专利名称：染色体的无痕迹修饰方法
技术领域：
本发明涉及采用基因重组手段对染色体上一个或多个靶基因进行插入、敲除或置 换的方法，尤其是一种不会给原染色体留下任何筛选标记或者外源DNA序列的无痕迹修饰 方法，属于染色体基因组改造技术领域。
背景技术：
染色体基因组改造技术，例如基因干扰、外源基因插入、基因突变等技术，对于生 物能源、代谢工程和农业工程领域非常重要。Red/ET重组工程(Recombineering)是近年来 建立的一种新型遗传工程技术，它是通过噬菌体产生的重组蛋白(EX0、Beta、Gam)介导的 高效率的体内同源重组反应，对目的DNA序列进行基因插入、敲除、替换等操作，不需要选 择合适的限制性内切位点。真核细胞和一些细菌的基因重组工程中的瓶颈之一是存在高频率的非同源重组 和低效率的同源重组，因而需要大量筛选以便分离出所需的突变基因，这种方法在缓慢生 长的细菌如mycobacteria中不起作用，因为同源重组与非同源重组相比频率要低得多。为了避免大容量地筛选重组基因，一般需要在转运盒中包含筛选标记以利于确认 靶点基因区的敲入或敲除。然而，插入的筛选标记会影响基因组的进一步改造。为了防止 基因组改造后的染色体带有残余筛选标记(例如抗生素抗性基因)或者外源DNA序列 (例如FRT或IoxP位点)，目前常用的方法是利用Flp重组酶靶点(FRP)或Cre重组酶靶 点(IoxP)介导的位点特异性，从而达到准确剪切筛选标记的目的。然而，以上方法有各自 的特点和缺陷。其一，在筛选标记剪切后仍然存在至少一个FRT位点或IoxP位点，即所谓 的残留痕迹；其二，即使在重组酶不存在的情况下，含有多个残留痕迹的染色体由于痕迹点 之间的重组现象，容易导致染色体基因组的随意重排或敲除。因此，迫切需要一种能够改造 靶基因或基因组序而没有留下筛选标记或外源DNA序列等残留痕迹的方法。对此，目前常用的一种方法是在递换盒中建立一个反筛选标记，这样，那些丧失了 外源序列的反筛选克隆由于会产生显性致死效应而被确认。例如，在str印tomycetes，glkA 基因可作为反筛选标记基因。含有葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖的培养基能导致菌株内的 传递盒丢失，这对glkA+菌株具有致死作用。与此相似，在Saccharomyces cerevisiae可以 使用ura 3基因进行阳性和阴性筛选。在尿嘧啶缺乏的培养基中筛选野生型，在包含5-氟 乳清酸(5-F0A)培养基中筛选营养缺陷型，因为5-F0A是尿嘧啶前体的类似物并且可以转 化为氟尿嘧啶(酵母的一种强抑制剂)，野生型在5-氟乳清酸培养基不能生长。上述方法存在明显的缺陷，它们牵涉到两次交换过程，在最后的重组步骤中没有 阳性筛选，而且局限于glkA或者pyrF无效突变菌株中起作用。另外，每一个敲除步骤需重 复的质粒转化和敲除，耗时而且劳动强度大。因此，需要一种新的基因组整合(或敲除)方 法，要求所有的步骤具有选择性能，尤其是在最终的重组过程中；而且，宿主基因组的唯一 改变是插入或敲除理想基因，不会留下任何筛选标记或残留痕迹)。
发明内容
本发明的目的就是为了解决现有技术中存在的上述问题，提供一种染色体的无痕 迹修饰方法。本发明的技术解决方案是染色体的无痕迹修饰方法，首先，构建包含阳性筛选标 记、反筛选标记、内切核酸酶I-Scel、诱导性启动子、I-SceI识别位点、与靶染色体核酸序 列同源的靶核酸置换序列的重组盒；然后，用电转化的方法把上述DNA片段输入包含重组 质粒的宿主；接着，通过I-SceI介导的双链断裂修复现象从所希望的重组体中敲除以下基 因序列阳性筛选标记、可诱导启动子、I-Scel基因、反筛选标记；最后，在蔗糖培养基上筛 选最终重组体。所述重组盒转化的是Escherichia coli。