一种16型人乳头瘤病毒L₂E₇基因在大肠杆菌中的优化表达方法

专利名称：一种16型人乳头瘤病毒L₂E₇基因在大肠杆菌中的优化表达方法
技术领域：
本发明属于医学生物技术领域，具体涉及16型人乳头瘤病毒L2E7重组蛋白在大肠杆菌原核表达菌株的构建及其表达条件的优化。
背景技术：
人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)是一类具有严格宿主范围和组织特 异性的病毒，主要感染人的皮肤或粘膜上皮细胞，引起感染部位发生病变。根据其生物学行 为可以将其分为高危型和低危型两大类。低危型人乳头瘤病毒的感染可引起良性肿瘤或 疣，如扁平疣、尖锐湿疣等；高危型人乳头瘤病毒和宫颈癌的发生关系密切。大量分子流行 病学和分子生物学研究已经证明，感染高危型人乳头瘤病毒HPV16，HPV18，HPV31、HPV33， HPV45是宫颈癌发生的主要病因，其中16型HPV在宫颈癌患者中的检出率达50%。宫颈癌 占妇女因癌症死亡原因的第二位，全世界每年有50万新发病例，其中30万人死于宫颈癌， 我国每年因宫颈癌而死亡的人数大约为5万人。人乳头瘤病毒的生物学特性人乳头瘤病毒(HPV)是直径为55nm、约有SOOObp 的小DNA病毒，由环状双链DNA形成的20面体对称的无包膜病毒，在氯化铯中浮密度为 1. 34g/ml。以HPV16为例其基因组分为3个区E区、L区和非编码区(UCR)，E区含8个早 期开放阅读框ORF(El-ES)，分别编码E1-E8早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控 和转化等功能；L区含2个晚期开放阅读框ORF (Li、L2)，编码主要结构蛋白Ll和次要结构 蛋白L2 ；URR区含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。高危型HPV的致癌特性主要由E6和E7这两个编码的早期蛋白引起的，E6蛋白包 含4个Cys-X-X-Cys的保守序列，这些锌指结构具有与DNA、RNA结合和介导蛋白一蛋白相 互作用的功能，从而使病毒和宿主细胞发生整合。HPV整合人宿主细胞不仅使病毒的癌蛋白 得到长期稳定的表达，而且因插入造成宿主DNA的重排，相应的基因紊乱，对细胞的恶性转 化起着重要作用。此外，E6蛋白还与野生型P53基因具有高度的亲和性，二者极易结合促 使后者快速降解，从而使正常细胞生长周期失去调控造成细胞无限增殖并向恶性转化。E7基因表达蛋白是一种只有98个氨基酸的小分子蛋白，其致癌过程主要通过作 用于人体细胞的抑瘤蛋白PRB蛋白来实现。pRB蛋白是一种重要的生长抑制蛋白，在细胞周 期调节中起关键作用。主要通过抑制某些转录因子(如E2F等)活性达到抑制细胞增殖的 目的。正常情况下，非磷酸化的PRb与E2F转录因子形成pRb-E2F复合物，从而抑制E2F对 靶基因的转录，抑制细胞增殖。当E7蛋白介入时，通过其结构上的Rb结合位点与非磷酸化 的pRb结合，造成pRb-E2F复合物分离，E2F的转录作用得到了释放，转录的基因使细胞由 Gl期进入S期，导致细胞周期无法调控，细胞实现“永生化”。HPV病毒株很难从组织灶中分离得到，迄今为止还没能建立起体外培养系统来进 行病毒的培养，并且E6、E7蛋白具有转化活性，完整的病毒颗粒不大可能被发展为疫苗，现 在研制中的HPV疫苗大多属于基因工程疫苗。这些疫苗根据其功能不同大致可分为两大类，即预防性疫苗和治疗性疫苗。
预防性疫苗研究较多的是病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)，通过诱发 中和抗体来防止病毒的感染或再感染。在天然HPV病毒颗粒形成过程中，衣壳蛋白包装病 毒DNA形成成熟的病毒颗粒。研究表明，在许多表达体系如哺乳动物细胞、酵母和细菌中， 单独Ll或Ll和L2共表达后可自行组装成不含病毒DNA的病毒样颗粒(VLPs)，这种病毒样 颗粒与天然病毒颗粒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性。研究表明HPV VLPs能 通过MHC I途径诱导产生细胞免疫。HPV16型Ll装配成的VLPs经鼻免疫小鼠后，可在脾 及阴道淋巴组织中发生淋巴细胞增殖。以产生、干扰素的⑶4+T淋巴细胞增为主，髂骨淋 巴细胞中增生的T淋巴细胞具有T细胞杀伤(CTL)活性，说明VLPs可诱导MHC I类限制性 ⑶8+反应。因为VLPs不含病毒核酸，所以无潜在的致癌危险性，作为疫苗安全可靠。Ll和 L2共表达不仅可增加中和抗体的滴度，而且可加强病毒样颗粒的装配效率，提高VLPs的产 量，同时还可能增加有关的抗原表位以便获得较强的局部黏膜免疫和系统的体液免疫和细 胞免疫反应。因此，以Ll和L2为保护性抗原构建的疫苗在预防HPV感染及其相关肿瘤方
