乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶启动子及应用和构建体与载体的制作方法

专利名称：乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶启动子及应用和构建体与载体的制作方法
技术领域：
本专利属于基因工程技术领域，具体涉及圆红冬孢酵母启动子、终止子及其用途， 包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。
背景技术：
微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。微生物的种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，并与人类日常生产生活关系密切。
做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株，其特定的生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。实际上，对微生物油脂代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工水平，也是提高发酵过程经济性的关键。全基因组测序和基因工程技术的进步，为菌株生理学特性的认识和菌株改良提供了比传统诱变技术更为合理的方法。
代谢工程的实质是利用重组DNA技术和其它技术，有目的地改变已有的代谢和表达调控网络，更好地理解和利用细胞的代谢途径。代谢工程可以在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅可以解释细胞生理生化特性，而且还可赋于出发菌株新的性状和表型(1)扩大底物利用范围；( 生产原来不存在的新化合物；C3)增强对环境中毒害物质的降解能力；(4)提高菌体对环境的适应能力；(5)阻断或降低副产品的生成；(6)代谢产品生产速率和生产性能的提高等(Bailey J Ε. Toward a science ofmetabolic engineering. Science. 1991,252(5013) :1668-1675 ；Aristidou A,Penttila M. Metabolic engineering applications to renewable resource utilization. Curr. Opin.Biotechnol.2000，11(2) :187-198)。
圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生产重要的生物基产品微生物油脂， 胞内油脂可达细胞干重的60 %以上(Ratledge C, WynnJ P. The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv. Appl. Microbiol. 2002, 51 :1-51 ；Li Y, Zhao Z, Bai F. High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb. Technol. 2007,41 (3) :312-317)；工业用酶或药物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸角军氨酶(Hodgins D S. Yeastphenylalanine ammonia-lyase. Purification, properties, and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine. J Biol.Chem. 1971,246(9) :2977-2985 ；Gilbert H J, Clarke I N, Gibson R K, et al. Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidiumtoruloides in Escherichia coli K-12. JBacteriol. 1985,161 (1) :314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A,PiloneM S. Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis. J Biol. Chem. 1994,269(27) 17809-17814 ；Liao G J, Lee Y J, Lee Y H, et al. Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides. Biotechnol. Appl.Biochem. 1998，27 (Pt 1) :55-61)等；β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明，该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好，能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物质到生物基产品的高效转化 (李永红，刘波，孙艳，等.广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25 (12) 39-44)。
虽然圆红冬孢酵母具有优良的工业生产性能，同时，圆红冬孢酵母来源的蛋白酶异源表达也获得成功(Pollegioni L，Molla G Campaner S，Cloning，sequencing and expression in Ε.coli of a D—amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C. J Biotechnol. 1997，58(2) 115-123 ；Faulkner J D， Anson J G，Tuite M F，et al. High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system. Gene. 1994,143 (1) 13-20)，但圆红冬孢酵母自身缺乏相应的遗传操作系统。以圆红冬孢酵母为宿主菌，无论是基因工程操作还是代谢工程菌株改良，都受到遗传操作系统的制约，难以进行靶向性的菌株改造。
启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，如果要对圆红冬孢酵母进行遗传操作，获得能在圆红冬孢酵母中起作用的启动子是该工作的关键环节。

发明内容
鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可用于在圆红冬孢酵母中有效表达外源基因，并且可通过遗传工程技术进行圆红冬孢酵母菌种改良的启动子和终止子。
为实现本发明的目的，本发明人对圆红冬孢酵母中的基因表达情况进行了深入研究，在对圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脱羧酶及其编码基因Rtura3研究的基础上(中国专利，专利申请号:200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, Tang W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' -monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008,25 (9) :623-630)，利用染色体步移方法，从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功获得了包含有效启动子的DNA片段，由此完成了本发明。
具体讲，本发明包含下述实施方案(A)到(F) (A)本发明涉及一种具有圆红冬孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列自3，-末端起900bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
(B)本发明涉及一种来自圆红冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征 (1)如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5，-末端的部分序列；(2) 或具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。
(C)本发明涉及一种可完成靶基因在圆红冬孢酵母中转录起始和转录终止的DNA 分子，它同时具有如㈧所述序列和如⑶所述序列，且如⑶所述序列位于如㈧所述序列的下游，与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。
(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子连接的DNA构建体，以便于靶基因能够在圆红冬孢酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。
(E)本发明涉及一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的载体。所述载体可以是质粒载体或粘粒载体。
(F)本发明涉及转入了如⑶所述的DNA分子或如(E)所述载体的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属(Miodosporidium)真菌。
使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和载体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。


图1表示pRtura3启动子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图2表示Rtura3t终止子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图3表示Rtura3启动子-ORF-终止子基因全长片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。
图4表示GFPuv在圆红冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表达结果。
图5表示pRtura3启动子启动博来霉素抗性基因ble在红冬孢酵母ATCC10788的抗生表达结果。
图6表示pRtura3启动子启动遗传霉素抗性基因kanmx4在红冬孢酵母ATCC 10788的抗生表达结果。
图7表示重组圆红冬孢酵母在5’ -FOA上的培养结果。
图8是质粒pura3gfp的结构图。
图9是质粒pura3ble的结构图。
图10是质粒pura3kan的结构图。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
具体实施例方式在本文中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。
启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法将报告基因(如绿色荧光蛋白)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因表达量。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。
在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过诸如Northern杂交或RT-PCR的方法检查所转录 RNA的大小而确认终止子的存在。或通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。
本发明中的“圆红冬孢酵母”，包括属于该“物种，，的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“红冬孢酵母属真菌”，没有具体限制，其例子包括归属于该属的真菌，除圆红冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum, Rhodosporidium bab jevae, I hodosporidiumsphaerocarpum0 本发明的“目的基因”，包括能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列，反义RNA 编码序列和核酸酶编码序列。能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列的例子包括源于圆红冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本发明的目的基因还包括来源于其它微生物、 植物和动物的蛋白编码序列。
