专利名称：乳清酸磷酸核糖转移酶启动子及应用和构建体与载体的制作方法
技术领域：
本专利属于基因工程技术领域，具体涉及圆红冬孢酵母启动子、终止子及其用途， 包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。
背景技术：
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。微生物的种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，并与人类日常生产生活关系密切。
做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株，其特定的生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。实际上，对微生物油脂代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工水平，也是提高发酵过程经济性的关键。全基因组测序和基因工程技术的进步，为菌株生理学特性的认识和菌株改良提供了比传统诱变技术更为合理的方法。
代谢工程的实质是利用重组DNA技术和其它技术，有目的地改变已有的代谢和表达调控网络，更好地理解和利用细胞的代谢途径。代谢工程可以在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅可以解释细胞生理生化特性，而且还可赋于出发菌株新的性状和表型(1)扩大底物利用范围；( 生产原来不存在的新化合物；C3)增强对环境中毒害物质的降解能力；(4)提高菌体对环境的适应能力；(5)阻断或降低副产品的生成；(6)代谢产品生产速率和生产性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。
圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生产重要的生物基产品微生物油脂， 胞内油脂可达细胞干重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工业用酶或药物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角军氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明，该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好，能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物质到生物基产品的高效转化 (李永红，刘波，孙艳，等.广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12) 39-44)。
虽然圆红冬孢酵母具有优良的工业生产性能，同时，圆红冬孢酵母来源的蛋白酶异源表达也获得成功(Pollegioni L，Molla G，Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58 (2) : 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圆红冬孢酵母自身缺乏相应的遗传操作系统。以圆红冬孢酵母为宿主菌，无论是基因工程操作还是代谢工程菌株改良，都受到遗传操作系统的制约，难以进行靶向性的菌株改造。
启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，如果要对圆红冬孢酵母进行遗传操作，获得能在圆红冬孢酵母中起作用的启动子是该工作的关键环节。
发明内容
鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可用于在圆红冬孢酵母中有效表达外源基因，并且可用于通过遗传工程技术进行圆红冬孢酵母菌种改良的启动子和终止子。
为实现本发明的目的，本发明人对圆红冬孢酵母中的基因表达情况进行了深入研究，发现ura5为一个组成型表达基因，其启动子为中强启动子。通过实验设计，结合简并 PCR、染色体步移等方法，从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功获得了包含有效启动子的DNA 片段，由此完成了本发明。
具体讲，本发明包含下述实施方案(A)到(H) (A)本发明涉及一种具有圆红冬孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO :1所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3，-末端起800bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起SOObp 以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
(B)本发明涉及一种来自圆红冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征 (1)如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5，-末端的部分序列；(2)或具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)本发明涉及一种可完成靶基因在圆红冬孢酵母中转录起始和转录终止的DNA 分子，它同时具有如㈧所述序列和如⑶所述序列，且如⑶所述序列位于如㈧所述序列的下游，与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。
(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子连接的DNA构建体，以便于靶基因能够在圆红冬孢酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。
(E)本发明涉及一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的载体。所述载体可以是质粒载体或粘粒载体。
(F)本发明涉及转入了如⑶所述的DNA分子或如(E)所述载体的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属(Miodosporidium)真菌。
(G)本发明所涉及的的pRtura5启动子，其特征在于其来源于圆红冬孢酵母，可启动目的基因在圆红冬孢酵母中的转录和表达。
(H)本发明涉及编码具有乳清酸磷酸核糖转移酶(orotat印hosphoribosyl transferase)活性的多肽的DNA片段，其cDNA序列具有如SEQ ID NO 3所示的脱氧核苷酸序列，其基因组DNA具有SEQ ID NO :5所示的脱氧核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
使用本发明中具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和载体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。
图1表示Rtura5简并PCR产物的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图2表示pRtura5启动子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图3表示Rtura5t终止子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图4表示Rtura5启动子-ORF-终止子全长片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图5表示pRtura5启动子启动GFPuv在圆红冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表达结果。
图6表示pRtura5启动子启动博来霉素抗性基因ble在红冬孢酵母ATCC10788的抗生表达结果。
图7表示pRtura5启动子启动遗传霉素抗性基因kanmx4在红冬孢酵母ATCC 10788的抗生表达结果。
图8表示重组圆红冬孢酵母在5’ -FOA上的培养结果。
图9是质粒pura5gfp的结构图。
图10是质粒pura5ble的结构图。
图11是质粒pura5kan的结构图。
图12是圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的晶体结构模型，其表明三维结构正确。
本明的
具体实施例方式在本文中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。
启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法将报告基因(如绿色荧光蛋白)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因表达量。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。
在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过诸如Northern杂交或RT-PCR的方法检查所转录 RNA的大小而确认终止子的存在。或通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。
本发明中的“圆红冬孢酵母”，包括属于该“物种”的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“红冬孢酵母属真菌”，没有具体限制，其例子包括归属于该属的真菌，除圆红冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium bab jevae, I hodosporidiumsphaerocarpum0 本发明的“目的基因”，包括能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列，反义RNA 编码序列和核酸酶编码序列。能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列的例子包括源于圆红冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本发明的目的基因还包括来源于其它微生物、 植物和动物的蛋白编码序列。
本发明中的启动子具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列 3，-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有 50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
本发明中的终止子具有如如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5，-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 2所示序列的全部或其DNA序列5，-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或对SEQ ID NO :2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :2所示序列具有50%以上同源性、且具有终止子活性的序列。
本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化圆红冬孢酵母，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。
本发明的启动子可以按照以下方面从圆红冬孢酵母中分离。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TaKaRa公司完成。
实施例1 圆红冬孢酵母ATCC 10788总RNA的提取 将新鲜圆红冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788 (购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30°C摇床培养Mh，再以1 50的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30°C摇床培养1 达对数生长期。在 4°C下，5000rpm离心％iin，收集菌体，用液氮迅速冷冻菌体，研磨破壁。使用TaKaRa公司 RNAiso试剂盒，并按照其标准步骤提取总RNA。
RNA进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，使用荧光-紫外分析仪观察鉴定，可见清晰的两条带。用紫外/可见光光谱仪分析总RNA样品，测得OD26tZOD28tl = 2. 01，表明总RNA质量很好。总RNA样品冻存于_80°C，备用。
实施例2 圆红冬孢酵母ATCC 10788 cDNA第一链合成和ura5简并PCR 以圆红冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链。首先，将 1. 0 μ 1 总 RNA(约 2 μ g)，1. 0 μ 1 引物 SMART IV 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTGGCCATTACGGCCGGG-3‘和 1.0 μ loligo dT_ 接头引物 CDS III/3' 5' -ATTCTAGAGG CCGAGGCGGCCGACATG-d (T) 30N-iN-3 ‘，2. 0 μ 1 DEPC处理水(焦碳酸二乙酯处理水，购自大连 TaKaRa公司)，加入到PCR管中混勻，于72°C保温2min,立即置于冰上冷却2min,将2. 0 μ 1 5 X first strandbuff er, 1. 0μ 1 DTT (20mM), 1. 0 μ 1 dNTP (IOmM), 1. 0μ 1 powerscript reversetranscriptase(Clontech公司)加入到体系中，混勻。于42°C延伸反应60min，最后4°C结束反应，存于_20°C，备用。