面发挥着重要作用[1°]。病毒样颗粒可通过大规模制备和纯化来实现其商业化，目前由Merck、 GlaxoSmithKline和NIH生产的以VLPs为抗原的HPV预防性疫苗已经通过美FDA批准上 市。治疗性疫苗通常以HPV的早期蛋白(E6、E7)作为靶抗原，旨在诱导特异性的细胞 免疫反应，用于宫颈癌的免疫治疗。高危型HPV E6和E7蛋白，在宫颈癌及其癌前病变中可 以持续表达，而正常组织中不存在，所以这两种蛋白可作为诱导肿瘤特异性CTL反应的理 想靶抗原。然而野生型的E6、E7蛋白免疫原性较弱，具有潜在的致癌性，并且不易被降解而 不利于抗原的递呈。随着HPV抗原表位结构研究的深入，在高危型HPV的E6和E7蛋白中， 已经发现多个能激发CTL的抗原表位[11]，HLA-I类分子限制的HPV-16E7蛋白中氨基酸序列 11 20(E7n_20)和86 93(E7關)。HPV16E7衍生的多肽与HLA-I类分子有高度亲和性， 可以保护小鼠抵抗HPV16转化的同系肿瘤细胞的致死性攻击。HPV16阳性的宫颈癌患者体 外周血淋巴细胞经HPV16 E7n_2(1刺激后，所产生的CTL可以识别和攻击肿瘤细胞[12]。目前，借助基因工程技术，对E6、E7蛋白进行修改或融合其他蛋白，去掉其癌蛋白 的致癌性，增加T细胞识别的特异性抗原表位以提高其免疫效果，已经研制出多种肽类疫 苗，有些已经进入I期或II期临床试验，其中基于E786_93表位的脂多化多肽疫苗在复发性 宫颈癌的治疗中取得了很好的效果。近年来，随着基因工程的发展，又出现了嵌合型VLP(cVLPs)，该类疫苗是原先VLP 疫苗的基础上，在L1/L2蛋白的C末端插入一个异源蛋白，如HPV E6/E7等。嵌合型病毒样 颗粒是同时含有HPV16L1、L2和E7部分表位或Li、L2和E6部分表位的VLP。嵌合型VLP 包含了更多的抗原表位，在刺激体液免疫的同时激活细胞免疫。研究表明[13]将未成熟的 树突细胞(DC)与嵌合的HPV16 L1/L2-E7 VLPs共孵48小时，诱导了 CD80、CD83分子的明 显上调和白介素2的分泌，聚焦显微镜下见到结合嵌合VLPs的细胞周围被树突细胞占满。 而且，与HPV16 L1/L2-E7 VLPs共孵的DC诱导了 HLA-0201限制性的针对该蛋白的CTL反 应。该实验说明嵌合HPV16-VLPS激活了未成熟DC的成熟，继而诱导内源性的针对特定抗原表位的CTL反应，肯定了嵌合VLPs作为疫苗的高度免疫和有效性。Wakabashi MT等人同 时将晚期结构蛋白和E7蛋白的部分表位嵌合在一起刺激机体，不仅能激发体液免疫还能 激活细胞免疫，在诱发高滴度的中和抗体的同时，还可以诱导针对E7蛋白的CD8+CTL反应， 从而保护HPV转化肿瘤的攻击[14]。因此，cVLPs不但可用于制备预防性疫苗，而且可用于 制备治疗性疫苗，具极大的应用前景。L2蛋白是HPV的次要结构蛋白，可以诱发产生中和抗体。早期蛋白E7在宫颈癌 细胞中能持续表达，可以作为理想的靶抗原来诱发特异性的T细胞免疫。因而，运用HPV16 L2E7重组融合蛋白进行免疫能起到预防和治疗的双重效果。
通过基因工程的手段，根据HPV16 L2E7重组融合蛋白的特性，结合成本、产量和纯 化路线确定运用大肠杆菌原核表达系统来大量制备含有HPV晚期结构蛋白和早期转化蛋 白部分结构域的HPV16 L2E7蛋白抗原，从而为HPV疫苗的研制埋下了坚实的基础。由于HPV16 L2E7蛋白在原核表达系统中存在着质粒易丢失的现象，蛋白产量低，妨 碍了 HPV16 L2E7疫苗的开发和商品化。本发明通过构建并提供一株HPV16L2E7蛋白高效表 达菌株，并对其表达条件进行优化，来有效地解决上述问题。目前对宫颈癌的治疗基本以手术和放疗为主，给病人带来很大的痛苦。预防HPV 相关癌症的最有效的方法是研制特异性的疫苗，诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫 反应，达到有效预防与癌症相关的HPV传播的目的，降低宫颈癌的发生率。因此，研制高效、 安全、廉价的疫苗将有着巨大的经济效益和社会效益。