本发明中的启动子具有如SEQ ID NO 1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列 3，-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有 50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
本发明中的终止子具有如SEQ ID NO 2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列 5，-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 2所示序列的全部或其DNA序列5，-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或对SEQ ID NO :2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO :2所示序列具有 50%以上同源性、且具有终止子活性的序列。
本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化圆红冬孢酵母，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。
本发明的启动子可以按照以下方面从圆红冬孢酵母中分离。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TaKaRa公司完成。
实施例1 圆红冬孢酵母基因组DNA的制备 将新鲜圆红冬孢酵母R. toruloides ATCC 10788 (购自美国标准生物品收藏中心， ATCC)由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30°C摇床培养Mh，再以1 50的体积比例将菌液分别转接到IOOml YEPD液体培养基中，于30°C摇床培养1 达对数生长期。在 4°C下，5000rpm离心％iin，收集菌体。ATCC 10788的基因组DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。制备好的基因组DNA，利用Nanodrop 1000测定，测得0D26(1/0D28(1 = 1. 85，表明基因组DNA质量很好。基因组DNA浓度为120ng/l·! 1，共500μ 1，冻存于-20°C，备用。
实施例2 染色体步移获得Rtura3基因5’翼侧序列(启动子) 本实施例利用Genome Walking Kit(购自 TaKaRa)完成。
根据已报道的圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因(Rtura3) 的基因组DNA序歹Ij (中国专利，专利申请号:200710158415. 1 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z. Identification of theorotidine-5‘ -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides Yeast 2008,25(9) 623-630)，设计 3 条 SpecificPrimer(基因特异性引物)分别为 ura3_SPl :5，-TCCCGGT CAAAGTCCTCGACGATGTC-3，， ura3-SP2 :5’ -CTTGATGCAGCAGCAGTACGGGCC-3，和 ura3_SP3 5，-GGCGTAGGTGCGGGTCGTGATGGAC-3，，做为下游引物，按照 Genomeffalking Kit (购自 TaKaRa)说明书进行以下操作。
1. IstPCR 反应 以实施例1中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。反应体系50 μ 1 =IOXLA PCR buffer II (Mg2+plus，大连 TakaRa) 5· 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/y 1，大连 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1，大连 TakaRa) 1· 0 μ 1， ura3-SPl (10 μ mol/1) 1.0 μ 1，R. toruloides ATCC 10788 基因组 DNA 模板(120ng/ μ 1)1.0 μ LddH2O加至50 μ 1。反应条件先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR :2个高退火温度(65°C)的高特异性反应和1个低退火温度(44°C )的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下:94V lmin，98°C Imin ；94°C 30s, 65°C lmin，72°C 2min，共 5 个循环；94°C 30s, 25°C 3min, 72 "C 2min ；94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 44°C lmin，72°C 2min，共 15 个循环；72°C lOmin，结束反应。
2. 2nd 巢式 PCR 反应 反应体系50 μ 1 10 X LA PCR bufferll (Mg2+plus,大连 TakaRa) 5. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l)8. 0μ 1，TakaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/μ 1，大连 TakaRa) 1.0 μ 1，API Primer (100 μ mol/1,大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，IstPCR 反应产物 1.0 μ 1，ura3-SP2 (10 μ mol/ 1) 1· 0μ 1，ddH20 力口至 50 μ 1。反应条件94 °C 30s, 65 "C lmin，72 "C 2min，94 "C 30s, 65°C lmin, 72°C 2min, 94°C 30s, 44°C lmin, 72°C 2min,共 15 个循环；72°C lOmin,结束反应。
33rd 巢式 PCR 反应 反应体系50yl:10XLA PCR bufferll (Mg2+plus,大连 TakaRa) 5. 0 μ 1， dNTPs (2. 5mmol/l) 8. 0 μ 1，TaKaRa LA Taq DNA 聚合酶(5U/ μ 1，大连 TakaRa) 1. 0 μ 1， API Primer (100 μ mol/1，大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，2nd 巢式 PCR 反应产物 1.0 μ 1， ura3-SP3(10ymol/l)1.0y l，ddH20 加至 50μ 1。反应条件:94V 30s,65°C lmin，72°C 2min， 94°C 30s,65°C lmin，72°C 2min，94°C 30s,44°C lmin，72°C 2min，共 15 个循环；72°C lOmin, 结束反应。
3rd巢式PCR反应产物经1 % (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自I^akaRa公司)，转化DH5 α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑
7选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如 SEQ ID NO 1所示的DNA序列，证实为预期的pRtura3基因序列。 序列号1 (SEQ ID NO 1) 序列长度1529bp 序列类型DNA
来源圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
来源菌株特征分类地位担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达细胞干重的 TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTG TCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500
实施例3 染色体步移获得Rtura3基因3’翼侧序列(终止子) 本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。 已报道的圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶编码基因(Rtura3) 因组DNA序列(中国专禾丨J，专禾U申请号200710158415. 1 ；Yang F, ZhangS, W, Zhao Z. Identification of the orotidine-5' —monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008, 25(9) :623-630)，设计 3 条 Specific Primer(基因特异性引物)分别为 ura3_SPll 5’ -GGAGGGTGGACGAGCGGGAAGAGAC-3’， ura3-SP22 :5’ -GTCATCATGACGC CCGGCGTCGGACT-3’ 和 ura3-SP33 :5，-GCGTACGAGGACAGGCTG AGGCAGT-3，，做为上游引物，按照 GenomeWalking Kit (购自TaKaRa)说明书进行3，翼侧染色体步移操作，除Specif icl^rimer分别由 ura3-SPl，ura3-SP2，ura3-SP3 依次更换为 ura3-SPll，ura3-SP22，ura3_SP33 外，其它同实施例2。
3rd巢式PCR反应产物利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经 TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5 α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序， 得到如SEQ ID NO 2所示的DNA序列，证实为预期的Rt ura3t基因序列。
实施例4 =Rt ura3启动子-ORF-终止子全长序列的获得 以实施例1中制备的R. toruloides基因组DNA为模板，根据实施例2和实施例 3 获得的序列信息，设计一对引物，pRtura3t-pl :5，-TGACCGGAGCAACAAGACGTGGG-3，和 pRtura3t-p2 :5，-AAGCAGGAGGAGGAGAAGCGGAGG-3，，进行 Rtura3 启动子-ORF-终止子全长序列的 PCR扩增。PCR 体系(50 μ 1) 10 X Speed buffer (大连 TakaRa) 5. O μ 1, dNTPs (lOmmol/ 1)1. O μ 1，上游引物(10ymol/l)2. Ομ 1，下游引物(10 μ mol/1) 2. O μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(扩增速度快，ΙΙΛ/lOs，购自大连TaKaRa公司)0. 5 μ 1，基因组DNA模板(120ng/ μ 1)2 μ 1，ddH20;to 至 50μ 1。反应条件98 °C lmin，98°C 10s, 65 °C 1. 0min,30 个循环， 68°C 10min，4°C结束反应。PCR产物经(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用 PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMDIS-T载体(购自 TakaRa公司)，转化DH5ci感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO :3所示的DNA序列，证实为预期的pRtura3t全长序列，该重组载体命名为T-pRtura3t。
实施例5 圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒ura3gfp的构建 ura3gfp圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒的构建利用的是RF克隆(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning :A restriction-free method forinserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67 :67-74 ；Yang F, Zhang S, Tang W, Zhao Z, 2008. Identification of theorotidine-5 ' -monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides. Yeast 25(9) :623-630)的方法。
pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。
1.绿色荧光蛋白编码基因GFPuv的获得 以pGFPuv质粒(购自BD Biosciences)为模板，利用一对引物gfp-pl 5，-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3 ‘和 gfp_p2 :5，-TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3，，进行 PCR 扩增。体系(50 μ 1) :5XPrimebuffer (大连 TakaRa) 10.0 μ 1，dNTPs (大连 TakaRa，2. 5mmol/ 1)4. 0μ 1，上游引物 gfp-pl (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,下游引物 gfp-p2 (10 μ mol/1) 2. 0 μ 1,PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，pGFPuv 质粒 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件95°C 3min，98°C 8s，49°C 15s，72°C lmin，；35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。PCR 反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，利用taq DNA聚合酶进行DNA片段3，末端加 A，体系(50 μ 1) 10 X PCR buffer5. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，纯化后的 GFPuv DNA片段30μ l，ddH20加至50μ 1。反应条件72°C 30min，4°C结束反应。3，末端加A后的 GFPuv DNA片段利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，克隆入pMD18_T载体，送TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO 4所示的DNA序列，证实为预期的GFPuv基因序列。
2.参照文献方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into plasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura3-gfp-pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgagtaaaggagaagaact-3 ‘ 禾口 ura3_gfp_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCGCGCCAT tcatttgtagagctcatccat-3‘(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura30RF翼侧序列互补，小写字母部分序列与绿色荧光蛋白 GFPuv ORF 互补)。
3. RF I反应体系及流程以本实施例操作项1中构建的GFPuvTA克隆载体为模板，利用ura3gfp-pl和ura3gfp-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. 0μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物 (10ymol/l)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，T-GFRiv 质粒(源自实施例 4，100ng/y 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50μ 1。反应条件:95V 3min，98°C 8s,49°C 15s, 72°C lmin，30个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，_20°C保存备用。
4. RF II 反应5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，实施例 4 中构建的T-pRtura3t质粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本实施例前述步骤中RFI反应产物(IOOng/ μ 1)5. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. 0 μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
5. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)禾口 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3gfp-p 1和ura3gfp-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序， 得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的ura3gfp表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO :4所示；完整的ura3gfp表达盒如SEQ ID NO 5所示。
实施例6 利用ura3gfp表达盒进行Rtura3基因敲除兼绿色荧光蛋白表达 1. Rtura3gfp敲除盒的制备 以实施例5构建的PUra3gfp载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2为引物，进行Rtura3gfp敲除盒的大量制备。PCR体系(500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. O μ 1，下游引物(10ymol/l)20. Ομ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶(扩增速度快， lkb/10s，购自大连 TaKaRa 公司)5. O μ 1，基因组 DNA 模板(120ng/μ 1) 15. 0 μ 1，ddH20 加至 500 μ I0 反应条件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
PCR产物经1 % (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在400ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll 感受态细胞的制备R. toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20. Og/Ι，酵母提取物 10.0g/l，蛋白胨 20.0g/l，pH 6. 0)，30°C，200rpm，培养 20h ；培养物 1 50 比例转接新鲜YEPD培养基，100ml (500ml锥形瓶，装液量100ml) ,30 °C, 200rpm,培养6_9h，OD值达到 0. 6-1.2 ；培养物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 离心 5min，弃上清；0°C无菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura3gfp 敲除盒的电击转化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura3gfp敲除盒5 μ 1 (总共2 μ g)，混勻后冰移入预冷至0°C的电击杯中，电击参数电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4-lOms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育1- ；涂布YEPD平板，10 μ 1/平板，30°C培养观_3乩；逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，阳性重组子ATCC 10788Aura3::gfp的荧光相片如图4所示。
3株重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Aura3: :gfp YEPD培养24h的培养物，利用生理盐水(0.9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10-3、10-4、10_5、10-6四个稀释度，分另Ij 移取10 μ 1菌液于含5’ -FOA (5’ -氟乳清酸，购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0. 2% 5' -F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4 0. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L， MgSO4 ·7Η201. 5g/L，pH 6. 0)平板，待液体吸收完全，于30°C倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3::gfp具备5，-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC 10788 则无菌落生长。
以上结果说明，Rtura3gfp敲除盒(表达盒)在启动绿色荧光蛋白在圆红冬孢酵母中的整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura3基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例7 圆红冬孢酵母特异性博来霉素抗性表达盒ura3ble的构建 ura3ble圆红冬孢酵母特异性博来霉素表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。
1.参照文献方法(Van den Ent, F. , Lowe, J. ,2006. RF cloning Arestriction-free method for inserting target genes into ρlasmids. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura3_ble_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3 ‘ 禾口 ura3_ble_p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCATtcagtcctgctcctcggccacg-3 ‘(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura30RF翼侧序列互补，小写字母部分序列与博来霉素抗性基因ble ORF互补)。
2. RF I反应体系及流程以PPICZaA质粒(购自^witrogen公司)为模板，利用 ura3ble-pl 和 ura3ble-p2 为引物，进行 RF 第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5XPrime buffer 10. Ομ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1· 0 μ 1，pPICZ α A 质粒(lOOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反应条件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20°C 保存备用。
3. RF II 反应5 XPrime buffer 10. O μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. O μ 1，实施例 4 中构建的T-pRtura3t质粒(lOOng/μ 1) 1. O μ 1，本实施例前述步骤中RF I反应产物(lOOng/ μ 1)5. Ομ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1. O μ 1，ddH20 加至 50 μ 1。反应条 # 95°C 3min，68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s(_l°C /cyc)，68°C 12min，15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
4. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer混勻后在37°C作用 120min去除原T_pRtura3t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V， 400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3ble-pl和ura3ble-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的urdble表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3ble。ble ORF序列如SEQ ID NO :6所示；完整的ura3ble表达盒如SEQ ID NO 7 所示。
实施例8 利用urdble表达盒进行Rtura3基因敲除兼博来霉素抗性表达 1. RturaiBble敲除盒的制备 以实施例5构建的PurUble载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2为引物，进行Rtura3ble敲除盒的大量制备。PCR体系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因组 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反应条件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35个循环，72°C 10min，4°C结束反应。
PCR产物经(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/yl，共50μ1，-20 保存 2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll感受态细胞的制备同实施例6中的操作项3。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura3ble 敲除盒的电击转化取 100 μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura3ble敲除盒10 μ 1 (总共3 μ g)，混勻后移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4_10ms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育 l-2h ；涂布含 20 μ g/ml Zeocin (购自 Invitrogen 公司)的 YEPD 平板，200 μ 1/ 平板，30°C 培养2-10d，约有100个转化子陆续出现。
挑取4个kocin抗性转化子于YEPD培养基中培养Mh，培养物利用生理盐水 (0.9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10_3、10_4、10_5、10_6四个稀释度，分别移取 10 μ 1菌液点样于含5’ -FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0. 2% 5，_F0A，葡萄糖 70g/L，(NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 ·7Η20 1. 5g/ L，pH 6. 0)平板，待液体吸收完全后，于30°C倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :ble具备5，_F0A抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。
以上结果说明，RturUble敲除盒(表达盒)在启动博来霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura3基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例9 圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒ura3kan的构建 ura3kan圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。
pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。
1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006. RF cloning Are strict ion-free method for inserting target genes into ρlasmi ds. J. Biochem. Biophys. Methods 67:67-74)，设计 RF 克隆引物ura3_kan_pl 5 ‘ -TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3 ‘ 禾口 ura3_kan-p2 5' -GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCAT ttagaaaaactcatcgagcatc-3‘(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura30RF翼侧序列互补，小写字母部分序列与遗传霉素抗性基因kanmx4 ORF互补)。
2. RF I反应体系及流程以pFA6-kanmx4质粒(购自EUR0SCARF)为模板，利用 ura3kan-pl 和 ura3kan-p2 为引物，进行 RF 第一轮扩增。体系(50 μ 1) 5 XPrime buffer 10. 0 μ 1, dNTPs (2. 5mmol/l)4. 0μ 1，上游引物(10 μ mol/1) 2. 0 μ 1，下游引物(lOymol/ 1)2. 0μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(大连 TakaRa) 1· 0 μ 1，pFA6_kanmx4 质粒(llOng/ μ 1) 1 μ 1，ddH20 加至 50 μ I0 反应条件95°C 3min，98°C 8s, 49°C 15s，72°C lmin，30 个循环，72°C 10min，4°C结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20°C 保存备用。
3. RF II 反应5 XPrime buffer 10. 0 μ 1，dNTPs (2. 5mmol/l) 4. 0 μ 1，实施例 4 中构建的T-pRtura3t质粒(lOOng/μ 1) 1. 0 μ 1，本实施例前述步骤中RFI反应产物(IOOng/ μ 1)5. 0 μ 1, PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 1. 0μ l，ddH20 加至 50 μ 1。反应条件:95 V 3min, 68°C 12min，之后 95°C 30s, 65°C 45s (-1 °C /cyc)，68°C 12min，15 个循环，接下来再进行一轮95°C 30s, 55°C 45s, 68°C 12min，20 个循环，72°C lOmin，4°C结束反应。
4. DpnI消化和电击转化取8μ 1 RF II反应产物加入Ιμ DpnI (购自New England Biolabs)和 1 μ 1 DpnI buffer 混勻后在37°C作用 120min去除原T_pl tura;3t质粒后，分别取2μ1电击转化DH5ci感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数2200-2500V，400Q，25yF，0°C。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3kan-p 1和ura3kan-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序， 得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的ura3kan表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3kan。kanmx ORF序列如SEQID NO :8所示；完整的ura3kan表达盒如SEQ ID NO 9所示。
实施例10 利用ura3kan表达盒进行Rtura3基因敲除兼遗传霉素抗性表达 1. Rtura3kan敲除盒的制备 以实施例9构建的PUra3kan载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列 pRtura3t-pl和pRtura3t_p2为引物，进行Rtura3kan敲除盒的大量制备。PCR体系 (500 μ 1) 10 X Speed buffer 50. 0 μ 1，dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1，上游引物(lOymol/ 1)20. 0 μ 1，下游引物(10ymol/l)20. 0μ 1，SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5. 0 μ 1，基因组 DNA 模板(120ng/y 1)15. 0 μ 1, ddH20 加至 500 μ 1。反应条件98°C lmin，98°C 10s,65°C 60s, ；35个循环，72°C 10min，4°C结束反应。
PCR产物经1 % (质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在320ng/yl，共40μ1，-20 保存 2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备 R. toruloides npll感受态细胞的制备同实施例6中的操作项3。
3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定 Rtura3kan 敲除盒的电击转化取 100μ 1 R. toruloides ATCC 10788 感受态细胞，加入Rtura3kan敲除盒10 μ 1 (总共3. 2 μ g)，混勻后移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4_10ms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C温育1-池；涂布含50yg/ml G418(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200 μ 1/平板，30°C培养 2-10d,约有60个转化子陆续出现。
挑取3个G418抗性转化子于YEPD培养基中培养Mh，培养物利用生理盐水(0. 9% NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10_3、10_4、10_5、10_6四个稀释度，分别移取10 μ 1菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2% 5’-F0A， 葡萄糖 70g/L, (NH4)2SO4O. lg/L，酵母粉 0. 75g/L，KH2PO4 0. 4g/L，MgSO4 · 7H20 1. 5g/L， PH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30°C倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788 Δ ura3: :kan具备5，_F0A抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。
以上结果说明，Rtura3kan敲除盒(表达盒)在启动遗传霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置的ura3基因编码的乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。
实施例11 :PRtura3启动子和Rtura3t终止子的属内(不同种间)活性测定 也即ura3gfp、ura3ble、ura3kan 等表达盒在 R. babjevae 的功能验证。
在此利用^SrDNA基因做为整合位点，通过融合PCR方法使每个整合表达盒5’末端携带有约500bp的^SrDNA基因同源重组臂，分别进行ura3gfp表达盒、urdble表达盒、 ura3kan表达盒在R. babjevae中的整合性表达。