进一步地，上述的染色体的无痕迹修饰方法，对靶染色体的修饰包括一次或多次 地“插入一个或多个核苷酸到靶细胞基因组”或“从靶细胞基因组中敲除一个或多个核苷 酸”或“置换靶细胞基因组中一个或者多个核苷酸”，所述靶细胞基因组系指内源基因、内源 基因间的核酸序列或非基因核酸序列。更进一步地，上述的染色体的无痕迹修饰方法，按以下步骤修饰微生物特定染色 体区1)准备一个线性DNA片段，包含与λ-red重组有关的可以导入靶向微生物的同源 臂B和C，阳性筛选标记，反筛选标记，I-SceI基因，I-SceI识别位点，与同源重组敲除筛选 标记有关的可诱导启动子、同源片段A ；2)导入线性DNA片段到含有权利要求1所述重组盒的微生物，通过λ -Red重组置 换位于DNA片段同源臂和与同源臂同源的染色体之间的特定位点；3)在诱导I-SceI内切核酸酶表达的条件培养基中，培养特定染色体位点置换的 微生物，导致双链断裂，位于同源片段A和与片段A同源的染色体区之间的同源重组用于 敲除筛选性标记，其中同源臂B与染色体的敲除靶点一端的50-500bp同源，同源臂C与另 一端的50-500bp同源，同源片段A是连接与同源臂B和同源臂C同源的染色体区的一端 300-500bp的区域。其中，所述筛选标记包括阳性筛选标记和阴性筛选标记，阳性筛选标记是从包含可视的 检测标记中筛选的，允许重组体在缺乏营养源的培养基中生长，赋予重组体对某种化合物 产生抗性，阴性筛选标记是一种在底物存在下对细胞有致死作用的标记；所述筛选底物包括基本培养基，缺乏对一个或者多个靶细胞或抗生素必需的一种 或多种营养源；且，所述步骤1)和步骤2)可以重复多次，准备多个不同的线性DNA片段，以修饰微生 物的一系列特定染色体区。本发明采用无痕迹基因重组手段对染色体上一个或多个靶基因进行修饰，包括一 次或多次地“插入”、“敲除”或“置换”，修饰之后不会留下任何筛选标记(例如抗生素抗性 基因)或外源DNA序列(例如FRT或IoxP位点)，是无痕修饰宿主细胞DNA序列的有效方法。根据本发明，首先在靶细胞中转化一个可诱导表达的重组系统，然而将含有阳性 筛选标记和反筛选标记的外源DNA引入靶细胞。在靶细胞中引发一系列过程如诱导重组系 统；筛选呈阳性重组靶细胞；诱导及表达特异内切核酸酶(例如I-Scel)和一个反筛选标记(例如sacB)。然后，通过在靶细胞中引发一个断裂双链(DSB)现象，剔除在DNA靶序列 中的阳性和反筛选标记，最后，通过接种到蔗糖培养基，筛选所期待的重组菌株。靶基因的修饰可以分三个步骤。第一步，通过PCR构建一个包含以下因素的线 性DNA序列盒阳性筛选标记(CM)、诱导性启动子(Pi)、I-Scel基因(SceI)、反筛选标记 (SacB)、I-Scel识别位点(I)、用以修饰的基因和三个同源臂(分别用A、B和C表示)。第二 步，用电转化的方法把上述DNA片段输入包含重组质粒的宿主。因为重组质粒(例如pKD46) 含有编码λ噬菌体Red重组所需基因，所以通过Red酶介导的同源重组现象由上述DNA片 段来置换靶基因，并在含氯霉素培养基上筛选出被置换的细胞。第三步，通过I-SceI介导 的双链断裂修复现象从所希望的重组体中敲除以下基因序列阳性筛选标记(CM)、可诱导 启动子(Pi)、I-Scel基因(SceI)、反筛选标记(SacB)，最后在蔗糖培养基上筛选最终重组 体。此流程可重复进行，以便构建含多个修饰点的突变菌株。当完成了所有修饰后，宿主内 剩余的Red质粒(例如pKD46)可以在37°C下合适的培养基中从生长的突变体中清除。
图1是本发明对染色体进行无痕迹修饰的步骤示意图。其中，步骤(A)，通过PCR组装包含以下因素的线性DNA序列盒阳性筛选标记(CM)、可 诱导启动子(Pi)、I_SceI基因(Seel)、反筛选标记(SacB)、I-SceI识别位点(I)、替换基因 片段、三个同源臂(用A、B和C代表)。PCR引物使用下划线、斜体字母(P-fl，P-rl，P-f2 和P-r2)和箭头标记；步骤(B)，E. coli染色体上的基因组靶点被上述线性DNA序列盒所置换，并在含氯 霉素的LB培养基上筛选重组体；步骤(C)，通过I-SceI介导的双链断裂修复现象从所希望的重组体中敲除以下基 因序列阳性筛选标记(CM)、可诱导启动子(Pi)、I_Scel基因(SceI)、反筛选标记(SacB)， 最后在蔗糖培养基上筛选最终重组体。