发明内容
本发明的目的是构建一个HPV16 L2E7蛋白的高效表达菌株，提供一种HPV16L2E7蛋 白的优化表达方案。通过筛选得到具有高表达量的表达菌株，然后对所筛选的高表达菌株 的表达条件进行优化，为HPV16 L2E7在以后的大规模生产发酵提供一些依据。本发明的一个内容是通过基因克隆技术把HPV16 L2E7基因插入了 pET32a表达载 体，获得一株高表达HPV16 L2E7蛋白的表达菌株。本发明公开了一种HPV16 L2E7蛋白在大肠杆菌原核表达菌株的构建及其表达条件 的优化方法，通过聚合酶链式反应扩增得到HPV16 L2E7目的基因，然后将扩增产物进行酶 切，继而插入表达载体pET32a。经筛选鉴定得到正确的克隆后，在BL21(ED3)大肠杆菌中 进行表达，从中筛选出具有高表达水平的重组克隆菌，最后从(1)培养基成分，(2)培养基 PH条件，(3)诱导时机，即菌液在600nm波长下的光密度值(0D_)，(4)氨苄青霉素(AMP) 浓度，(5)接种量，(6)诱导剂异丙基硫代半葡萄苷(IPTG)浓度，(7)诱导温度七个方面对 重组工程菌的表达条件进行了比较优化。通过优化试验，得出一系列优化表达条件(1)含 有葡萄糖的M9-TY培养基，(2)培养基初始pH值7.0，(3)诱导时机为菌液在600nm波 长下的光密度(OD6J ^ 1. 1，(4)氨苄青霉素浓度50mg/L，(5)5%的接种量，(6) IPTG浓度 0. 25mM, (7)诱导温度37°C。最终重组蛋白相对表达量大约为15%，包涵体得率接近13%。本试验成功构建了 HPV16 L2E7基因的重组表达载体，并筛选得到了具有高表达水 平的重组工程菌。为下一步进行HPV16 L2E7蛋白的工业发酵，疫苗的下游研发提供参考依 据。HPV16 L2E7蛋白的高效表达方案，其实施方案如下
(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培 养，挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜；(2)用于菌液培养的培养基以传统的M9培养基为基础，选择不同的初始葡萄糖浓 度0.4% _6%，初始胰蛋白胨含量0.5% _1.0%，以及初始酵母提取物含量0.5% -1.0%, 将活化种子菌液按体积比5%的接种比例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体OD6tltl至 0. 2-2.0，然后加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)浓度至0. l-2mM进行诱导，在28-37°C条件下 继续培养3-6小时；(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色；(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2软件分析图片，计算蛋白的相对
表达量。
通过基因克隆技术把HPV16 L2E7基因插入了 pET32a表达载体，获得了一株高表达 HPV16 L2E7蛋白的表达菌株。所用到的培养基配方为菌种固体培养基胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，琼 脂粉5克，加水至1000毫升，高压灭菌；菌种培养基为胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，加水 至1000毫升，高压灭菌；表达培养基为七水磷酸氢二钠12. 8克，磷酸氢钾3克，氯化钠0. 5克，氯化铵1 克，葡萄糖0. 4克，1摩尔硫酸镁2毫升，1摩尔氯化钙0. 1毫升，胰蛋白胨5克，酵母提取物 5克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高压灭菌。