1.根据 NCBI 公布的 R. babjevae 26SrDNA 序列(NO. :EF595746)，设计一对引物Rb26S-Rtura3-pl :5’ -AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3，和 Rb26S_Rtura3_p2 :5’ -cccacgtcttg ttgctccggtcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3，(其中大写字母部分序列与R. babjevae 26SrDNA 序列3’端同源，小写字母部分序列与圆红冬孢酵母pura3启动子5’端互补)。
2. Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S_Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 的构建 分别利用实施例5、实施例7和实施例9中的Pura3gfp、Pura3ble和Pura3kan载体为模板，分别进行 M^6S-Rtura3gfb、M^6S-Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan 等 3 个融合表达盒的构建。PCR体系(各 500 μ 1) 10 X Speedbuffer 50. 0 μ 1, dNTPs (10mmol/l) 10. 0 μ 1， 上游引物(10μπιο1/1)20. 0μ 1，下游引物(10 μ mol/1) 20. 0 μ 1, SpeedSTAR HS DNA 聚合酶 5.0 μ 1，DNA 模板质粒 Rira3gfp 或 Pura3ble 或 Rira3kan (均 120ng/y 1)15.0 μ l,ddH20 加至 500 μ 1。反应条件98°C lmin,98°C 10s，65°C 60s，；35 个循环，72°C 10min，4°C 结束反应。
PCR产物经(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的Rl^6S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble和 Rb26S-Rtura3kan 表达盒浓度分别为 300ng/μ l、280ng/y 1 和 ^Ong/μ 1，均 40μ 1,-20 °C
保存备用。
3. R. babjevae ATCC90942 感受态细胞制备 R. babjevae ATCC90942购自购自美国标准生物品收藏中心。首先，挑菌落接种 IOml YEPD培养基，观°C，200rpm，培养24h ；培养物1 50比例转接新鲜YEPD培养基， 100ml (500ml 锥形瓶，装液量 100ml)，28°C，200rpm,培养 7-10h, OD 值达到 0. 6-1. 2 ；培养物冰浴 10-30min，4°C，4000rpm 离心 5min，弃上清；0°C无菌 Milli-Q 水洗 1 次；0°C lmol/1 山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。
4. R. babjevae ATCC90942的电击转化和表达结果观察 取3 份 100 μ 1 R. babjevae ATCC90942 感受态细胞，分别加入 Rl^6S-Rtura3gfp、 Rb26S-Rtura3ble和Rl^6S-Rtura3kan表达盒各10 μ 1，混勻后移入预冷至0°C的电击杯中，电压0. 8-2. 0千伏，电阻200 Ω，电容25 μ F，时间4-lOms ；电击后立即加入Iml YEPD, 30°C 温育 1- ；Rb26S-Rtura3gfp 转化液涂布 YEPD 平板，10 μ 1/ 平板；Rb26S-Rtura3ble 转化液涂布含20 μ g/mlZeocin (购自hvitrogen公司)的YEPD平板，200 μ 1/平板； Rb26S-Rtura3kan转化液涂布含50 μ g/ml G418 (购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200 μ 1/ 平板；均培养2-10d。
R. babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura3gfp 转化子逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，每30个转化子中可有一个荧光表达的阳性重组子，荧光相片略; Rb26S-Rtura3ble转化液涂布含20 μ g/ml Zeocin的YEPD平板，培养5d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均200个/平板，转化重组效率400个重组子/ μ g表达盒DNA ； Rb26S-Rtura3kan转化液涂布含50 μ g/ml G418的YEPD平板，培养6d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/ μ g表达盒DNA。
各表达盒在R. babjevae ATCC90942的表观转化重组效率，比在R. toruloides ATCC10788中的表观转化重组效率高，可能是由于在R. babjevaeATCC90942进行的是单位点同源重组，而在R. toruloides ATCC 10788进行的是双位点同源重组的原因。
以上实施例证明，ura3启动子能够启动绿色荧光蛋白基因、博来霉素抗性基因和遗传霉素抗性基因在R. toruloides ATCC 10788中和R. bab jevaeATCC90942中的整合性表达，具有属内启动子活性；ura3gfp表达盒、ura3ble表达盒、ura3kan表达盒为基础构建的线性DNA敲除盒，能够敲除圆红冬孢酵母基因组上的ura3靶基因。
使用本发明的启动子和终止子，可实现目的基因在圆红冬孢酵母中的表达或特定靶基因的选择性敲除，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和一系列DNA构建体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。并为红冬孢酵母属的其它酵母菌的遗传操作提供了方法和平台。
本发明的有益效果是 为圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子、选择性标记基因表达盒和遗传转化方法，将有力促进今后的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌的菌株改良研究，加快圆红冬孢酵母代谢工程研究。
0158]SEQ ID NO10159]TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC600160]TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC1200161]CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC1800162]TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT2400163]GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG3000164]GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG3600165]ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC4200166]GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC4800167]CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG5400168]CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA6000169]CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM6600170]AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT7200171]CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG7800172]CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT8400173]TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT9000174]CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC9600175]TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG10200176]GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC10800177]GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT11400178]CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC12000179]ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGAACGCGACGAGCTGGGGGTTGTGAACA TCGGGCGGAG12600180]CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT13200181]GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA13800182]AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTAC GGGACTGCTT14400183]TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT15000184]CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG15290185]SEQ ID NO2
16 ATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTGTMGGCTATCTTGACAACMCATGCA60 CMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGG120 ACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCMTGGC180 TGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAMCMGAGMGGGMGGGCGATGGC240 TGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGG300 GCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGMGTAC360 GACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGG420 GCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATC480 GTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACC540 TCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTC600 GATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAG660 CGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTC720 ATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCG780 GCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCG840 MCGMGGMMGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCAC900 CCGCCTCCGCTTCTCCTCCT CCTGCTT927 SEQ ID NO 3 (圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶启动子、圆红冬孢酵母乳清画I核苷-5'-磷酸脱羧酶终止子) TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60 TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120 CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180 TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240 GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300 GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360 ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420 GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480 CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540 CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600 CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660 AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720 CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780 CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840 TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900 CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960 TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020 GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMC MTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGCCGTCCATCACGACCCGCACCTACGCCG1560 MCGGGCTGCCMGCACCCCGTCCCGGTCGCAMGCAGTTGCTCGACATCTGCGACCGCA1620 AAMGACCMCCTCTGCGTTTCAGTCGACGTGACGAGCMGGCGGGCCTGCTCAGGATCG1680 CAGAGGCTGCCGGCCCGTACTGCTGCTGCATCMGGTAGGTTGTACCGGCGCTGMGTAA1740 TCCGAGGACCGCAGCTGACAGACCGAGACACCGACGATAGACCCACATCGACATCGTCGA1800 GGACTTTGACCGGGATCTCGTTCAGCMCTGCAGGCTCTC GCAGACAAGCACGATTTTCT1860 GATTTGGGAGGACCGCMGTTTGCCGACATCGGTGCGTCAATCGAGACTCCCGACTACCT1920 TCCCCGCTGATGGCCCGCGAGACGACAGGCMCACCGTTCGGCTGCAGTACTCGTCCGGT1980 ATCTACAAGATCGCATCCTGGGCGCACATCACCMCGCCCACTTGGTCCCCGGCGAGGGC2040 ATCCTGACGGGCCTCGCATCCGTCGGTCTGCCCCTTGGCCGCGGTCTCCTGCTTCTCGCC2100 GAGATGAGCGCCMGGGCMCCTCGCGACTGGCGAGTACACGGCCMGMTGTCGAGGCG2160 GCGAGGCGGCATCCTGMTTCGTGATGGGCTTCGTTGCGATGCGGAGGGTGGACGAGCGG2220 GAAGAGACGGCTGGCGGTGTTGCGCCGGGAGMGGGGTGCGTCCCATCTCACTCTTTTCC2280 GCTCMCTTCAGCTGACTCCGTGCTCCACCAGGCCGACTACGTCATCATGACGCCCGGCG2340 TCGGACTCGACTCGMGGGCGACGGCATGGGCCAGCAGTACCGTACACCC GACGAGGTCA2400 TCCGCGAGTCCGGCTGCGACGTTATCATCGTCGGTCGGGGTATCTACGGCGGCGGCGACG2460 GCMCCCTMCGMGAGATCGTCMGCAGTGCMGCGGTATCAGGAGGCGGGCTGGMGG2520 CGTACGAGGACAGGCTGAGGCAGTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2580 TAAGGCTATCTTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2640 TCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2700 TGTCGCTCGAACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2760 AAACMGAGAAGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMG2820 MGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2880 CCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACGACG ACTCGACGAT CTCGACGTCGCTGCTGTCGT2940 CGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCAACCTCT3000 GCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT3060 CGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT3120 TCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG3180 AGGGAGGTGAAGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG3240 GGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3300 CGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3360 CATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3420 TCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3473 SEQ ID NO :4(绿色荧光蛋白编码基因) ATGAGTAMG GAGMGMCTTTTCACTGGA GTTGTCCCMTTCTTGTTGA ATTAGATGGT60GATGTTMTG GGCACAMTT AMCTTACCC TTAMTTTAT GTCACTACTT TCTCTTATGG CATGACTTTT TCMGAGTGC AMGATGACG GGMCTACM MTCGTATCG AGTTAAMGG CTCGAGTACA ACTATMCTC ATCAMGCTA ACTTCAAMT CATTATCMC AAMTACTCC CTGTCGACAC MTCTGCCCT CTTGAGTTTG TMCTGCTGC SEQ ID NO :5(绿色荧光蛋白编码基因) TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA GCCCACTGGC GTCTACGAGA ACTGGCTTGT GGMCGCCGT CACGCTGTGC CATCCGTCGC CATTTGCTGT AGACGAGCGA CGMCCACTC CMGACCGTC TCGCCGTCCA CCCACCTTGC TGTGGGAGAC GCGCAGACAT GTCGCTCGCT CACGCAGCCA ATTCCTGGCC CGGGGGTGCT GAGCTCCTGG AGAGMGGTT TCCGAGTCTA CTCCTCCTCC TTGTCCCMT
TTCTGTCAGTGGAGAGGGTGMGGTGATGCMCATACGGA120TTGCACTACTGGAAMCTACCTGTTCCATGGCCMCACTT180TGTTCMTGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAMCGG240CATGCCCGMGGTTATGTACAGGMCGCACTATATCTTTC300GACGCGTGCTGMGTCMGTTTGMGGTGATACCCTTGTT360TATTGATTTTAMGMGATGGAMCATTCTCGGACACAM420ACACMTGTATACATCACGGCAGACAMCAAMGMTGGA480TCGCCACMCATTGMGATGGATCCGTTCAACTAGCAGAC540MTTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACMCCATTAC600TTCGAMGATCCCMCGAMAGCGTGACCACATGGTCCTT660TGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAMTM717
MCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60AGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120TCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180CCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240CCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360CGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420AGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480AGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540AGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660GACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900TCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960GGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020CGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080GCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGAAGCGACT1140CCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC1200GTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGG GTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260CGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320CATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTAC TGATGMGTC GAGGAGAGGA1380GTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT1440TCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGC GCCACCCCAT1500TCCCGCTCCATCCGTCGAGATGAGTAMGG AGMGMCTTTTCACTGGAG1560TCTTGTTGMTTAGATGGTGATGTTMTGG GCACAMTTTTCTGTCAGTG1620