根据NCBI公布的其它物种来源的乳清酸磷酸核糖转移酶氨基酸序列，通过序列比对获得其相对保守区域，并利用此保守区域设计合成两条简并引物，ura5-sense 5 ‘ -ATGAG(AGCT)GC(AGCT)AC(AGCT)TCCTA(AGCT)GC-3 ‘和 ura5_anti 5 ‘ -CTA(AGCT) T (CT) (AG) AC (AG) CC (AGCT) CACT-3 ‘，以反转录合成的 cDNA 第一链为模板，进行 Rtura5 基因的简并 PCR 扩增，10XPCR 缓冲液 5. 0 μ 1，dNTPs (IOmM) 1· 0μ 1，ura5_sense 引物 (50mmol/l) 1. 0μ l，ura5_anti 引物(50mmol/l) 1. 0ul，rTaq 酶(大连 TakaRa) 0· 5 μ 1，合成的 cDNA 第一链模板 1. 0 μ LddH2O 40. 5 μ 1，于 94°C保温 3min，然后于 94°C 30s, 57°C 45s， 72°C lmin，35个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。扩增产物进行(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳，观察到0. Skb左右的条带(图1)，利用DNA回收试剂盒(购自碧云天)，按照供应商建议步骤纯化PCR产物。PCR产物参照TaKaRa公司提供的方法克隆到pMD18_T载体(购自TaKaRa)，转化入E. coli DH5 α感受态细胞，其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，序列结果推测出的氨基酸序列经Blastp分析，证实为乳清酸磷酸核糖转移酶序列，如SEQ ID NO :4序列所示。 乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列如SEQ ID NO 3序列所示。
实施例3 :Rtura5基因基因组DNA序列的扩增 1. R. toruloides ATCC 10788 (购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)的基因组 DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。制备好的基因组DNA，利用Nanodrop 1000测定，测得ODa5tZOD28tl =1.85，表明基因组DNA质量很好。浓度为120ng/l·! 1，共500μ 1，基因组DNA样品冻存于-20°C，备用。
2.根据实施例2中获得的乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列，设计1对基因特异性引物，ura5-0RF-pl :5，-ATGAGCGCCACGTCCTACGC-3，和 ura5_0RF_p2 5，-CTAGTTAACGCCCCACTTTGCG-3，，以圆红冬孢酵母ATCC 10788的基因组DNA为模板，按照常规方法进行PCR扩增，得到约0. Skb的PCR产物(图略)。PCR扩增产物按照实施例2的操作步骤回收、克隆到PMD18-T载体，并进行测序，得到如序列表SEQ ID NO :5所示的DNA 序列。经与实施例2中获得的乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列比对，证实该基因片段为其乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA序列，无内含子。
实施例4 染色体步移获得Rtura5基因5’翼侧序列(启动子) 本实施例利用Genome Walking Kit(购自 TaKaRa)完成。
根据实施例3中得到的ura5基因组DNA序列，设计3条Specific Primer (基因特异性引物)，ura5-SPl :5，-AGCGACGAGGGGGATGCCCTTGT-3，，ura5-SP2 5，-GTTGAAGAAGTAGGGCGAGGAGC-3，和 ura5_SP3 :5，-GAGAGCGGTCTCGATGATCGAG-3，，做为下游引物，按照试剂盒说明书进行以下操作。
1. IstPCR 反应 以实施例3中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。反应体系50 μ 1 =IOXLA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 8· 0 μ 1，LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1, 大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，AP Primer (100 μ mol/1，大连 TakaRa) 1· 0 μ 1，ura5-SPl (10 μ mol/ 1)1.0 μ 1，R. toruloides ATCC 10788 基因组 DNA 模板(120ng/y 1)1.0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR :2个高退火温度(65°C )的高特异性反应和1个低退火温度(44°C )的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下94°C lmin,98°C Imin ； 94 °C 30s, 65 °C lmin，72°C 2min,共 5 个循环；94°C 30s, 25 °C 3min，72°C 2min ；94 °C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,44°C lmin，72°C 2min，共 15 个循环；72°C lOmin，结束反应。
2. 2nd 巢式 PCR 反应 反应体系50μ1 10 X LA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/ 1)8. 0 μ 1, LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1, 大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，IstPCR 反应产物 1.0 μ 1，ura5-SP2 (10 μ mol/1) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 个循环；72°C lOmin，结束反应。
3. 3rd 巢式 PCR 反应 反应体系50μ1 10 X LA PCR buffer II (Mg2+plus) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/ 1)8.0 μ 1，LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1，大连 TakaRa) 1.0 μ 1,2nd 巢式 PCR 反应产物 1.0 μ 1, ura5-SP3 (10 μ mol/1) 1. 0 μ l，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 个循环；72°C lOmin，结束反应。
3rd巢式PCR反应产物经1 % (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自I^akaRa公司)，转化DH5 α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO 1所示的DNA序列，证实为预期的pRtura5基因序列。
1TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTCGGCTCGCGCCCTCTTCTC 61CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTCGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTCGCA 121AGCTCCTCGCTCCGTCGTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGCGCAATCCGCTGCGCGGCGGGT 181ACCTCGCCTCGCTCCCTTTCCGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCCGAGAC 241ACGACCATCGTCTTGGGATTGGCTTGTGGTACGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG 301CAAGCGAGCCGAGGCAGCGATGGTCAGTTCCGGTCGCAGACCGAGGCTCCAGGGAAGGGA 361CGGCGGGACGCACTGATGACGCCGGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTCGGC 421AGCGCACCCTGGCTGAGCCAGTACCGGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC 481CCGACCTTGGCGACGCCCGTGTTGGGCGTGTGCTGCCGTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC 541CTGACCTGACCGTTTGGCGAGACCGACGGCGCTGGCACGACGACCGGTCGCGGGTTGTAC 601GAACCGAGGAGCTCGAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGCGGCGCGCGGATGGCGACGAGC 661GAGTAGACGGGGTTGTTGCGCGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC 721TCGTGCGCTGGCGGAGAGCGAGTGTGCGAGGACGAGGAAAAGGAGCGGGAGGAGGAGGGT 781TGGGAGCGAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA 841TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA 901GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA 961GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACCGTCAG 实施例5 染色体步移获得Rtura5基因3’翼侧序列(终止子) 本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。
根据实施例3中得到的ura5DNA序列，设计3条Specific Primer (基因特异性引物)，分别为 ura5-SPll :5，-CACGACGAGGACGTGATATCGGCT-3，，ura5-SP22 5，-GAGGGCGGTCAGACGGCGGGTATT-3，和 ura5_SP33 :5，-CGTCGTCAAGATGCGCGACATCGTT-3，，做为上游引物，按照试剂盒说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除Specific ft~imer分别由 ura5-SPl，ura5-SP2，ura5-SP3 依次更换为 ura5-SPll，ura5_SP22，ura5_SP33 外，其它同实施例4。
3rd巢式PCR反应产物利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经 TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5 α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序， 得到如SEQ ID NO 2所示的DNA序列，证实为预期的Rtura5t基因序列。
实施例6 :Rtura5启动子-开放阅读框架-终止子全长基因获得 根据实施例4和实施例5中获得的启动子和终止子序列，重新设计一对引物进行 Rtura5 “启动子-开放阅读框架-终止子”全长基因的扩增。pRtura5t-pl :5，-TGCCGCCT ATCTGTTAAAACTCAATG-3，，pRtura5t-p2 :5，-GCCATTCAATCTGTTCAGCCACCC-3，。以实施例 3中制备的R. toruloides基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR体系(50 μ 1) =IOXSpeed buffer 5.0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 1. 0 μ 1，上游引物 Rtura5_pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引 ^ Rtura5-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(扩增速度快，lkb/10s，购自大连TaKaRa公司)0. 5 μ 1，基因组DNA模板(120ng/μ 1) 2 μ 1，ddH20加至50 μ 1。反应条 # 98°C lmin,98°C 10s，65°C 1. Omin，35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。PCR 产物经 (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMDIS-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5 α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa 公司测序，得到如SEQ ID NO :6所示的DNA序列，证实为预期的pRtura5t全长序列，该重组载体命名为T-pRtura5t。
实施例7 圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒ura5gfp的构建 ura5gfp圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒的构建利用的是RF克隆(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning :A restriction-free method forinserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 :67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z,2008. Identification of theorotidine-5 ' -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides. Yeast 25(9) :623-630)的方法。
pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。