本发明的另一个内容是提供一种HPV16 L2E7蛋白的高效表达方案，通过正交试验 的方法，来获得其具体的表达条件。其实施方案如下(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌(pET32a_HPV16L2E7/BL21DE3)，在 菌种固体培养基上划线培养，挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的表达培养基，选择不同的初始葡萄糖浓度0. 4% _6%，初始胰 蛋白胨含量0. 5% -1. 0%以及初始酵母提取物含量0. 5% -1. 0%，将活化种子菌液按体积 比5%的接种比例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体OD6c 至0. 2-2. 0，然后加IPTG浓 度至0. l-2mM进行诱导，在28-37°C条件下继续培养3_6小时。(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色；(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算蛋白的
相对表达量。优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中的菌种固体培养基配方为胰蛋白胨10 克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，琼脂粉5克，加水至1000毫升，高压灭菌；优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中的菌种培养基配方为胰蛋白胨10克， 酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高压灭菌；优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中的表达培养基配方为七水磷酸氢二钠 12. 8克，磷酸氢钾3克，氯化钠0. 5克，氯化铵1克，葡萄糖0. 4克，1摩尔硫酸镁2毫升，1摩尔氯化钙0. 1毫升，胰蛋白胨5克，酵母提取物5克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高压灭菌。“菌种固体培养基配方为胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖 5-10克，琼脂粉5克，加水至1000毫升，高压灭菌。菌种培养基配方为胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖5-10 克，加水至1000毫升，高压灭菌。表达培养基配方为七水磷酸氢二钠12. 8克，磷酸氢钾3克，氯化钠0. 5克，氯化 铵1克，1摩尔硫酸镁2毫升，1摩尔氯化钙0. 1毫升，胰蛋白胨2. 5-5克，酵母提取物2. 5-5 克，葡萄糖5-10克，加水至1000毫升。优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中37°C下培养菌体OD6tltl至1.0左右，力口 IPTG进行诱导。优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中IPTG的添加浓度维持在0. ImM左右。优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中加IPTG诱导后的培养温度维持在37°C。优选地，本发明所述的方法中，步骤(2)中加IPTG诱导后的继续培养5h。本发明还提供了一株高效表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌大肠杆菌(表达质粒简 图，见附件1)。本发明提供了改良的培养基，该培养基能充分满足工程菌在表达蛋白过程中的营 养要求，和传统的表达培养基相比成本下降，并且有效的控制了培养诱导过程中的关键参 数。采用本发明所述的方法，不仅将表达质粒的保有率从40%-50%提高到95%以上，并且 使得HPV16 L2E7蛋白表达效率提高了 40%以上。