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19GAGAGGGTGA GAAMCTACC TTTCCCGTTA GTTATGTACA MGTCMGTT MGMGATGG ACATCACGGC TTGMGATGG GCCCTGTCCT CCMCGAAM ATGGCATGGA TAAGGCTATC TCACGGACCG TGTCGCTCGA AAACMGAGA MGAGACGTT CCTTAGCCGA CGTCATTCCG GCTCTTCTCG CGTCATCGCT TCTTCGTTGG AGGGAGGTGA GGMGGAGGT CGATGCCGCG CATCGTCTGT TCGTACCGCT SEQ ID NO； ATGGCCMGT GAGTTCTGGA GTGGTCCGGG MCACCCTGG GTCGTGTCCA CCGTGGGGGC GAGGAGCAGG SEQ ID NO； TGACCGGAGC TTGCACAMT CGCTTTCGAC TCCATATACA
AGGTGATGCAACATACGGMMCTTACCCTTAMTTTATTTGCACTACTG1680TGTTCCATGGCCMCACTTGTCACTACTTTCTCTTATGGTGTTCMTGCT1740TCCGGATCATATGAMCGGCATGACTTTTTCMGAGTGCCATGCCCGMG1800GGMCGCACTATATCTTTCAMGATGACGGGMCTACMGACGCGTGCTG1860TGMGGTGATACCCTTGTTAATCGTATCGAGTTAAMGGTATTGATTTTA1920AMCATTCTCGGACACAMCTCGAGTACMCTATMCTCACACAATGTAT1980AGACAAACMMGMTGGMTCAMGCTMCTTCAAMTT CGCCACMCA2040ATCCGTTCMCTAGCAGACCATTATCMCAAMTACTCCA ATTGGCGATG2100TTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGCCCTTTCGAMGATC2160GCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTMCTGCTGCTGGGATTACAC2220TGAGCTCTACAMTGAATGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGMCGAGTG2280TTGACAACMCATGCACMTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCT2340CTTCGGACCTGTCTGGACGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACT2400ACTCTTCGCCAATGGCTGTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGG2460AGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGAAG2520CGACAGGCTGTTGTGGGCGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCG2580CGACGACGCGAAGTACGACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGT2640CGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATT CTCCATCTCCCTCAACCTCT2700CACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCT2760GTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCT2820CGAGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAG2880AGGCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGCGCTTGMCTGGCGCGMG2940GGAGGGGTTGTCGGTCATAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGA3000CTTCGCTCGCAGCTCGGCMCTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCA3060TAGCTCGACTAGTGCGMCGMGGAAMGACCGGGCCACGCACGTCGGCT3120TGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCCTCCTCCTGCTT3173:6(博来霉素抗性基因ble)TGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTC60CCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGT120ACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGAC180CCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAG240CGMCTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAG300GGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCC360ACTGA375:7(博来霉素抗性基因ble)
MCMGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC60
AGCAGACCTG CGMCGMCT CTTCGTCAGC TCGMGCTTG AMGACTCGC120
TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC180
CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGMCCC AGATCGCGCA GAGCMGTGT240
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340GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMG GCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GTCTACGAGAGATMTAGTC AGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360ACTGGCTTGTCGGGCGAGAC GGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420GGMCGCCGTAGCMTCTGC GAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTC GTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660AGACGAGCGAGACGGTCAGC AGGTCGCGAG MGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGA GCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGT ACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTCGACTTTTGAGACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTGCTCCTGCAGCATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTG TACGCATCCC1200ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCA TCGGGCGGAG1260CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGA GACGAGCCGT1320GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTC GAGGAGAGGA1380AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGGCCMGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGC1560TCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCC1620GGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCA1680GCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCC1740TGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGMCTTCCGGGACGCCTCCG1800GGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACC1860CGGCCGGCMCTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGAATGGCGCGGCGCTCTC1920TAGACTTTCGAACGAGTGTAAGGCTATCTTGACMCMCATGCACMTCCGGTCGAGTCT1980ACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGT CTGGACGACGTGGCTTGATG2040CGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCMTGGCTGTTTCTTCGGTGGCG2100CGGCTGCCGTCTTGGCGGMACMGAGMGGGMGGGCGATGGCTGCTTCGCGCTGAGTT2160GAGCTGAGGAGGCGGAAGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGGCGGAG AGCGGTCGTG2220TGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGMGTACGACGACTCGACGATCT2280CGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGGCGGGCACCTCATTCT2340CCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCGTTTCCTCATCCGCAT2400ACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCTCGCACTCGTCCATCA2460GCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCG AGGCGAGCAGCTTCGATTTGTTGTTGACCT2520TGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMG GCGATCTGTACGAGCGCGAGGAGGCCGTGC2580