1.绿色荧光蛋白编码基因GFPuv的获得 以pGFPuv质粒(购自BD Biosciences)为模板，利用一对引物gfp-pl 5， -ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ‘和 gfp_p2 5' -TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3，，进行 PCR 扩增。体系(50 μ 1) 5XPrimebuffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，上游引物 gfp-pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物 gfp-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，pGFPuv 质粒(120ng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件 95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，；35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。PCR 反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，利用taq DNA聚合酶进行DNA片段3，末端加A， 体系(50μ1) 10 X PCRbuffer 5. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l) 4· 0 μ 1，纯化后的 GFPuv DNA 片段30μ l，ddH20加至50μ 1。反应条件72°C 30min，4°C结束反应。3，末端加A后的GFPuv DNA片段利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，克隆入pMDIS-T载体，送TaKaRa公司测序， 得到如SEQ ID NO :7所示的DNA序列，证实为预期的GFPuv基因序列。
2.参照文献方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura5-gfp-pl 5 ‘ -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgagtaaaggagaagaact-3 ‘ 禾口 ura5_gfp_p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTTGTAT ctatttgtagagctcatccat-3‘(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura50RF翼侧序列互补，小写字母部分序列与绿色荧光蛋白 GFPuv ORF 互补)。
3. RF I反应体系及流程以本实施例操作项1中构建的GFPuvTA克隆载体为模
10板，利用ura5gfp-pl和ura5gfp-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物 (10 μ mol/1) 2· 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，T-GFPuv 质粒 (lOOng/μ 1) 1 μ 1, ddH20 加至 50 μ 1。反应条件:95V 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin, 30个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20°C保存备用。
4. RF II 反应5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，实施例 6 中构建的T-pRtura5t质粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本实施例前述步骤中RFI反应产物(IOOng/ μ 1) 5. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件:95V 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s (_1°C /cyc)，68°C 12min, 15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
5. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5gfp-p 1和ura5gfp-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序， 得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的ura5gfp表达盒，同时，该重组载体命名为pura5gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO :7所示；完整的ura5gfp表达盒如SEQ ID NO 8所示。
实施例8 利用ura5gfp表达盒进行Rtura5基因敲除兼绿色荧光蛋白表达 1. Rtura5gfp敲除盒的制备 以实施例7构建的pUra5gfP载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2为引物，进行Rtura5gfp敲除盒的大量制备。PCR体系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因组DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反应条件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s，；35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。PCR 产物经 (质量 /体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。 纯化后的DNA片段浓度在380ng/l·! 1，共50μ 1，_20°C保存备用。
2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll 感受态细胞的制备R. toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20. Og/Ι，酵母提取物 10.0g/l，蛋白胨 20.0g/l，pH 6. 0)，30°C，200rpm，培养 20h ；培养物 1 50 比例转接新鲜YEPD培养基，100ml (500ml锥形瓶，装液量100ml) ,30 °C, 200rpm,培养6_9h，OD值达到 0. 6-1. 2 ；培养物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 离心 5min，弃上清；0°C无菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura5gfp 敲除盒的电击转化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura5gfp敲除盒5 μ 1 (总共2 μ g)，混勻后冰浴5min，移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4-lOms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育1- ；涂布YEPD平板，10 μ 1/平板，30°C培养观_3乩；逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，阳性重组子ATCC 10788 Δ ura5 gfp的荧光相片如图5所示。
3株重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Aura5: :gfp YEPD培养24h的培养物，利用生理盐水(0.9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10-3、10-4、10_5、10-6四个稀释度，分另Ij 移取10 μ 1菌液于含5’ -FOA (5’ -氟乳清酸，购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0. 2% 5' -F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4 0. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L， MgSO4 ·7Η201. 5g/L，pH 6. 0)平板，待液体吸收完全，于30°C倒置培养2天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5:: gfp具备5，-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC 10788 则无菌落生长。
以上结果说明，Rtura5gfp敲除盒(表达盒)在启动绿色荧光蛋白在圆红冬孢酵母中的整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura5基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例9 圆红冬孢酵母特异性博来霉素抗性表达盒ura5ble的构建 ura5ble圆红冬孢酵母特异性博来霉素表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。
1.参照文献方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Arestriction—free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura5_ble_pl 5 ‘ -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3 ‘和 ura5_ble_p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATctagtcctgctcctcggccacg-3‘(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura50RF翼侧序列互补，小写字母部分与博来霉素抗性基因 ble ORF 互补)。
2. RF I反应体系及流程以PPICZaA质粒(购自hvitrogen公司)为模板，利用 ura5ble-pl 和 ura5ble-p2 为引物，进行 RF 第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1· 0 μ 1，pPICZ α A 质粒(lOOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反应条件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20°C 保存备用。
3. RF II 反应5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，实施例 6 中构建的T-pRtura5t质粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本实施例前述步骤中RFI反应产物(lOOng/ μ 1) 5. 0 μ 1，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
4. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)禾口 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5ble-pl和urMble-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的urMble表达盒，同时，该重组载体命名为pura5ble。ble ORF序列如SEQ ID NO 9所示；完整的ura5ble表达盒如SEQ ID NO 10 所示。
实施例10 利用urMble表达盒进行Rtura5基因敲除兼博来霉素抗性表达 LRtura^3Ie敲除盒的制备 以实施例9构建的purMble载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2为引物，进行Rtura5ble敲除盒的大量制备。PCR体系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因组DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反应条件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s, 35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
PCR产物经(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll感受态细胞的制备同实施例8中的操作项3。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura5ble 敲除盒的电击转化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura5ble敲除盒10 μ 1 (总共3 μ g)，混勻后移入预冷至0°C的电击杯中，电压 0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4_10ms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育 l-2h ；涂布含 20 μ g/ml Zeocin (购自 Invitrogen 公司)的 YEPD 平板，200 μ 1/ 平板，30°C 培养2-10d，约有100个转化子陆续出现。
挑取3个kocin抗性转化子于YEPD培养基中培养Mh，培养物利用生理盐水 (0.9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10_3、10_4、10_5、10_6四个稀释度，分别移取 10 μ 1菌液点样于含5’ -FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0. 2% 5，_F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 ·7Η20 1. 5g/ L，pH 6. 0)平板，待液体吸收完全后，于30°C倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5: :ble具备5，_F0A抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。
以上结果说明，Rtur^ble敲除盒(表达盒)在启动博来霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura5基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例11 圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒ura5kan的构建 ura5kan圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。pRtura5t全长序列扩增和克隆见实施例6。
1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids.
