专利名称：一种苯酚羟化酶基因工程菌转化吲哚制备靛蓝的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及将苯酚羟化酶基因重组于大肠杆菌体内形成 工程菌，用于转化吲哚制备靛蓝的方法。
背景技术：
靛蓝是一种具有四千多年历史的色素，广泛用于印染、医药和食品工业。从1890 年起，化学合成靛蓝逐渐取代了植物提取靛蓝，但在化学合成过程中使用的原料和催化剂 对操作者的呼吸道、中枢神经及肝脏有一定的损害，甚至有潜在的致癌毒性，还会产生含有 大量氯化铁、硫酸铁、硫酸钠、氯化钠、苯胺和硝基苯等有毒物质的漂洗废水，对环境有严重 的污染。生物法制备靛蓝可以简化工艺，防止环境污染。1983年，美国Texas大学微生物系 和应用微生物学中心的Ens ley等利用遗传工程技术，将假单胞菌P. put i da PpG7质粒NAH7 中的片段克隆重组后转入大肠杆菌(Escherichia coliHBlOl)，转化子能够在存在吲哚或 色氨酸的条件下合成靛蓝。构建高效的基因工程菌可以提高对芳香化合物的转化效率，它 为解决野生菌活性低等问题提供了崭新的途径。1997年Doukyu等利用假单胞菌ST-200的加氧酶在两相系统中进行生物合成靛 蓝，当加入体积分数为20%的二苯甲烷时，假单胞菌对吲哚的最大耐受量为4mg/mL，靛蓝 的生成量仅为5 u g/mL。2000年，Li等利用色素细胞P450Ph87Leul88Ala74的纯酶转化吲 哚，只有当NADPH存在时，该酶才能将吲哚转化靛蓝，NADPH是一种辅酶，通常作为生物合成 的还原剂，但其价格昂贵，不适于实际应用。现有的关于苯酚羟化酶制备靛蓝的研究，涉及的酶资源较为单一，而且多集中在 转化基因和转化机理方面，实际应用研究有限。2005年，Kim等从Pseudomonas sp. KL33 得到苯酚羟化酶的基因，将该基因重组于大肠杆菌体内形成的工程菌，可以将吲哚转化为 靛蓝，其转化反应为将全细胞悬浮于50mmol/L磷酸缓冲溶液，并加入20mmol/L葡萄糖和 lmmol/L底物，反应时间为48h，反应速度较慢，效率低，产物浓度为19mg/L。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种苯酚羟化酶基因工程菌转化吲哚制备靛蓝 的方法，通过构建苯酚羟化酶基因工程菌，用来转化吲哚得到靛蓝类色素物质，实现生物法 制备靛蓝，产物浓度高，周期短，生产清洁。本发明的技术方案如下苯酚羟化酶基因工程菌，是通过获取高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. ffl中总长 5490bp的苯酚羟化酶基因全长序列，连接至载体质粒(pET28a(+) Vector)，并转化至宿主 细胞大肠杆菌中构建的；该苯酚羟化酶基因工程菌经扩大培养即得全细胞培养物，作为全 细胞催化剂对吲哚进行生物转化，得到的产物为靛蓝类物质。高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. ffl是从石化公司污水处理系统二沉池污泥中筛选到的，该菌株的16SrDNA序列的GenBank注册号为EU339930。通过PCR反应，扩增获得 高效苯酚降解菌Arthrobacter sp. W1的苯酚羟化酶基因保守区序列，并采用染色体步移法 获取未知的侧翼序列，得到含有6个阅读框、按KLMN0P六组分顺序排列的5490bp苯酚羟化 酶基因，其Genbank注册号为FJ610336。将编码苯酚羟化酶的各组分基因序列翻译成氨基 酸，利用BLASTX程序进行同源序列分析，结果显示，该苯酚羟化酶各组分的氨基酸序列与 其他已知的苯酚羟化酶的氨基酸序列相似性较低。生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为1 2g/L， 吲哚浓度为100 600mg/L，葡萄糖的浓度为0. 5 2mmol/L，在20 40°C温度下，摇床转 速为50 200r/min，振荡反应2 14小时。上述生物转化反应的最佳参数为苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为 1. 2 1. 5g/L，吲哚浓度为150 250mg/L，葡萄糖浓度为1 1. 5mmol/L，在25 35°C温 度下，摇床转速为100 180r/min，振荡反应时间为4 8小时。生物转化反应前的苯酚羟化酶基因工程菌扩大培养按常规条件进行。首先将苯 酚羟化酶基因工程菌接种到固体平板LB培养基上培养(即平板活化种子)，再将其接种到 液体LB培养基中，制得种子培养液，然后按体积百分比2 5%的接种量接入液体LB培养 基中振荡培养，待菌体生长至对数期0D6QQ = 0. 4 0. 6，加入80 100 ill (8 lOmmol/ L)的IPTG，诱导至0D_ =1.0-1.2,离心收集菌体，经pH值为7. 0 7. 5、浓度为0. 1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其干重浓度达到1 2g/L。本发明的苯酚羟化酶基因工程菌对吲哚的转化能力较强，且具有广泛的底物广谱 性。使用本发明的苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生成靛蓝的方法，反应条件温和，环 境污染小，产物浓度高，可达到92. 5mg/L，生产周期短，成本低，提取步骤简单，生产清洁，适 合工业生产和应用。
