尚未十分清楚。黄原胶在我国的研究开发始于八十年代，并于八十年代末实现了国产黄原胶的工业化生产。但是，国产黄原胶与国外产品相比，生产成本高、产品质量差，不具备与国外产品竞争的能力。目前国外产品在国内黄原胶市场仍占很大的份额，并随着国内黄原胶市场需求的增加其市场份额有逐渐增加的趋势。改良黄原胶生产菌株、提高黄原胶产量和质量，是我国黄原胶生产面临的主要问题。发达国家黄原胶生产菌株的黄原胶产量与国内的生产菌株相比，往往高出20%以上。另外，在黄原胶的粘度、抗盐性和对酸碱热的稳定性等质量指标方面，国外产品也比国内产品要高。因此国内黄原胶生产企业迫切需要优良的黄原胶生产菌株和新的生产工艺。由于采用传统的育种方法改良菌种效果有限，故人们寄望于采用现代遗传工程手段来定向改良菌种。鉴定和克隆与黄原胶生物合成相关的基因，将可为通过遗传工程改良菌种或设计新工艺提供工作基础(Becker et al.，1998 ；Garcia-Ochoa et al.，2000 ；Vanderslice et al.，1988)。微生物拥有一系列通过调节自身基因的表达来使生物体适应不同环境的机制。在基因表达过程中，一种称为转录调控因子的蛋白质分子通过结合在特定的DNA区域，调节特定基因的表达(Gralla & Collado-Vides 1996)。因此，在黄单胞菌合成黄原胶过程中， 有哪些转录调控因子影响黄原胶产量的合成一直是人们所关心的问题。通过对与黄原胶合成有关的转录调控因子的了解，可为采用遗传工程手段改良菌种或设计新工艺提供工作基石出(Becker et al.，1998 ；Garcia-Ochoa et al.，2000 ；Vanderslice et al.，1988)。参考文献Becker,A. ,Katzen,F. ,Puhler,A. et al. (1998). Xanthan gumbiosynthesis and application :a biochemical/genetic perspective.Appl MicrobiolBiotechnol，50 145-152Cadmus, M. C.，Rogovin, S. P.，Burton，K. A. et al. (1976). Colonialvariation in Xanthomonas campestris NRRL B—1459 and characterization of thepolysaccharide from a variant strain. Can J Microbiol,22(7) :942-948Garcia-Ochoa，F.，Santos，V. E.，Casas，J. A. et al. (2000). Xanthangum production，recovery, and properties. Biotechnol Adv,18 :549-579Gralla, J.D. & Collado-Vides, J. (1996). Organization and function of transcription regulatory elements，p. 1232-1245. In F. C. Neidhardt(ed.)， Escherichia coli and Salmonella. ASM Press, Washington, D. C.HardingiN. E. ,ClearyiJ. M. ,CabanaS5D. K. et al. (1987). Genetic andphysical analyses of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesis inXanthomonas campestris. J Bacteriol，169 :2854-2861Harding，N. E.，Raf fo，S.，Raimondi，A.et al. (1993). Identification， genetic and biochemical analysis of genes involved in synthesis sugar nucleotideprecursors of xanthan gum. J Gen Microbiol，139 :447-457Ielpi，L.，Couso，R. 0.，Dankert，Μ. Α. (1993). Sequential assembly and polymerization of the polypreno1-1 inked pentasaccharide repeating unit of thexanthan polysaccharide in Xanthomonas campestris. J Bacteriol，175 :2490-2500Koplin, R.，Arnold，W.， Hotte5 B. et al. ( 1992) . Genetics of xanthanproduction in Xanthomonas campestris the χ an A and xanB genes are involved inUDP-glucose and GDP—mannose biosynthesis. J Bacteriol，174 :191-199Lu,G. T.，Ma，Z.F. ,Hu, J. R. , Tang, D. J. ,He, Y. Q. , Feng, J. X.，Tang，J. L (2007). A novel locus involved in extracellularpolysaccharide production and virulence of Xanthomonas campestris pathovarcampestris. Microbiology,153 :737-746Stankowski, J. D.，Mueller，B. E.，Zeller, S. G. (1993). Location ofa second 0-acetyl group in xanthan gum by the reductive-cleavage method. Carbohydr Res， 241 :321-326