13J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura5_kan_pl 5 ‘ -CACGAGGTCGAAAACACCGTCAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3 ‘ 禾口 ura5_kan-p2 5' -GGAACTGCCCAGACGCACTT GTATttagaaaaactcatcgagcatc-3‘(其中大写字母部分序列与pRtura5t克隆载体中原有的ura50RF翼侧序列互补，小写字母部分序列与遗传霉素抗性基因kanmx40RF互补)。
2. RF I反应体系及流程以pFA6-kanmx4质粒(购自EUROSCARF)为模板，利用 ura5kan-pl 和 ura5kan-p2 为引物，进行 RF 第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. O μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. Ομ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. O μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1· O μ 1，pFA6_kanmx4 质粒(llOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反应条件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20°C 保存备用。
3. RF II 反应5 XPrime buffer 10. O μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，实施例 6 中构建的T-pRtura5t质粒(lOOng/μ 1) 1. O μ 1，本实施例前述步骤中RFI反应产物(IOOng/ μ 1)5. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. O μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
4. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura5t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura5kan-p 1和ura5kan-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序， 得到5’端和3’端分别为ura5启动子和ura5终止子的ura5kan表达盒，同时，该重组载体命名为pura5kan。kanmx ORF序列如SEQID NO :11所示；完整的ura5kan表达盒如SEQ ID NO 12所示。
实施例12 利用ura5kan表达盒进行Rtura5基因敲除兼遗传霉素抗性表达 1. Rtura5kan敲除盒的制备 以实施例11构建的purMkan载体为模板，以实施例6中的寡核苷酸序列 pRtura5t-pl和pRtura5t_p2为引物，进行Rtura5kan敲除盒的大量制备。PCR体系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0μ 1,下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TaKaRa 公司)5.0μ 1，基因组DNA模板(120ng/y 1)15. 0μ 1，ddH20加至500 μ 1。反应条件 980C lmin，98°C 10s，65°C 60s, 35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
PCR产物经1 % (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/yl，共40μ1，-20 保存 2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll感受态细胞的制备同实施例8中的操作项3。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura5kan 敲除盒的电击转化取 100μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura5kan敲除盒10 μ 1 (总共3. 2 μ g)，混勻后冰浴5min，移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4-lOms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育l_2h ；涂布含50μβ/πιΚΜ18(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200 μ 1/平板，30°C 培养2-10d，约有60个转化子陆续出现。
挑取3个G418抗性转化子于YEPD培养基中培养Mh，培养物利用生理盐水(0. 9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10_3、10_4、10_5、10_6四个稀释度，分别移取10 μ 1菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2% 5’-F0A， 葡萄糖 70g/L, (NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 · 7H20 1. 5g/L， PH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30°C倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura5: :kan具备5，_F0A抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。
以上结果说明，Rtur^kan敲除盒(表达盒)在启动遗传霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置的ura5基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例13 :PRtura5启动子和Rtura5t终止子的属内(不同种间)活性测定 也即ura5gfp、ura5ble、ura5kan 等表达盒在 R. babjevae 的功能验证。
在此利用^SrDNA基因做为整合位点，通过融合PCR方法使每个整合表达盒5’末端携带有约500bp的^SrDNA基因同源重组臂，分别进行ura5gfp表达盒、urMble表达盒、 ura5kan表达盒在R. babjevae中的整合性表达。
1.根据 NCBI 公布的 R. babjevae 26SrDNA 序列(NO. :EF595746)，设计一对引物 Rb26S-Rtura5-pl 5，-AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3，和 Rb26S_Rtura5_p2 :5，-gagttttaacag ataggcggcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3，(其中大写字母部分序列与R. babjevae 26SrDNA ψ 列3’端同源，小写字母部分序列与圆红冬孢酵母pura5启动子5’端互补)。
2. Rb26S-Rtura5gfp、Rb26S_Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan 的构建 分别利用实施例5、实施例7和实施例9中的Pura5gfp、Pura^3Ie和Pura^an载体为模板，分别进行 M^6S-Rtura5gfp、M^6S-Rtura5ble、Rb26S-Rtura5kan 等 3 个融合表达盒的构建。PCR体系(各 500 μ 1) 10 X Speedbuffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1， 上游引物(10μπιο1/1)20. 0μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5.0 μ 1，DNA 模板质粒 Rira5gfp 或 Pura5ble 或 Rira5kan (均 120ng/y 1)15.0 μ l,ddH20 加至 500 μ 1。反应条件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 个循环，72°C 10min，4°C 结束反应。
PCR产物经(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的Rl^6S-Rtura5gfp、Rb26S-Rtura5ble和 Rb26S-Rtura5kan 表达盒浓度分别为 3IOng/μ l、300ng/y 1 和 270ng/μ 1，均 45μ 1,-20°C
保存备用。
3. R. babjevae ATCC90942 感受态细胞制备 R. babjevae ATCC90942购自购自美国标准生物品收藏中心。首先，挑菌落接种 10ml YEPD培养基，观°C，200rpm，培养24h ；培养物1 50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml (500ml 锥形瓶，装液量 100ml)，28°C，200rpm,培养 7-10h, OD 值达到 0. 6-1. 2 ；培养物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 离心 5min，弃上清；0°C无菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1 山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。
4. R. babjevae ATCC90942的电击转化和表达结果观察 取3 份 100 μ 1 R. babjevae ATCC90942 感受态细胞，分别加入 Rl^6S-Rtura5gfp、 Rb26S-Rtura5ble和Rl^6S-Rtura5kan表达盒各10 μ 1，混勻后移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4-lOms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C 温育 1- ；Rb26S-Rtura5gfp 转化液涂布 YEPD 平板，10 μ 1/ 平板；Rb26S-Rtura5ble 转化液涂布含20 μ g/mlZeocin (购自hvitrogen公司)的YEPD平板，200 μ 1/平板； Rb26S-Rtura5kan转化液涂布含50 μ g/ml G418 (购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200 μ 1/ 平板；均培养2-10d。
R. babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura5gfp 转化子逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，每40个转化子中可有一个荧光表达的阳性重组子，荧光相片略; Rb26S-Rtura5ble转化液涂布含20 μ g/ml Zeocin的YEPD平板，培养5d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/ μ g表达盒DNA ； Rb26S-Rtura5kan转化液涂布含50 μ g/ml G418的YEPD平板，培养6d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/ μ g表达盒DNA。
各表达盒在R. babjevae ATCC90942的表观转化重组效率，比在R. toruloides ATCC 10788中的高，可能是由于在R. babjevae ATCC90942进行的是单位点同源重组，而在 R. toruloides ATCC10788进行的是双位点同源重组的原因。
以上实施例证明，ura5启动子能够启动绿色荧光蛋白基因、博来霉素抗性基因和遗传霉素抗性基因在R. toruloides ATCC 10788中的整合性表达；ura5gfp表达盒、 ura5ble表达盒、ura5kan表达盒为基础构建的线性DNA敲除盒，能够敲除圆红冬孢酵母基因组上的ura5靶基因。使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和一系列DNA构建体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。并为红冬孢酵母属的其它酵母菌的遗传操作提供了方法和平台。
实施例14 圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的结构表征 参考分子克隆实验指南第三版(萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)经分子排阻、离子交换纯化得到圆红冬孢酵母OPRTase。OPRTase晶体在室温下通过悬滴法获得。采用稀疏矩阵采样法，摸索可获得满足高分辨率结构解析要求的晶体的参数。最终的结晶条件如下=RtFBA蛋白溶液(15mg/ml)和等体积的母液(0. IM Tris-HCl (pH 7. 4),0. 08M 醋酸镁二6% (w/v)聚乙二醇6000)混合，2-3周内出现晶体。用多波长反常散射法(MAD) 确定位相，MAD数据在ADSC Quantum-4R CXD探测器上收集，所有数据用DPS软件包进行统一，用CCP4软件包进行坐标修正与处理。模型用XtalView 4. 0软件在Silicon Graphics OCTANE上构建和校正，用REFMAC程序进行精化。圆红冬孢酵母OPRTase晶体属于空间群 P4&2，晶格常数为a:=60A，b=60 λ, c=135 Α，根据衍射数据得到三维结构模型见图 12。
本发明的有益效果是 为圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子、选择性标记基因表达盒和遗传转化方法，将有力促进今后的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌的菌株改良研究，加快圆红冬孢酵母代谢工程研究。
0157]SEQ ID NO10158]TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGT0GGCTCGCGCCCTCTTCTC600159]CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGT0GTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGT0GCA1200160]AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTG0GCAATC0GCTG0G0GGCGGGT1800161]ACCT0GCCTCGCTCCCTTTC0GCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTC0GAGAC2400162]ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTA0GGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG3000163]CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGT0GCAGAC0GAGGCTCCAGGGAAGGGA3600164]0GGCGGGA0GCACTGATGACGC0GGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGT0GGC4200165]AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTAC0GGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC4800166]CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGG0GTGTGCTGC0GTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC5400167]CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGA0GGCGCTGGCACGA CGACCGGTCG0GGGTTGTAC6000168]GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTG0GG0G0G0GGATGG0GACGAGC6600169]GAGTAGACGGGGTTGTTGCG0GTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC7200170]TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTG0GAGGACGAGGAAAAGGAG0GGGAGGAGGAGGGT7800171]TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA8400172]TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA9000173]GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA9600174]GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACAC0GTCAG10000175]SEQ ID NO 20176]ATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGCGTAGOG TACCCGCACGATTTACTGAC600177]GCAACT0GGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTATCG0GATCTT0GCAGCGACACTCGC0GCT1200178]TC0GATTCCCGACTTTG0GTCCATCT0GCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAG1800179]ACGGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGCATCAGCACTCA0GGGCTCCGCAACAGCTGC2400180]TGTCACGCCTCGAGTTCAGT0GGGCAGCTCT0GCCATCTCGCAACCCGTT ATGG0GATGG3000181]TCGACC0GTCT0G0GGCTTTCCCAGCGCTGCGTTTC0GCTTCAGCTGTCG0GGTACAAAC3600182]TTCATCGCCCCGTAG0GAGC0GTCTCTCGCGCAA0GAGGCAATCT0G0GCTTCTCTCCCT4200183]AA0GCTTTCTATCGGTCCCGGCCTCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGACGTCGA0GCAGTTT4800184]0GATAT0GTCAACAG0GAGCGCAGACGAGCACTGCC0GAGCAGTGAA0GA0GACGAGCTC5400185]TGTA0GAAGCGAT0GGATCCGC0GCCTT0GCTCG0GACATGCT0GAGCTTTCCTGATCAC6000186]CTTGTCTGAG TTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGT0GTG0GCAT0GGAGTTTGCTGAGG0G6600187]OGAGAAGGAT ATTACAGCTCGTACGAAGGACGGCGACTCTGGCTCGCTGTCCGTCACA0G7200188]AGACAGAGGC CAGCCTCGACCT0GTCAG0GAGTCGGTCTGTCCATGA0GGCTMCTMTG7800189]AGGGTGGCTG AACAGATTGAATGGC8050190]SEQ ID N0:3(圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶cDNA序列)0191]ATGAGCGCCA CGTCCTAOGC OGCCTCGATC ATCGAGACOG CTCTCGCGAG 0GAGCAGCCC600192]ATCCTC0GCTT0GGCACCTTCACCCTCAAGTCTGGC0GCTCCT0GCCCTACTTCTTCAAC1200193]TTTGGCCTCTTCAACAC0GGCTCTCTCCTCCTCGCTCT0GCCT0GGCCTT0GCAGA0GCC1800194]ATCCTCGA0GCCTACCC0GAGATTGGCTCCTCCTCCGC0GGTCCCGACACGCCCAAAGTC2400195]CTCTTCGGACC0GCCTACAAGGGCATCCCCCTCGTCGCTGCTATCGCATC0GAACT0GCA3000196]0GACGAGGACGTGATAT0GGCTACAGCTACAACCGCAAGGAGAAGAAGGACCACGG0GAG3600197]GG0GGGTCGATTGTCGGTGCGC0GCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCAT0GT0GACGA0GTG4200198]ATCA0GGC0GGTACTGCGATTCGCGAGG0GCACAAGAT0GT0GAGTCGGAGGGCGGTCAG4800199]ACGG0GGGTATTGTCGAGGCCCTCGACCGGGAGGAG0G0GGACAGGG0GAGCTCAGTA0G5400200]GTCCAGGAAGT0GAGAAGGAGCTCGG0GTCAAGGTCACGAG0GTCGTCAAGATG0G0GAC6000201]AT0GTTGCGTGGCTCAAAGAGAAGGGCAAGCTCGACGAGATGAAGGCCATGGAGGAGTAC6600202]0G0GCAAAGTGGGGCGTTAACTAG684