图1为生物转化反应选定其他参数时，靛蓝浓度随苯酚羟化酶基因工程菌全细胞 浓度变化的曲线。图中纵坐标为生成的靛蓝浓度(mg/mL)，横坐标为苯酚羟化酶基因工程菌全细胞 干重浓度(g/L)。图2为生物转化反应选定其他参数时，靛蓝浓度随反应时间变化的曲线。图中纵坐标为生成的靛蓝浓度(mg/mL)，横坐标为时间(h)。图3为生物转化反应选定其他参数时，靛蓝浓度随吲哚浓度变化的曲线。图中纵坐标为生成的靛蓝浓度(mg/L)，横坐标为吲哚浓度(mg/L)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例1，苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生产靛蓝，并考察部分参数对靛蓝 浓度的影响。苯酚羟化酶基因工程菌扩大培养的LB培养基配方为10g/L NaCl, 10g/L蛋白胨， 5g/L酵母提取物，调节pH至7. 0 7. 2。121°C条件下灭菌20min，培养基冷却后添加终浓度为10 20mmol/L卡那霉素作为抗生素。固体平板培养基配方为LB培养基基础上添加 15 20g/L琼脂。步骤和参数如下1、将苯酚羟化酶基因工程菌接种固体平板LB培养基上，于37 °C静置培养2天，4。C 冰箱保存，作为平板活化种子；2、用步骤1所得的平板活化种子，接种到液体LB培养基中，在30°C条件下，150r/ min振荡培养12小时，制得种子培养液；3、使用步骤2所得的种子培养液，按体积百分比2 5%的接种量接入液体LB培 养基中振荡培养，待菌体生长至对数期0D6QQ = 0. 4 0. 6，加入80 100 ill (8 lOmmol/ L)的IPTG，诱导至0D_ =1.0-1.2,离心收集菌体，经pH值为7. 0 7. 5、浓度为0. 1 0. 2mol/L的磷酸缓冲液洗涤，然后用相同缓冲液悬浮，使其干重浓度为1. 4g/L。4、制备吲哚/丙酮溶液(0. lg吲哚溶于lmL丙酮)，然后用滤膜过滤除菌，吲哚/ 丙酮溶液中吲哚浓度为lX105mg/L ；5、制备葡萄糖储备液，取180. 16g葡萄糖溶于1L去离子水，储备液中葡萄糖浓度 为 lmol/L06、在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的苯酚羟化酶基因工程菌全细胞，步 骤4制备吲哚/丙酮溶液40 u L，步骤5制备葡萄糖储备液26 u L，使反应液中吲哚的浓度 为200mg/L，葡萄糖的浓度为1. 3mmol/L，在30°C下，摇床转速150r/min，振荡反应6小时。高效液相色谱(HPLC)测定靛蓝产量反应结束时，上清液用三氯甲烷萃取，并用 0.22UM的有机滤膜过滤，利用Agilent 1100高效液相色谱仪进行检测，检测波长280nm， 流速1. OmL/min,进样量为10 u L，柱温为室温；流动相A为甲醇，流动相B为超纯水。每个 样品的测定时间为35min，其中第1 20min时，流动相A为65 75%，流动相B为35 25 %，第21 35min时流动相A为75 65 %，流动相B为25 35 %。测得靛蓝浓度为 92. 50mg/L。生物转化反应部分参数对靛蓝浓度影响的实验当其他参数采用本实施例的数值时，靛蓝浓度随苯酚羟化酶基因工程菌全细胞浓 度变化的曲线如图1所示。当其他参数采用本实施例的数值时，靛蓝浓度随反应时间变化的曲线如图2所
7J\ o当其他参数采用本实施例的数值时，靛蓝浓度随吲哚浓度变化的曲线如图3所
7J\ o实施例2，苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生产靛蓝。LB培养基配方及步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的苯酚羟化酶基因工程 菌全细胞干重浓度为1. 0g/L ；在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的菌株苯酚羟化酶基因工程菌全细胞， 步骤4制备的吲哚/丙酮溶液20 u L，步骤5制备的葡萄糖储备液10 u L，使反应液中吲哚 的浓度为100mg/L，葡萄糖的浓度为0. 5mmol/L ；20°C下，50r/min振荡2小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为37. 