图1.显示了 16型人乳头瘤病毒L2E7重组表达质粒的结构简图。图2.显示了 16型人乳头瘤病毒L2E7基因聚合酶链式反应产物酶切结果。图3.显示了 16型人乳头瘤病毒L2E7重组表达菌表达HPV16 L2E7重组蛋白的结^ ο图4.显示了 16型人乳头瘤病毒L2E7重组表达菌表达HPV16L2E7重组蛋白的蛋 白免疫印迹鉴定结果。图5.显示了 16型人乳头瘤病毒L2E7重组表达菌表达HPV16L2E7重组蛋白表达 量的分析结果。
具体实施例方式下列实施例说明但不限制本发明。实施例1 HPV16 L2E7重组表达质粒的构建(1)设计引物HPV16 L2-F :5，-GCTCTAGAAATAATTTGTTTAACTTTAAGAAGGAG这是运用PCR技术扩增HPV16 L2E7基因的正向引物。HPV16 E7-R :5’ -CGGGATCCTTACTATTATGGTTTCTGAGAACAG这是运用PCR技术扩增HPV16 L2E7基因的反向引物。
(2)以HPV16 L2-F和HPV16 E7-R为引物，进行PCR扩增，具体PCR条件为30个循 环的 980C IOs (变性)，55°C 15s (退火)，72°C IOOs (延伸)。 (3)用限制性内切酶XbaI和BamHI对PCR扩增产物进行酶切，通过琼脂糖凝胶电 泳检验酶切产物，切下合适大小的条带纯化回收DNA (见图2)。(4)回收产物连接至限制性内切酶XbaI和BamHI消化过得pET32a载体中。将所 得连接产物转化至BL21 (DE3)大肠杆菌感受态细胞中，涂培养过夜，挑取单克隆菌落鉴定， 获得正确的HPV16 L2E7重组表达菌。实施例2HPV16 L2E7重组表达菌表达HPV16 L2E7重组蛋白 (1)挑取HPV16 L2E7重组表达菌单克隆菌落，于菌种培养基中过夜培养，将活化种 子菌液按体积比5%的接种比例接种于5ml培养基中，37°C下培养菌体0D600至0. 8，然后 加IPTG浓度至ImM进行诱导，在28°C条件下继续培养3小时。(2)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬沉 淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(见 图3)实施例3蛋白免疫印迹鉴定HPV16 L2E7重组表达菌表达HPV16 L2E7重组蛋白将实施例2步 骤(2)中的未经过考马斯亮蓝染色的凝胶中的蛋白通过电转印系统转至PVDF膜上(转印 条件为200mA恒流条件下2小时)，用含有5%脱脂牛奶的磷酸盐缓冲液室温下封闭1小 时，以1 2000的比例加入一抗，4°C过夜培养，用含0. 02%吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤 PVDF膜四遍，每次lOmin，，以1 2000的比例加入二抗，室温培养1小时，用含0. 02 %吐 温-20的磷酸盐缓冲液洗涤PVDF膜四遍，每次lOmin，加入增敏二氨基联苯胺显色液显色。 (见图4)实施例4HPV16 L2E7重组表达菌表达HPV16 L2E7重组蛋白表达量的结果分析将实施例2步骤(2)中考马斯亮蓝染染色所得的SDS-PAGE凝胶通过凝胶成像仪 成像获得表达信息，然后用Quantity one 4. 6. 2软件对所的图像信息进行分析，得到HPV16 L2E7蛋白的表达信息。(见图5)实施例5 HPV16 L2E7在大肠杆菌中的优化表达(一)(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培养， 挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的培养基以M9培养基为基础，初始葡萄糖浓度1 %，初始胰蛋白 胨含量为0. 5%以及初始酵母提取物含量为0. 5%，将活化种子菌液按体积比5%的接种比 例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体0D600至0. 8 (单位)，然后加IPTG浓度至ImM 进行诱导，在28°C条件下继续培养3小时。(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算得到重 组蛋白的相对表达量为10. 21%。