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0220
SEQ Met Ala Ser Thr Ile Asp Leu Ile Gly Ile His Glu Val Val Leu Val SEQ
ID NO 4SerAlaThrSerTyrAlaAlaSerlielieGluThrAlaLeuSerGluGlnProlieLeuArgPheGlyThrPheThrLeuLysGlyArgSerSerProTyrPhePheAsnPheGlyLeuPheAsnGlySerLeuLeuLeuAlaLeuAlaSerAlaPheAlaAspAlaLeuAspAlaTyrProGlulieGlySerSerSerAlaGlyProThrProLysValLeuPheGlyProAlaTyrLysGlylieProValAlaAlalieAlaSerGluLeuAlaArgArgGlyArgAspGlyTyrSerTyrAsnArgLysGluLysLysAspHisGlyGluGlySerlieValGlyAlaProLeuLysGlyGlnLysValLeuValAspAspVallieThrAlaGlyThrAlalieArgGluAlaLysIleValGluSerGluGlyGlyGlnThrAlaGlylieValAlaLeuAsPArgGluGluArgGlyGlnGlyGluLeuSerThrGlnGluValGluLysGluLeuGlyValLysValThrSerValLysMetArgAsplieValAlaTrpLeuLysGluLysGlyLysAspGluMetLysAlaMetGluGluTyrArgAlaLysTrpGlyAsn
ID NO 5(圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA序列)
0221]ATGAGCGCCA CGTCCTA0GC0GCCTCGATCATCGAGACOGCTCTCGCGAGOGAGCAGCCC600222]ATCCTC0GCTT0GGCACCTTCACCCTCAAGTCTGGCOGCTCCTOGCCCTACTTCTTCAAC1200223]TTTGGCCTCTTCAACAC0GGCTCTCTCCTCCTCGCTCTOGCCTOGGCCTTOGCAGAOGCC1800224]ATCCTCGA0GCCTACCC0GAGATTGGCTCCTCCTCCGCOGGTCCCGACACGCCCAAAGTC2400225]CTCTTCGGACC0GCCTACAAGGGCATCCCCCTCGTCGCTGCTATCGCATCOGAACTOGCA3000226]0GACGAGGACGTGATAT0GGCTACAGCTACAACCGCAAGGAGAAGAAGGACCACGGOGAG3600227]GG0GGGTCGATTGTCGGTGCGCOGCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCATOGTOGACGAOGTG4200228]ATCA0GGC0GGTACTGCGATTCGCGAGGOGCACAAGATOGTOGAGTCGGAGGGCGGTCAG4800229]ACGG0GGGTATTGTCGAGGCCCTCGACCGGGAGGAGOGOGGACAGGGOGAGCTCAGTAOG5400230]GTCCAGGAAGT0GAGAAGGAGCTCGGOGTCAAGGTCACGAGOGTCGTCAAGATGOGOGAC600
18 ATOGTTGCGT GGCTCAAAGAGAAGGGCAAGCTCGACGAGATGAAGGCCATGGAGGAGTAC660 0G0GCAAAGT GGGGCGTTAACTAG684 SEQ ID NO (6 TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGT0GTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTG0GCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCT0GCCTCGCTCCCTTTC0GCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTA0GGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGT0GCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGC0GGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTAC0GGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGG0GTGTGCTGC0GTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGA0GGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTG0GGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCG0GTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTG0GAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAG ATGAG0GCCAOGTCCTACGC1020 0GCCTCGATCATCGAGACCGCTCT0G0GAGCGAGCAGCCCATCCTCCGCTTCGGCACCTT1080 CACCCTCAAGTCTGGCCGCTCCTCGCCCTACTTCTTCAACTTTGGCCTCTTCAACACCGG1140 CTCTCTCCTCCTCGCTCTCGCCTCGGCCTTCGCAGA0GCCATCCTOGACGCCTACCCCGA1200 GATTGGCTCCTCCTC0GCCGGTCC0GACACGCCCAAAGTCCTCTTOGGACCCGCCTACAA1260 GGGCATCCCCCTCGT0GCTGCTAT0GCATCCGAACT0GCACGAOGAGGACGTGATATCGG1320 CTACAGCTACAAC0GCAAGGAGAAGAAGGACCACGG0GAGGGCGGGTOGATTGTOGGTGC1380 GC0GCTCAAGGGACAGAAGGTCCTCATCGTCGACGA0GTGATCACGGCCGGTACTGOGAT1440 TCGCGAGG0GCACAAGATCGTCGAGT0GGAGGGCGGTCAGAOGGCGGGTATTGTOGAGGC1500 CCTCGACCGGGAGGAGCGCGGACAGGGCGAGCTCAGTA0GGTCCAGGAAGTCGAGAAGGA1560 GCTCGG0GTCAAGGTCA0GAGCGT0GTCAAGATG0G0GACATCGTTGOGTGGCTCAAAGA1620 GAAGGGCAAGCTCGA0GAGATGAAGGCCATGGAGGAGTACCGCGCAAAGTGGGGCGTTAA1680 CTAGATACAAGTG0GTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGCGTAGCGTACCCGCAOGATTTAC1740 TGACGCAACTCGGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTAT0G0GATCTTOGCAGOGACACTCGC1800 0GCTTC0GATTCC0GACTTTGCGTCCATCTCGCT0GCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCT1860 ACAGACGGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATG CAGCATCAGCACTCAOGGGCTCOGCAACAG1920 CTGCTGTCACGCCTCGAGTTCAGTOGGGCA GCTCTCGCCATCTOGCAACCOGTTATGGOG1980 ATGGTCGACCCGTCT0G0GGCTTTCCCAGC GCTG0GTTTCCGCTTCAGCTGTOGOGGTAC2040 AAACTTCATCGCCCCGTAGCGAGCOGTCTC T0GCGCAA0GAGGCAATCTCGCGCTTCTCT2100 CCCTAA0GCTTTCTATCGGTCCOGGCCTCT CTCC0G0GGACTCTAAGAGAOGTCGAOGCA2160 GTTT0GATATCGTCAACAGCGAGCGCAGACGAGCACTGCCCGAGCAGTGA ACGAOGACGA2220 GCTCTGTA0GAAG0GAT0GGATCCGC0GCCTTCGCTOGOGACATGCTOGA GCTTTCCTGA2280 TCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGTOGTGCGCATOGG AGTTTGCTGA2340 GG0G0GAGAAGGATATTACAGCTCGTACGAAGGAOGGCGACTCTGGCTCG CTGTCCGTCA2400 CA0GAGACAGAGGCCAGCCT0GACCT0GTCAGCGAGTCGGTCTGTCCATGACGGCTAACT2460 AATGAGGGTGGCTGAACAGATTGAATGGC2489 SEQ ID NO 7 (绿色荧光蛋白编码基因) ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGT60 GATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATAOGGA120 AAACTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATGGCCAACACTT180 GTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCOGTTATCOGGATCATATGAAACGG240 CATGACTTTTTCAAGAGTGC CATGCC0GAAGGTTATGTACAGGAAOGCACTATATCTTTC300 AAAGATGA0GGGAACTACAAGA0G0GTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTT360 AATCGTAT0GAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTOGGACACAAA420 CT0GAGTACAACTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGA480 ATCAAAGCTAACTTCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC540 CATTATCAACAAAATACTCCAATTGGOGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTAC600 CTGT0GACACAATCTGCCCTTTOGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTT660 CTTGAGTTTGTAACTGCTGCTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA717 SEQ ID NO S (绿色荧光蛋白编码基因) TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTOGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGT0GTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGOGCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCT0GCCTCGCTCCCTTTCOGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCAT0GTCTTGGGATTGGCTTGTGGTAOGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAG0GAGCCGAGGCAG0GATGGTCAGTTCCGGTOGCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGCOGGCCTGAATGAGCAGCTTCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AG0GCACCCTGGCTGAGCCAGTACOGGACCCGCTCCAGGTTCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGA0GCC0GTGTTGGGOGTGTGCTGCOGTGGTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGG0GAGACCGAOGGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGAGTAAAGGAGAAGAACT1020 TTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGGTGATGTTAATGGGCACAAATT1080 TTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCAACATAOGGAAAACTTACCCTTAAATTTAT1140 TTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCATG GCCAACACTTGTCACTACTTTCTCTTATGG1200 TGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCA TATGAAACGGCATGACTTTTTCAAGAGTGC1260 CATGCCOGAAGGTTATGTACAGGAACGCAC TATATCTTTCAAAGATGACGGGAACTACAA1320 GAOGOGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGA TACCCTTGTTAATOGTATCGAGTTAAAAGG1380 TATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAACTATAACTC1440 ACACAATGTATACATCAOGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACTTCAAAAT1500 TCGCCACAACATTGAAGATGGATCOGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAATACTCC1560 AATTGGOGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCT1620 TTOGAAAGATCCCAAOGAAAAGOGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTGC1680 TGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAGATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTC1740 CCCTCTTTTGCGTAGOGTACCCGCACGATTTACTGAOGCAACTOGGGOGCTACAGTCCTG1800 TCAATCTATCGOGATCTTCGCAGCGACACTCGCCGCTTCCGATTCCCGAC TTTGOGTCCA1860 TCTCGCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAGAOGGCTCTCAACT CTGCTGGAAG1920 ATGCAGCATCAGCACTCACGGGCTCCGCAACAGCTGCTGTCACGCCTOGA GTTCAGTCGG1980 GCAGCTCTOGCCATCTCGCAACCCGTTATGGOGATGGTOGACCOGTCTCG OGGCTTTCCC2040 AGOGCTGCGTTTCOGCTTCAGCTGTCGCGGTACAAACTTCATCGCCCOGT AGOGAGCCGT2100 CTCTOGOGCAAOGAGGCAATCTOGOGCTTC TCTCCCTAACGCTTTCTATC GGTCCCGGCC2160 TCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGACGTOGACGCAGTTTCGA TATOGTCAAC AGOGAGOGCA2220 GAOGAGCACTGCCOGAGCAGTGAAOGACGACGAGCTCTGTAOGAAGCGATOGGATCOGCC2280 GCCTTCGCTC GOGACATGCTOGAGCTTTCCTGATCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGCTCT2340 GCTAAGTCAG TOGTGOGCATOGGAGTTTGCTGAGGCGCGAGAAGGATATTACAGCTOGTA2400 OGAAGGACGG CGACTCTGGCTCGCTGTCOGTCACACGAGACAGAGGCCAGCCTCGACCTC2460 GTCAGCGAGT CGGTCTGTCCATGAOGGCTAACTAATGAGGGTGGCTGAACAGATTGAATG2520 GC2522 SEQ ID NO :9(博来霉素抗性基因ble) ATGGCCAAGTTGACCAGTGC OGTTCCGGTG CTCACCGCGCGOGACGTOGCOGGAGCGGTC60 GAGTTCTGGACOGACOGGCT OGGGTTCTCCCGGGACTTOGTGGAGGAOGACTTCGCOGGT120 GTGGTCOGGGAOGACGTGAC CCTGTTCATCAGCGOGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGAC180 AACACCCTGGCCTGGGTGTG GGTGOGOGGCCTGGACGAGCTGTACGCOGAGTGGTCGGAG240 GTOGTGTCCACGAACTTCCG GGACGCCTCCGGGCOGGCCATGACCGAGATOGGCGAGCAG300 CCGTGGGGGCGGGAGTTOGC CCTGOGOGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCC360 GAGGAGCAGGACTGA375 SEQ ID NO 10(博来霉素抗性基因ble) TGCCGCCTATCTGTTAAAACTCAATGGATACAATGCAAAGTOGGCTCGCGCCCTCTTCTC60 CCGTTCCCCCGTACCTAGACATGCGTOGTGAGTGCTTCCCTCCGTCATGCAACCGTOGCA120 AGCTCCTCGCTCCGTOGTCGCTGCTGAAGCTGCTCCTGOGCAATCOGCTGOGOGGCGGGT180 ACCTOGCCTCGCTCCCTTTCOGCCGCCCGAATCGCCTGTGTGAGCCTGTTCCTCOGAGAC240 ACGACCATOGTCTTGGGATTGGCTTGTGGTAOGGGCAGAGGGCTGGTCTCTGCAATTGAG300 CAAGOGAGCCGAGGCAGOGATGGTCAGTTCCGGTOGCAGACOGAGGCTCCAGGGAAGGGA360 0GGCGGGA0GCACTGATGACGCOGGCCTGAATGAGCAGCT TCTCAAAGCGCTTTGTOGGC420 AGOGCACCCTGGCTGAGCCAGTACOGGACCCGCTCCAGGT TCCACTCGACCTTCTTCTGC480 CCGACCTTGGCGAOGCCOGTGTTGGGOGTGTGCTGCOGTG GTCCCCACTCCTTCGGGTCC540 CTGACCTGACCGTTTGGOGAGACCGAOGGCGCTGGCACGA CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAACOGAGGAGCTOGAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGGOGGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAGOGAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC1020 OGTTCCGGTGCTCACOGOGCGCGAOGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCT1080 OGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCOGGTGTGGTCCGGGACGAOGTGAC1140 CCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTG1200 GGTGOGOGGCCTGGAOGAGCTGTAOGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCAOGAACTTCOG1260 GGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACOGAGATCGGCGAGCAGCOGTGGGGGCGGGAGTTCGC1320 CCTGOGOGACCOGGCOGGCAACTGOGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAATACA1380 AGTGOGTCTGGGCAGTTCCCCTCTTTTGOGTAGCGTACCCGCAOGATTTACTGAOGCAAC1440 TCGGGCGCTACAGTCCTGTCAATCTATCGCGATCTTOGCAGOGACACTCGCCGCTTCCGA1500 TTCCOGACTTTGCGTCCATCTCGCTCGCTTCGATAAGCTTCTTTGGCTGCTACAGAOGGC1560 TCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGCATCAG CACTCAOGGGCTCOGCAACAGCTGCTGTCA1620 