具体实施例方式本发明通过应用阳性筛选和反筛选标记对宿主染色体进行无缝修饰。首先，用含 有阳性抗性标记的DNA片段置换靶基因，在筛选性培养基检测重组体，然后通过I-SceI诱 导的双链断裂和反筛选标记基因sacB筛选不含任何筛选标记或者外源DNA序列的最终重 组体。本发明根据靶细胞体内的DNA重组和选择机理，减少了一些不必要的步骤如质粒 转化及重复筛选。本发明使用了反筛选性标记基因，例如Bacillus subtilis的sacB基因，使大量 细菌对蔗糖产生敏感性。SacB基因编码果聚糖蔗糖酶，催化蔗糖水解或聚合形成致死性产 物果聚糖。E. coli和众多革兰氏阴性菌当sacB基因表达时无法生长，因此可以通过同源重 组直接筛选丢失sacB基因的细胞。本发明使用了内含子编码的归巢内切核酸酶I-Scel，可以将一个断裂双链(DSB) 转化到基因组。断裂双链是微生物重组系统的底物，可以通过同源重组修复与断裂末端两 翼同源的序列区。在宿主断裂双链介导的修复系统帮助下，无标记修饰可以整合到革兰氏
5阴性菌的基因组，例如 Escherichia coli 禾口 Salmonella typhimurium。本发明提供了含有诱导性重组系统的靶细胞。第一个外源的核酸序列，包含阳性 筛选标记、反筛选标记、特异内切核酸酶(I-SceI)、可诱导启动子、I-SceI识别位点和与靶 染色体核酸序列同源的靶核酸置换序列，导入到靶细胞，表达可诱导的重组系统，筛选阳性 重组靶细胞，表达特异内切核酸酶(例如I-SceI)和反筛选标记(例如sacB)。通过断裂双 链机制敲除阳性和反筛选标记，在含蔗糖培养基上筛选丢失sacB基因的突变体。本发明采用了可见的检测标记，如荧光活性细胞筛选(FACS)或微流体技术可以 进行阳性和阴性筛选或扫描。检测标记包括各种酶、辅基、荧光标记、发光标记、生物发光标 记等。荧光蛋白包括(但不局限于)黄色荧光蛋白(YFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、青色荧光蛋 白(CFP)等。生物荧光标记包括(但不局限于)荧光酶、荧光素、水母素等。可视检测信号 的酶系统包括但不局限于半乳糖苷酶、糖皮质激素酶、磷酸酶、过氧化物酶、胆碱酯酶等。本发明中，阳性筛选标记是可以赋予细胞抵抗某种化合物的基因，在此基因不存 在情况下，化合物对细胞有杀伤作用。例如，表达抗生素抗性基因的细胞在抗生素存在下可 以存活，而缺乏这基因的细胞将不能存活。例如氯霉素抗性基因能够在氯霉素存在下进行 阳性筛选。抗生素抗性基因包括(但不局限于)氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、杀 稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、四环素抗性基因等。 本发明中，反筛选标记是在特定底物存在下对靶细胞具有致死作用的基因。例如， sacB基因在蔗糖存在下具有致死作用。因此在含蔗糖培养基上生长的细胞并不表达SacB 基因。反筛选标记包括但不局限于glkA、pyrF、thyA、sacB、mazF、rpsL等。本发明中，特异内切核酸酶是通过内含子编码的基因，在同源染色体的准确位置 诱导双链断裂。特异内切核酸酶包括但不局限于=I-Sce I、I-Ceu I、P I-Psp I、P I-Sce I、I-Ppo I 等。本发明中，诱导性启动子是一个通过添加诱导物进行靶序列的有条件表达的DNA 元件。