实施例6HPV16 L2E7在大肠杆菌中的优化表达(二)(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培养，挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的培养基以M9培养基为基础，初始葡萄糖浓度1 %，初始胰蛋白 胨含量为0. 5%以及初始酵母提取物含量为0. 5%，将活化种子菌液按体积比5%的接种比 例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体0D600至1.0，然后加IPTG浓度至ImM进行诱 导，在28°C条件下继续培养3小时。(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算得到重 组蛋白的相对表达量为12. 73%。实施例7 HPV16 L2E7在大肠杆菌中的优化表达(三)(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培养， 挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的培养基以M9培养基为基础，初始葡萄糖浓度1 %，初始胰蛋白 胨含量为0. 5%以及初始酵母提取物含量为0. 5%，将活化种子菌液按体积比5%的接种比 例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体0D600至1. 0，然后加IPTG浓度至0. ImM进行诱 导，在28°C条件下继续培养3h。(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算得到重 组蛋白的相对表达量为12.91%。实施例8 HPV16 L2E7在大肠杆菌中的优化表达(四)(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培养， 挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的培养基以M9培养基为基础，初始葡萄糖浓度1 %，初始胰蛋白 胨含量为0. 5%以及初始酵母提取物含量为0. 5%，将活化种子菌液按体积比5%的接种比 例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体0D600至1. 0，然后加IPTG浓度至0. ImM进行诱 导，在37°C条件下继续培养3h。(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算得到重 组蛋白的相对表达量为13. 76%。实施例9 HPV16 L2E7在大肠杆菌中的表达优化(五)(1)将表达HPV16 L2E7蛋白的工程菌株大肠杆菌，在菌种固体培养基上划线培养， 挑取单克隆菌落在3ml菌种培养基中活化培养过夜。(2)用于菌液培养的培养基以M9培养基为基础，初始葡萄糖浓度1 %，初始胰蛋白 胨含量为0. 5%以及初始酵母提取物含量为0. 5%，将活化的种子菌液按体积比5%的接种 比例接种于IOOml培养基中，37°C下培养菌体0D600至1. 0，然后加IPTG浓度至0. ImM进行诱导，在37°C条件下继续培养5h。
(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬 沉淀，沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色。(4)扫描凝胶图像，然后用Quantity one 4. 6. 2图像软件分析图片，计算得到重 组蛋白的相对表达量为14. 11%。实施例10培养基改变前后的效果比较将重组表达菌涂布于含有不含抗生素的固体培养基中，37度培养过夜，从中挑取 100个单克隆菌落，按矩阵接种于含有氨苄青霉素的固体培养基中，37度培养过夜。计算最 终生长的单克隆菌落数。
表达质粒保裤=(最终生长的单克隆菌落数/100)X100%