86mg/L。实施例3，苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生产靛蓝。LB培养基配方及步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为1. 2g/L ；在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的菌株苯酚羟化酶基因工程菌全细胞， 步骤4制备的吲哚/丙酮溶液30 u L，步骤5制备的葡萄糖储备液20 u L，使反应液中吲哚 的浓度为150mg/L，葡萄糖浓度为1. Ommol/L, 25°C下，100r/min振荡反应4小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为77. 86mg/L。实施例4，苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生产靛蓝。LB培养基配方及步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的苯酚羟化酶基因工程 菌全细胞干重浓度为1. 5g/L ；在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的菌株苯酚羟化酶基因工程菌全细胞， 步骤4制备的吲哚/丙酮溶液50 u L，步骤5制备葡萄糖储备液30 u L，使反应液中吲哚的 浓度为250mg/L，葡萄糖浓度为1. 5mmol/L, 35°C下，180r/min振荡反应8小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为89. 50mg/L。实施例5，苯酚羟化酶基因工程菌生物转化吲哚生产靛蓝。LB培养基配方及步骤1 5同实施例1，其中步骤3制得的苯酚羟化酶基因工程 菌全细胞干重浓度为2. Og/L ；在50mL的锥形瓶中加入20mL步骤3制得的菌株苯酚羟化酶基因工程菌全细胞， 步骤4制备的吲哚/丙酮溶液120 u L，步骤5制备的葡萄糖储备液40 u L，使反应液中吲哚 的浓度为600mg/L，葡萄糖浓度为2. 0mmOl/L，40°C下，200r/min振荡反应14小时。按实施例1所述的测量方法，测得靛蓝浓度为26. 50mg/L。
权利要求
一种苯酚羟化酶基因工程菌转化吲哚制备靛蓝的方法，其特征在于，苯酚羟化酶基因工程菌是通过获取GenBank注册号为EU339930的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp.W1中总长为5490bp、Genbank注册号为FJ610336的苯酚羟化酶基因全长序列，连接至载体质粒(pET28a(+)Vector)，并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建的；生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为1～2g/L，吲哚浓度为100～600mg/L，葡萄糖浓度为0.5～2mmol/L，在20～40℃温度下，摇床转速为50～200r/min，振荡反应2～14小时。
2.如权利要求1所述的苯酚羟化酶基因工程菌转化吲哚制备靛蓝的方法，其特征在 于，生物转化反应时，反应液中苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为1. 2 1. 5g/L，吲 哚浓度为150 250mg/L，葡萄糖浓度为1 1. 5mmol/L，在25 35°C温度下，摇床转速为 100 180r/min，振荡反应时间为4 8小时。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及将苯酚羟化酶基因重组于大肠杆菌体内形成工程菌，用于转化吲哚制备靛蓝的方法。通过获取GenBank注册号为EU339930的高效苯酚降解菌Arthrobacter sp.W1中总长为5490bp、Genbank注册号为FJ610336的苯酚羟化酶基因全长序列，连接至载体质粒(pET28a(+)Vector)，并转化至宿主细胞大肠杆菌中构建苯酚羟化酶基因工程菌；生物转化反应液中苯酚羟化酶基因工程菌全细胞干重浓度为1～2g/L，吲哚浓度为100～600mg/L，葡萄糖浓度为0.5～2mmol/L，在20～40℃温度下，控制摇床转速在50～200r/min，振荡反应2～14小时。本发明的生物转化方法反应条件温和，产物浓度高，生产周期短，适合工业生产。
文档编号C12N15/53GK101851649SQ201010161539
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者乔森, 吕红, 周集体, 张爱丽, 时胜男, 曲媛媛, 李慧, 项学敏 申请人:大连理工大学