Swings, J. G. &Civerolo, Ε. L (1993). Xanthomonas. London :Chapman& Hall.Vandersl ice，R. W.，Doherty，D. H.，Capage，Μ. Α. et al. (1988). Genetic engineering of polysaccharide structure in Xanthomonas campestris.pp. 145-157. In V.Crescenzi, I. C.M.Dea，S.Paoletti, S. S. Stivala， I. W. Sutherland(ed. ).Biomedical and biotechnological advances in industrialpolysaccharides. New York :Gordon and Breach Science Publishers.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种编码转录调控因子的基因的应用，通过对该基因的失活来有效地提高黄原胶的产量。为了解决上述技术问题，本发明提供了一种编码转录调控因子的基因(XC_2096) 在黄原胶生产中的应用。优选地，该基因的突变体Q020nK)用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。优选地，该基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性的DNA序列。优选地，序列1的DNA序列是野油菜黄单胞菌野油菜变种OCcc)野生菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由648个核苷酸组成，自5'端的第1 3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第646 648位核苷酸为该基因的终止密码子TGA;该基因编码LuxR/ UhpA家族转录调控因子。优选地，在序列表中序列2的蛋白质是该基因编码的转录调控因子的氨基酸序列，由215 个氨基酸组成；该蛋白质预测分子量为23231. 9道尔顿，等电点为6. 45。本发明鉴定了 kc 8004菌株基因组中编号为XC_2096的基因突变后，使细胞合成黄原胶的产量增加，故该基因可用于定向改良黄原胶生产菌株，构建高产的黄原胶基因工程菌。
图1为本发明对XC_2096基因整合突变体Q020nk)的PCR验证，其中M IOObp DNA ladder ； 1 野生型菌株 8004 ;2、3、4 :XC_2096 基因整合突变体 2020nko图2为本发明对XC_2096基因突变体2020nk与黄原胶产量相关的定性检测结果。
具体实施例方式下文结合附图和优选实施例对本发明的技术方案进行详细地描述。以下例举的实施例仅意图说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。本发明请求保护的范围当由后附的权利要求限定。本发明鉴定的一种编码转录调控因子的基因(XC_2096基因)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性的DNA序列。该基因的序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布，基因组序列号 NC_007086，该基因编码蛋白序列号YP_243172. 1。该基因的整合突变体2020nk已在广西大学生命科学与技术学院保存。序列表中序列1的DNA序列是野油菜黄单胞菌野油菜致病变种OCcc)野生菌株 8004的基因组中的一段DNA序列，由648个核苷酸组成。自5'端的第1 3位核苷酸为 XC_2096基因的起始密码子ATG，自5'端的第646 648位核苷酸为该基因的终止密码子 TGA。XC_2096基因编码LuxR/WipA家族转录调控因子。序列表中序列2的蛋白质是XC_2096基因编码的转录调控因子的氨基酸序列，由 215个氨基酸组成。该蛋白质预测分子量为23231. 9道尔顿，等电点为6. 45。在以下实施例中所用到的材料包括Xcc野生型菌株8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The NationalCollection of Plant Pathogenic Bacteria，NCPPB)，保藏号为 NCPPB No. 1145。大肠杆菌(Escherichia coli)株系 JM109 购自 Promega 公司。自杀质粒pK18mob为本研究室保存的柯斯质粒。限制性内切酶、连接酶和其它修饰酶等试剂购自！Iomega、QIAGEN公司等。PCR反应所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。实施例1Xcc中XC_2096基因突变体的构建采用自杀质粒pK18mob诱变XC_2096基因，具体方法参照Windgassen等(FEMS Microbiol. Lett. 2003，193 :201-205)所描述。根据XC_2096基因的DNA序列(基因组序列号NC_007086，Qian et al.， 2005)，设计弓丨物 2020F/R(2020F ACAGTT GGATCCCAGATTCGCCAGCTCAAG ；2020R =ACAGTT GGATCCTTGGCGATGTCTTCCTGG)，以)(cc 8004 菌株总 DNA 为模板，采用 PCR 法(95°C 预变性 4min ；95°C变性 lmin，55°C复性 30s，74°C延伸 30s，30 个循环；74°C延伸 5min)扩增 XC_2096 基因的ORF内127 512bp之间的386bp区域的同源片段，为方便克隆，引物的5'端分别加上BamHI酶切位点序列(即上述DNA引物序列中带有下划线的部分)。DNA片段经BamHI 酶切后，克隆到PKlSmob上。将获得的重组质粒通过三亲本接合导入Xcc野生型菌株8004， 筛选具有卡那霉素(Km)和利福平(Rif)抗性的接合子，三亲本接合具体方法可参考Turner 等所述。随机挑选3株接合子，分别提取总DNA作为模板，以根据自杀质粒pKlSmob的序列和XC_2096终止密码子下游的DNA序列分别设计的引物P18conF (GCCGATTCATTAATGCAGCTGG CAC)和C2020R1 (GATCAGCCATACTCCGCC)进行PCR验证，以8004菌株作为对照。根据设计， 如XC_2096被整合突变，可从突变体的总DNA中扩增出约774bp的PCR产物。PCR反应结果如图1所示，以接合子总DNA为模板时，扩增所获得DNA片段约 770bp，与预期的大小相符，证实了这些接合子是XC_2096的整合突变体，命名为2020nk。实施例2对XC_2020基因突变体2020nk与黄原胶产量相关的检测