微生物中诱导性启动子有但不局限于rha、tet、lac、ara、Gall、CUPl、CTRl/3、MET25寸。本发明中，靶细胞可以是任何真核或原核细胞。例如，靶细胞可以是细菌细胞如 E. coli、昆虫细胞如Drosophila melanogaster细胞、植物细胞、酵母细胞、两栖动物细胞如 Xenopus Iaevis细胞、线虫类细胞如Caenorhabditis elegans细胞、哺乳细胞如中国仓鼠 卵巢细胞(CHO)、非洲绿猴肾细胞(COS)、人胎儿细胞(293T)或其它人细胞。培养的和移植 的细胞在本发明中都可以使用。本发明可以连续改变靶细胞中的一个或多个靶核酸序列(例如内源基因)，包括 添加一个或多个核苷酸到靶细胞，从靶细胞中敲除靶核苷酸，改变靶细胞中一个或多个内 源基因、基因间核苷酸序列、非基因人工DNA。为了证明本发明中方法的可行性，以下结合说明书附图以Yersinia pestis菌株 KIM6+的relA基因来置换Escherichia coli K-12菌株(MG1655)中位于A和C同源区之 间的靶基因组为例，对本发明技术方案作进一步说明。其中，置换片段(relA基因)可由 PCR扩增产生，并使用正向(P-fl)和反向(P-rl)引物。如图1所示，本发明通过重组PCR构建了筛选盒(CM-PrhaB-SCeI-SaCB-I)，其中 包含五个DNA区阳性筛选标记(CM)、诱导性启动子(Ρ-Β)、I-SceI基因、阴性筛选标记(sacB)和 I-SceI 识别位点(I)。首先，通过常规PCR从pDESTIO质粒中扩增氯霉素抗性基因(CM)片段、从pREDl 质粒中扩增含和一个I-SceI基因的片段、从质粒pSC中扩增含sacB基因和I-SceI识 别位点(I)的片段。然后，纯化这些扩增的基因片段，通过重组PCR反应将上述基因片段进行装配，得 到所需的筛选盒(CM-PAaB-SceI-sacB-I)。位于靶点区左侧的0. 5kb同源片段可通过常规 PCR从E. coli K-12菌株MG1655染色体上扩增得到。这个0. 5kb同源片段的一包含一个 20bp的侧翼序列，0. 5kb片段的3，端与待置换的DNA片段的5，端重叠，0. 5kb片段的5，端 与上述的筛选盒的3’端重叠。最后，采用正向引物(P_f 2)和反相弓I物(P_r2)由重组PCR组装成包含3个PCR 片段(同源片段、筛选盒和置换片段)的置换盒。电感受态细胞的准备。含Red质粒pKD46的E. coli MG1655宿主细胞30°C下 在添加氨苄青霉素的LB培养基中生长，通过离心收获处于对数生长期的细胞，用10%冷 冻甘油洗涤三次。用电转化将上述DNA置换盒转入到电感受态E. coli MG1655宿主细胞 中，通过E. coli体内重组过程来置换染色体上的靶点区。转导到上述基因组中的筛选盒 (CM-PrhaB-Scel-sacB-l)通过L-鼠李糖诱导的I-SceI内切核酸酶表达介导的双链断裂修 复从构建的重组E. coli菌株中剪切掉。然后使用含L-鼠李糖和5%蔗糖的新鲜LB液体培 养基筛选无标记置换的突变体。综上所述，本发明提供了一种对染色体进行无痕迹修饰的方法。需要注意的是，该 方法适用于各种基因改造，以上描述中的相关条件均为非限制性条件。凡在本发明的启示 下，仅作相关条件的等同替换或等效变换所形成的技术方案，均在本发明要求保护的范围 之内。
权利要求
染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于首先，构建包含阳性筛选标记、反筛选标记、内切核酸酶I SceI、诱导性启动子、I SceI识别位点、与靶染色体核酸序列同源的靶核酸置换序列的重组盒；然后，用电转化的方法把上述DNA片段输入包含重组质粒的宿主；接着，通过I SceI介导的双链断裂修复现象从所希望的重组体中敲除以下基因序列阳性筛选标记、可诱导启动子、I Scel基因、反筛选标记；最后，在蔗糖培养基上筛选最终重组体。