OGCCTCGAGTTCAGTOGGGCAGCTCTOGCCATCTOGCAACCOGTTATGGCGATGGTOGAC1680 CCGTCTOGOGGCTTTCCCAGOGCTGCGTTTCOGCTTCAGCTGTOGOGGTACAAACTTCAT1740 OGCCCCGTAGCGAGCOGTCTCTOGOGCAACGAGGCAATCTCGCGCTTCTCTCCCTAACGC1800 TTTCTATCGGTCCOGGCCTCTCTCCCGCGGACTCTAAGAGAOGTCGAOGCAGTTTCGATA1860 TCGTCAACAGCGAGCGCAGAOGAGCACTGCCOGAGCAGTGAACGAOGACGAGCTCTGTAC1920 GAAGOGATOGGATCCGCOGCCTTCGCTCGCGACATGCTOGAGCTTTCCTGATCACCTTGT1980 CTGAGTTGCTCAGGCTCTGCTAAGTCAGTCGTGCGCATOGGAGTTTGCTGAGGCGCGAGA2040 AGGATATTACAGCTCGTACGAAGGACGGOGACTCTGGCTCGCTGTCCGTCACACGAGACA2100 GAGGCCAGCCTOGACCTOGTCAGCGAGTOGGTCTGTCCATGACGGCTAACTAATGAGGGT2160 GGCTGAACAGATTGAATGGC2180 SEQ ID NO 11(遗传霉素抗性基因kanmx4) ATGGGTAAGGAAAAGACTCAOGTTTCGAGGCOGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGAT60 TTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGA120 TTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCC180 AATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCOG240 ACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGT TACTCACCAC TGOGATCCCC300 GGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT360 GCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTOGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC420 AG0GAT0G0G TATTT0GTCT0GCTCAGG0GCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGAT480 GCGAGTGATT 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CGACCGGTCGOGGGTTGTAC600 GAAC0GAGGAGCT0GAGGGGTTTGGCGGTCTGGCGCTGOGGOGOGOGGATGGOGACGAGC660 GAGTAGACGGGGTTGTTGCGOGTGCAGTGGTGGCGCGCGAGGCGCAATCGGACCGACATC720 TCGTGCGCTGG0GGAGAGCGAGTGTGOGAGGACGAGGAAAAGGAGOGGGAGGAGGAGGGT780 TGGGAG0GAACCACCTCGTGCAGCTGGACTGGACGCGCTAGACGACTGCCAGACTCGCTA840 TACTGCTCTTTACATCCGCTAGAATCCTGCACCCGCTCGAACCAGCTCCTCCCACCGTCA900 GTTCGCCTCCCCCTCTCATCCTCATCTCTCAAAGGACTTCCTCGCTCGCAACTCGCTGGA960 GGGAGCTGCAAGACTGACACGAGGTCGAAAACACOGTCAGATGGGTAAGGAAAAGACTCA1020 0GTTTCGAGGC0G0GATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGC1080 TCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGOGACAATCTATCGA TTGTATGGGAAGCCOGATGC1140 GCCAGAGTTG TTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGAT1200 GGTCAGACTAAACTGGCTGAOGGAATTTATGCCTCTTCOGACCATCAAGCATTTTATCOG1260 TACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGT1320 ATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGOGCTGGCAGTGTTCCTGOG1380 CCGGTTGCATT0GATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCT1440 0GCTCAGG0GCAATCACGAATGAATAACGG TTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGA1500 GCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTC1560 AC0GGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGG1620 GAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGAOGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCT1680 TGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCA TTACAGAAACGGCTTTTTCA1740 AAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAG TTTCATTTGATGCTCGATGA1800 GTTTTTCTAAATACAAGTGCGTCTGGGCAGTTCCCCTCTT TTGOGTAGCGTACCOGCAOG1860
23 ATTTACTGACGCAACTCGGG0GCTACAGTCCTGTCAATCT ATCGCGATCT TCGCAG0GAC1920 ACTCGC0GCTTCCGATTCCCGACTTTGCGTCCATCTOGCT CGCTTOGATA AGCTTCTTTG1980 GCTGCTACAGA0GGCTCTCAACTCTGCTGGAAGATGCAGC ATCAGCACTC ACGGGCTC0G2040 CAACAGCTGCTGTCA0GCCT0GAGTTCAGTCGGGCAGCTC TOGCCATCTC GCAACC0GTT2100 ATGG0GATGGT0GACCCGTCTCGCGGCTTTCCCAGCGCTG CGTTTCCGCT TCAGCTGT0G2160 0GGTACAAACTTCAT0GCCC0GTAGCGAGCCGTCTCTCGC GCAACGAGGC AATCTCGCGC2220 TTCTCTCCCTAACGCTTTCTAT0GGTCC0GGCCTCTCTCC CGCGGACTCT AAGAGA0GTC2280 GA0GCAGTTTCGATATCGTCAACAGCGAGCGCAGACGAGC ACTGCCCGAG CAGTGAACGA2340 0GACGAGCTCTGTACGAAGCGATCGGATCC GCCGCCTTOG CTCGCGACAT GCTCGAGCTT2400 TCCTGATCACCTTGTCTGAGTTGCTCAGGC TCTGCTAAGT CAGTCGTGCG CATCGGAGTT2460 TGCTGAGG0GCGAGAAGGATATTACAGCTC GTACGAAGGA CGGOGACTCT GGCT0GCTGT2520 CCGTCACA0GAGACAGAGGCCAGCCTOGAC CTCGTCAGOG AGTOGGTCTG TCCATGACGG2580 CTMCTMTGAGGGTGGCTGAACAGATTGA ATGGC261权利要求
1.乳清酸磷酸核糖转移酶启动子，简写为pRtura5，其核苷酸序列具有如SEQIDNO=I 所示DNA序列的全部序列或包含该DNA序列自3，-末端起SOObp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起SOObp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ IDNO 1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
2.—种权利要求1所述乳清酸磷酸核糖转移酶启动子的应用，其特征在于SEQ ID NO 1所示的脱氧核苷酸序列可作为启动子用于构建新型酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株，所得到的基因工程菌株携带相应的PRtura5序列。
3.按照权利要求2所述乳清酸磷酸核糖转移酶启动子的应用，其特征在于所述基因工程菌株为红冬孢酵母属(Miodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遗传操作系统为圆红冬孢酵母遗传操作系统。
4.一种DNA构建体，含有权利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列，或同时含有权利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的脱氧核苷酸序列，且SEQ ID NO 1所示序列位于SEQ IDNO 2所示序列的上游，SEQ ID NO 1和 SEQ ID NO :2之间为一编码基因的开放阅读框架。
5.按照权利要求4构建体，其特征在于所述的SEQID NO :2所示序列为一种乳清酸磷酸核糖转移酶终止子Rtura5t。
6.按照权利要求4构建体，其特征在于所述开放阅读框架为位于SEQIDNO :1和SEQ ID NO :2之间的乳清酸磷酸核糖转移酶基因的开放阅读框架，其cDNA序列具有如SEQ ID NO :3所示的脱氧核苷酸序列，其基因组DNA具有SEQID NO :5所示的脱氧核苷酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。
7.一种携带权利要求1启动子PRtFBA或权利要求4构建体的载体。
8.按照权利要求7载体，其特征在于所述载体为质粒载体。
全文摘要
通过扩增圆红冬孢酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可有效表达目的基因于圆红冬孢酵母，并因此能够用于圆红冬孢酵母遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子。本发明还涉及包含这些元件的DNA构建体和载体。
文档编号C12R1/645GK102268432SQ20101018972
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者张素芳, 赵宗保, 林心萍 申请人:中国科学院大连化学物理研究所