野油菜黄单胞菌黄原胶产量的检测是参照Tang等(Mol. Gen. Genet. 1991,226 409-417)所描述方法进行。(1)定性检测将三株XC_2096基因的突变体2020nk接种到IOmL的NYG (每升溶液含5g的蛋白胨，3g的酵母膏和20g的甘油，pH 7. 0 ；Daniels et al.，1984)培养基中，28°C摇床培养过夜，用移液器精确取1 μ L的培养物，分别接种于含2%葡萄糖或蔗糖的NYG培养基平板上， 并以Xcc野生型菌株8004作对照，培养5d。结果可见突变体形成的菌落要比野生型菌株 8004较大较圆润粘稠，如图2所示。这表明与野生型菌株8004相比，突变体2020nk的黄原胶产量增加。(2)定量检测为准确衡量EPS的产量，采用摇瓶发酵准确测定Xcc菌株的产量。将菌株培养在分别添加有葡萄糖和蔗糖的NYG液体培养基中，培养3d后，8004菌株、XC_2096基因的突变体2020nk分别在含葡萄糖、蔗糖的培养基中黄原胶产量结果如表1所示。表 1
突变体2020nkXcc野生菌株8004葡萄糖(9. 45 ±0. 225) g/L(11. 55±0. 213) g/L蔗糖(9. 45 ±0. 225) g/L(11. 55±0. 213) g/L与野生型菌株相比产量增量20%以上从表1数据可以看出，与野生型菌株8004相比，XC_2096基因的突变体2020nk可使得黄原胶产量增加20%以上，表明在Xcc野生型菌株中突变XC_2096基因能够提高提高
黄原胶的产量。从本实施例可以看出，本发明鉴定的基因XC_2096的失活会直接导致野油菜黄单胞菌黄原胶产量增加。因此，该基因可以用于通过遗传工程(或称基因工程)改良黄原胶生产菌种。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，构建、选育出高产优质的黄原胶生产菌株。参考文献Daniels, Μ. J.，Barber, C. Ε.，Turner, P. C.，Sawczyc, Μ. K.，Byrde, R. J. W. & Fielding, Α. H. (1984). Clonging of genes involved inpathogenicity of Xanthomonas campestris pv.campestris using thebroad—host—range cosmid ρLAFR1. EMBO J3, 3323-3328.Qian, W. , Jia, Y. , Ren,S. X. et al. (2005). Comparative and functionalgenomic analyses of the pathogenicity of phytopathogen Xanthomonas campestrispv. campestris. Genome Res 15,757-767.Tang, J. -L. ， Liu, Y. -N. ， Barber, C. E. ， Dow, J. M. ， ffootton, J. C. & Daniels， M. J. (1991). Genetic and molecular analysis of a cluster of rpf genesinvolved in positive regulation of synthesis of extracellular enzymes andpolysaccharide inXanthomonas campestris pathovar campestris. Mol. Gen. Genet. 226 :409-417.Turner， P. ， Barber， C. Ε· &Daniels， Μ· J. (1985) · Evidence for clusteredpathogenicity genes in Xanthomonas campestris pv. campestris. Mol Gen Genetl99,338-343.ffindgassen, Μ. , Urban, A. &Jaeger, K. E. (2000)Rapid geneinactivation in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol. Lett. 193 :201-205.
权利要求
1.一种编码转录调控因子的基因(XC_2096)在黄原胶生产中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因的突变体O020nK)用于构建及选育黄原胶高产的基因工程菌。
3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性的DNA序列。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，所述序列1的DNA序列是野油菜黄单胞菌野油菜变种OCcc)野生菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由648个核苷酸组成，自5'端的第1 3位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第646 648位核苷酸为该基因的终止密码子TGA;所述基因编码LuxR/ UhpA家族转录调控因子。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于，在所述序列表中序列2的蛋白质是所述基因编码的转录调控因子的氨基酸序列，由 215个氨基酸组成；该蛋白质预测分子量为23231. 9道尔顿，等电点为6. 45。
全文摘要
本发明鉴定了Xcc的野生菌株8004基因组中编号为XC_2096的基因突变后的突变体(2020nK)，与野生型菌株8004相比可使得黄原胶产量增加20％以上，表明在Xcc野生型菌株中突变XC_2096基因能够提高提高黄原胶的产量。故该基因可用于定向改良黄原胶生产菌株，构建高产的黄原胶基因工程菌。
文档编号C12P19/06GK102212500SQ20101014300
公开日2011年10月12日 申请日期2010年4月9日 优先权日2010年4月9日
发明者何勇强, 冯家勋, 唐东阶, 唐纪良, 姜伯乐, 李瑞芳, 苏辉昭, 陆光涛 申请人:广西大学