权利要求
一种16型人乳头瘤病毒L2E7基因在大肠杆菌中的优化表达方法，其特征在于以16型人乳头瘤病毒L2E7为目的基因，通过分子克隆技术构建得到16型人乳头瘤病毒L2E7重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达，从中筛选出具有高表达水平的重组菌株，最后从(1)培养基成分，(2)培养基pH条件，(3)诱导时机，(4)氨苄青霉素浓度，(5)接种量，(6)诱导剂，(7)诱导温度七个方面对该重组工程菌的表达条件进行了比较；通过优化试验，得出一系列优化表达条件(1)含有1％葡萄糖的表达培养基，(2)培养基初始pH值7.0，(3)诱导时机为菌液在600nm波长下的光密度≈1.1，(4)氨苄青霉素浓度为50克/升，(5)接种量为5％，(6)异丙基硫代半乳糖苷浓度为0.25毫摩尔，(7)诱导温度37℃，最终重组蛋白相对表达量为15％左右，包涵体得率接近13％。
2.根据权利要求1所述的优化表达方法，其特征在于通过基因克隆技术把16型人乳头 瘤病毒L2E7基因插入了表达载体，获得了一株高表达16型人乳头瘤病毒L2E7重组蛋白的表 达菌株。
3.根据权利要求1所述的优化表达方法，其特征在于所用到的表达培养基配方为七 水磷酸氢二钠12. 8克，磷酸氢钾3克，氯化钠0. 5克，氯化铵1克，1摩尔硫酸镁2毫升，1摩 尔氯化钙0. 1毫升，胰蛋白胨2. 5-5克，酵母提取物2. 5-5克，葡萄糖5_10克，加水至1000毫升。
4.根据权利要求1所述的优化表达方法，其特征在于16型人乳头瘤病毒L2E7重组蛋 白的高效表达方案步骤如下(1)将表达16型人乳头瘤病毒L2E7重组基因的大肠杆菌菌株，在菌种固体培养基上划 线培养，挑取单克隆菌落在3毫升菌种培养基中活化培养过夜；(2)用于大肠杆菌表达16型人乳头瘤病毒L2E7重组蛋白的培养基以M9培养基为基础， 选择不同的初始葡萄糖浓度0. 4% _6%，初始胰蛋白胨含量0. 5% -1. 0%以及初始酵母提 取物含量0. 5% -1. 0%，将活化种子菌液按体积比5%的接种比例接种于100毫升培养基 中，37°C下培养菌体在600nm波长下的光密度至0. 2-2. 0，然后加异丙基硫代半乳糖苷浓度 至0. 1-2毫摩尔进行诱导，在28-37 °C条件下继续培养3-6小时；(3)取菌液1毫升，12000转/分钟离心1分钟，用100微升凝胶上样缓冲液重悬沉淀， 沸水煮10分钟，进行分离胶浓度为8%的蛋白质凝胶电泳，用考马斯亮蓝染染色；(4)扫描凝胶图像，然后用Quantityone 4. 6. 2软件分析图片，计算蛋白的相对表达量。
5.根据权利要求4所述的优化表达方法，其特征在于所用到的菌种固体培养基配方 为胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，琼脂粉5克，加水至1000毫升，高压灭菌。
6.根据权利要求4所述的优化表达方法，其特征在于所用到的菌种培养基配方为胰 蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，葡萄糖10克，加水至1000毫升，高压灭菌。
全文摘要
本发明公开了一种16型人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)L2E7基因在大肠杆菌原核表达菌株的构建及其表达条件的优化方法，以HPV16L2E7为目的基因，通过分子克隆技术构建得到HPV16L2E7重组表达质粒，并在大肠杆菌中进行表达，从中筛选出具有高表达水平的重组菌株，最后从(1)培养基成分，(2)培养基pH条件，(3)诱导时机，(4)氨苄青霉素浓度，(5)接种量，(6)诱导剂，(7)诱导温度七个方面对该重组工程菌的表达条件进行了比较。该培养基能充分满足工程菌在表达蛋白过程中的营养要求，和传统的表达培养基相比成本下降，并且有效的控制了培养诱导过程中的关键参数。
文档编号C12N1/21GK101845453SQ201010169578
公开日2010年9月29日 申请日期2010年5月11日 优先权日2010年5月11日
发明者任皎, 姜云水, 庄昉成, 李剑波, 毛子安, 田厚文, 赵莉, 高孟 申请人:浙江普康生物技术股份有限公司