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37GCTTGMCTG GCGCGAAGGGAAGGAGGTGGAGGGGTTGTC GGTCATAGGG GATTCTTCGG2640CGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAG CTCGGCMCTTTCTTCTTCA2700GGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAG TGCGMCGM GGAAMGACC2760GGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACCCGCCTCCGCTTCTCC2820TCCTCCTGCTT2831SEQ ID NO 8 (遗传霉素抗性基因kanmX4)ATGGGTMGGAAMGACTCACGTTTCGAGGCCGCGATTMATTCCMCATGGATGCTGAT60TTATATGGGTATAMTGGGCTCGCGATMTGTCGGGCMTCAGGTGCGACMTCTATCGA120TTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAMCATGGCAMGGTAGCGTTGCC180MTGATGTTA CAGATGAGATGGTCAGACTAMCTGGCTGACGGMTTTATGCCTCTTCCG240ACCATCMGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCC300GGCAAMCAGCATTCCAGGTATTAGMGMTATCCTGATTCAGGTGAAMTATTGTTGAT360GCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTMTTGTCCTTTTMC420AGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCMTCACGMTGMTMCGGTTTGGTTGAT480GCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTMTGGCTGGCCTGTTGMCMGTCTGGAMGAMTG540CATMGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGAT600MCCTTATTTTTGACGAGGGGAMTTMTAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGMTC660GCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGMCTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCA720TTACAGAMCGGCTTTTTCAAAMTATGGTATTGATMTCCTGATATGMTAMTTGCAG780TTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTM810SEQ ID NO 9 (遗传霉素抗性基因kanmX4)TGACCGGAGCMCMGACGTGGGCGAGTATACGCACTGGATGCAGGCGCCGACGCGTTTC60TTGCACAMTAGCAGACCTGCGMCGMCTCTTCGTCAGCTCGMGCTTGAMGACTCGC120CGCTTTCGACTCACCAGCTTCCATCGACTCTTGGGGATGTTCTCGAGACCGTCGACCGGC180TCCATATACACCGTGTTGCTGACGCCTGTTTCGGGMCCCAGATCGCGCAGAGCMGTGT240GCCCACTGGCCCGTTGTCGTTTGTTTGMGGCGCCGTACGAGTTGGGGCAMGCACGCAG300GTCTACGAGAGATMTAGTCAGGTTTTGAGCGTAGCAMGGCCCCGGACGGAMCGCACG360ACTGGCTTGTCGGGCGAGACGGTGCATTTGCGGCAGAGCCACTGTCCTTCCGGGATGTAC420GGMCGCCGTAGCMTCTGCGAGGMGCGACAMGATGAGCATCAGATCCTCGTCGTGAC480CACGCTGTGCAGCCATGCMCGTGAGMCTCGCGACGCACCTTGGTGGACCGCCMGTTG540CATCCGTCGCAGMGACGATCGCATTCGAGTTCTCGCACTCGCCGTCGTCGCAMTGGCA600CATTTGCTGTCTTCGCTCGGCMGGCATTCGTCCGCTTCGGGATATTGCGAGTCTGCGM660AGACGAGCGAGACGGTCAGCAGGTCGCGAGMGTTGAGGGAGGGCGAGMCGGACCAGGT720CGMCCACTCCTTCTCMTCTTGTCCATGACMTCTCAMGAGCTCGTACGGGATGGTGG780CMGACCGTCCTTCTTCCGCTCCGCGTTGAGCGTGTCGAGCCAGAGTTGGTCTGTGGGTT840TCGCCGTCCATACAGGCTGTCAGCTGTCGTACAMTCGTCMGCCTGCCTGAGAGMCCT900CCCACCTTGCTCGTCCATGTCATACTCMCCTGCTTCGCCAGGTCCGACTCCATAGGTTC960TGTGGGAGACGGAGGGAGGGTGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG1020GCGCAGACATCGMGAGCGATCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGTCCGTCCGGGC1080
CN 102268431 A
说明书20/21页
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22 GTCGCTCGCTGCTCCAGAGACGCGACAMCMTCCCCACTTGACGAGGATCGMGCGACT1140 CACGCAGCCACCGCAGGTACCGCCCCGGCTCGCCATCCGCTATGCCCTTGTACGCATCCC1200 ATTCCTGGCCGTCATTGTACCCGMCGCGACGAGCTGGGGGTTGTGMCATCGGGCGGAG1260 CGGGGGTGCTCGTGTCGACGACGCGAMGTTGACGACTGGGAGTGCGAGAGACGAGCCGT1320 GAGCTCCTGGCATCCCGTTGGCAGTGTGTGAGCGTTCTACTGATGMGTCGAGGAGAGGA1380 AGAGMGGTTGTCGCTGGACTGCTCGCTCCTACTGTCCCTGTGAGGCTACGGGACTGCTT1440 TCCGAGTCTATCAGAGCTACCTGMGCCCTTAGTACCGCTCGACTTGCGCGCCACCCCAT1500 CTCCTCCTCCTCCCGCTCCATCCGTCGAGATGGGTMGGAAMGACTCACGTTTCGAGGC1560 CGCGATTAMTTCCMCATGGATGCTGATTTATATGGGTATAMTGGGCTCGCGATMTG1620 TCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGMGCCCGATGCGCCAGAGTTGT1680 TTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAA1740 ACTGGCTGACGGMTTTATGCCTCTTCCGACCATCMGCATTTTATCCGTACTCCTGATG1800 ATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGCAAAACAGCATTCCAGGTATTAGMGMT1860 ATCCTGATTCAGGTGAAMTATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATT1920 CGATTCCTGTTTGTMTTGTCCTTTTMCAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGC1980 MTCACGMTGMTMCGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCT2040 GGCCTGTTGAACMGTCTGGAMGAAATGCATMGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAG2100 TCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAMTTMTAG2160 GTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTAT2220 GGMCTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAMCGGCTTTTTCAAAMTATGGTA2280 TTGATMTCCTGATATGMTAMTTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAAA2340 TGGCGCGGCGCTCTCTAGACTTTCGAACGAGTGTAAGGCTATCTTGACMCMCATGCAC2400 MTCCGGTCGAGTCTACMCGTCTATCGCCTCTTCACGGACCGCTTCGGACCTGTCTGGA2460 CGACGTGGCTTGATGCGMGCTGGGTAGCCACTTGTCGCTCGMCTCTTCGCCAATGGCT2520 GTTTCTTCGGTGGCGCGGCTGCCGTCTTGGCGGAAACMGAGMGGGMGGGCGATGGCT2580 GCTTCGCGCTGAGTTGAGCTGAGGAGGCGGMGMGAGACGTTCGACAGGCTGTTGTGGG2640 CGGAGAGCGGTCGTGTGGGCGCCTCCTGCTTCGCCTTAGCCGACGACGACGCGAAGTACG2700 ACGACTCGACGATCTCGACGTCGCTGCTGTCGTCGTCATTCCGCGCCTTTGCTGGTCGGG2760 CGGGCACCTCATTCTCCATCTCCCTCMCCTCTGCTCTTCTCGCACCGCAGCTCGCATCG2820 TTTCCTCATCCGCATACTCCAGCTCATCATCCTCGTCATCGCTGTACTCGCGCGAGACCT2880 CGCACTCGTCCATCAGCGTGCGCTCGTGCCGCTTCTTCGTTGGCGAGGCGAGCAGCTTCG2940 ATTTGTTGTTGACCTTGMGGACGGGCCGTCAGAGGGAGGTGMGGCGATCTGTACGAGC3000 GCGAGGAGGCCGTGCGCTTGAACTGGCGCGMGGGMGGAGGTGGAGGGGTTGTCGGTCA3060 TAGGGGATTCTTCGGCGTCACTGTCCGTCGCGACGATGCCGCGCTTCGCTCGCAGCTCGG3120 CAACTTTCTTCTTCAGGCGCGCGAGCTGTGGCACATCGTCTGTTAGCTCGACTAGTGCGA3180 ACGMGGAMAGACCGGGCCACGCACGTCGGCTTCGTACCGCTTGTTGGCTCCCTCCACC3240 CGCCTCCGCTTCTCCTCCTC CTGCTT326权利要求
1.乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶启动子，简写为pRtUra3，其核苷酸序列具有如SEQID NO 1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列自3，-末端起900bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO 1所示序列的全部或其DNA序列3，-末端起900bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加所获得的，与SEQ ID NO :1所示序列具有50%以上同源性、且具有启动子活性的序列。
2.—种权利要求1所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶启动子的应用，其特征在于SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列可作为启动子用于构建新型酵母遗传操作系统及新的重组工程菌株，所得到的基因工程菌株携带相应的PRtura3序列。
3.按照权利要求2所述乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶启动子的应用，其特征在于所述基因工程菌株为红冬孢酵母属(Miodosporidium)基因工程菌株，所述新型酵母遗传操作系统为圆红冬孢酵母遗传操作系统。
4.一种DNA构建体，含有权利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列，或同时含有权利要求1所述SEQ ID NO :1所示的脱氧核苷酸序列和如SEQ ID NO :2所示的脱氧核苷酸序列，且SEQ ID NO :1所示序列位于SEQ ID NO :2所示序列的上游，SEQ ID NO 1 和SEQ ID NO 2之间为一编码基因的开放阅读框架。
5.按照权利要求4构建体，其特征在于所述的SEQID NO :2所示序列为一种乳清酸核苷-5 ‘-磷酸脱羧酶终止子Rtura3t。
6.一种携带权利要求1启动子PRtFBA或权利要求4构建体的载体。
7.按照权利要求6载体，其特征在于所述载体为质粒载体。
全文摘要
通过扩增圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可有效表达目的基因于圆红冬孢酵母，并因此能够用于圆红冬孢酵母遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子。本发明还涉及包含这些元件的DNA构建体和载体。
文档编号C12R1/645GK102268431SQ20101018972
公开日2011年12月7日 申请日期2010年6月2日 优先权日2010年6月2日
发明者赵宗保, 杨帆, 张素芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所