2.根据权利要求1所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述重组盒转化的 是 Escherichia coli0
3.根据权利要求1所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于按以下步骤修饰微 生物特定染色体区，1)准备一个线性DNA片段，包含与λ-red重组有关的可以导入靶向微生物的同源臂B 和C，阳性筛选标记，反筛选标记，I-SceI基因，I-SceI识别位点，与同源重组敲除筛选标记 有关的可诱导启动子、同源片段A ；2)导入线性DNA片段到含有权利要求1所述重组盒的微生物，通过λ-Red重组置换位 于DNA片段同源臂和与同源臂同源的染色体之间的特定位点；3)在诱导I-SceI内切核酸酶表达的条件培养基中，培养特定染色体位点置换的微生 物，导致双链断裂，位于同源片段A和与片段A同源的染色体区之间的同源重组用于敲除筛 选性标记，其中同源臂B与染色体的敲除靶点一端的50-500bp同源，同源臂C与另一端的 50-500bp同源，同源片段A是连接与同源臂B和同源臂C同源的染色体区的一端300-500bp 的区域。
4.根据权利要求3所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述步骤1)和步骤 2)重复多次，准备多个不同的线性DNA片段，以修饰微生物的一系列特定染色体区。
5.根据权利要求3所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述筛选标记包括 阳性筛选标记和阴性筛选标记。
6.根据权利要求5所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述阳性筛选标记 是从包含可视的检测标记中筛选的，允许重组体在缺乏营养源的培养基中生长，赋予重组 体对某种化合物产生抗性。
7.根据权利要求5所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述阴性筛选标记 是一种在底物存在下对细胞有致死作用的标记。
8.根据权利要求3所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述筛选底物包括 基本培养基，缺乏对一个或者多个靶细胞或抗生素必需的一种或多种营养源。
9.根据权利要求1所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于对靶染色体的修饰 包括一次或多次地“插入一个或多个核苷酸到靶细胞基因组”或“从靶细胞基因组中敲除一 个或多个核苷酸”或“置换靶细胞基因组中一个或者多个核苷酸”。
10.根据权利要求9所述的染色体的无痕迹修饰方法，其特征在于所述靶细胞基因组 系指内源基因、内源基因间的核酸序列或非基因核酸序列。
全文摘要
本发明提供一种对染色体的无痕迹修饰方法。首先，构建包含阳性筛选标记、反筛选标记、内切核酸酶I-SceI、诱导性启动子、I-SceI识别位点、与靶染色体核酸序列同源的靶核酸置换序列的重组盒；然后，用电转化的方法把上述DNA片段输入包含重组质粒的宿主；接着，通过I-SceI介导的双链断裂修复现象从所希望的重组体中敲除以下基因序列阳性筛选标记、可诱导启动子、I-Scel基因、反筛选标记，最后在蔗糖培养基上筛选最终重组体。该方法可以对染色体靶基因进行插入、敲除或置换，不会留下任何筛选标记或外源DNA序列，是无痕修饰宿主细胞DNA序列的有效方法。
文档编号C12N15/09GK101892221SQ20101021328
公开日2010年11月24日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者王德明 申请人:苏州神洲基因有限公司