专利名称：去氢甲睾酮单克隆抗体、制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学免疫学检测领域，涉及去氢甲睾酮单克隆抗体，以及去氢甲睾酮 完全抗原的合成、单克隆抗体的制备方法，本发明还公开了该种单克隆抗体的应用。
背景技术：
去氢甲睾酮(l-Dehydro-17a-methyltestosterone，DMT,CAS :72-63_9)，是一种 人工合成的蛋白同化雄性类固醇激素，在医学上可用于治疗再生障碍性贫血、男性发育迟 缓、男性更年期、骨折及烧伤处理、氮负平衡等。由于其具有蛋白同化作用，经常被非法用于 畜牧生产、提高运动员成绩及添加到营养补充剂中。目前DMT的检测方法多为仪器检测方法，如GC-MS、LC_MS等，但样品前处理过程复 杂，分析速度慢，仪器昂贵，尤其不适合大量样品的筛查与检测。基于抗原-抗体之间的专一特异性建立的免疫学检测方法，具有简单、快速、特异 性强、价格低廉和处理量大等特点，可弥补仪器分析的不足，近年来在国内外都有广泛的研 究和应用。DMT的分子质量为300. 44，属于半抗原，必须连接到大分子载体物质(如蛋白 质)上形成完全抗原后才能诱导动物产生免疫应答反应。但目前尚未见制备DMT完全抗原 和单克隆抗体并利用其进行快速检测的报道。
发明内容
本发明提供一种用于去氢甲睾酮检测的单克隆抗体。利用该单克隆抗体具有亲和 力高、特异性强的特点，可用于建立高灵敏度的DMT快速检测方法。本发明另一个目的是提供DMT完全抗原的合成及其单克隆抗体制备的方法。本发明的去氢甲睾酮单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC No. 3807的小鼠单克隆抗 体杂交瘤细胞株UJS-1D6F10B4所分泌。上述小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株UJS-1D6F10B4已于2010年5月11日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No. 3807。该小鼠单克隆 抗体杂交瘤细胞株UJS-1D6F10B4也属于本发明的保护范围。本发明所述的DMT完全抗原的合成及单克隆抗体的制备方法基本步骤为(1)肟 化通过DMT与羧甲基羟胺反应，引入具有反应活性的氨基基团，并进行检测确认；(2)完 全抗原制备通过活化酯法，将具有氨基的去氢甲睾酮肟偶联到钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡 卵清蛋白(OVA)载体上，并进行检测确认；(3)动物免疫将制备的具有免疫活性免疫原 DMT-KLH免疫Balb/C小鼠，并采用间接ELISA检测其效价；⑷细胞融合采用聚乙二醇 (PEG)法将经免疫的Balb/C小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合；(5)杂交 瘤细胞筛选利用建立起的间接ELISA方法检测融合细胞上清，筛选出阳性的杂交瘤细胞； (6)杂交瘤细胞亚克隆采用有限稀释法将阳性孔的细胞进行亚克隆，以得到纯化的杂交 瘤细胞株；(7)杂交瘤细胞株的亚型鉴定采用小鼠单克隆抗体免疫胶体金亚型试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定。(8)单抗的制备及IC5tl值、交叉反应率和亲和力的测定采用 ELISA方法对得到的单克隆抗体进行IC5tl、亲和力和特异性进行测定。本发明去氢甲睾酮单克隆抗体的应用，可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。本发明的优点(1)本发明获得的DMT单抗杂交瘤细胞株可稳定地分泌特异性单 克隆抗体；(2)获得的单抗与DMT具有较高的亲和力(亲和常数为5. 53 X 109L/mol)和较高 的灵敏度(IC50值为7.57yg/L) ； (3)单抗对DMT具有显著的专一性，与类似物丙酸睾酮酯 (TP)、群勃龙(TB)的交叉反应率低于1%。因此，本发明可用于去氢甲睾酮的快速检测。
图1. DMT肟化前后的薄层层析分析；图2. DMT肟化前后的红外光谱；图3. DMT免疫抗原(DMT-KLH)的紫外吸收图谱；图4. DMT包被抗原(DMT-OVA)的紫外吸收图谱；图5. DMT单克隆抗体亚型鉴定结果。
具体实施例方式本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内 容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。本发明是通过在不同的蛋白载体上偶联一定数目的DMT分子，制备能免疫动物的 完全抗原DMT-KLH和用于ELISA的包被抗原DMT-BSA ；再利用完全抗原DMT-KLH免疫Balb/ C小鼠，经过细胞融合并利用间接ELISA筛选，并经过亚克隆纯化培养，得到了稳定分泌DMT 单克隆抗体、高亲和力、高特异性的杂交瘤细胞株。实施例1制备DMT完全抗原(I)DMT 的B亏化称取IOOmg DMT溶于4mL吡啶，加入65mg羧甲基羟胺半盐酸(MSDS)，置于烘箱 40°C反应2h ；真空旋转蒸发去除吡啶，残余物用50ml乙酸乙酯溶解，加适量水洗3 4次； 取上层油样物，加入适量无水硫酸钠干燥；真空旋转蒸发去除乙酸乙酯，乙醚重结晶，得到 DMT的肟化物，命名为DMT-CMA。(2)完全抗原的合成采用活化酯法A液取上述DMT-CMA7mg、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 3mg、1_乙 基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC.Hcl)3. 5mg，加入到500ul 二甲基甲酰胺 (DMF)中，溶解后室温避光震荡Ih ;B液称取载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)和鸡卵清蛋白 (OVA)各20mg,分别溶于4. 5ml含30% DMF的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液中，4°C预冷。将A 液预冷后逐滴缓慢加入到B液中，并不断震荡，控制滴入速度使A液在IOmin左右加完，加 完后继续震荡30min，然后4°C继续反应4h ；反应结束后将反应液装入透析袋，6小时换一次 透析液，三天后冷冻干燥保存。(3)动物免疫选择健康的6 8周龄的Ballb/C小鼠进行免疫。第一次免疫使用弗氏完全佐剂 乳化，以后采用不完全佐剂乳化。每只小鼠每次的免疫剂量为50 μ g，采用皮下多点注射。四免7天后采血测效价，选择效价高的小鼠进行细胞融合。四免15天后加强免疫，不使用 免疫佐剂，剂量仍为50 μ g，腹腔注射。(4)细胞融合小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)的准备复苏冻存的SP2/0细胞，置入37°C、5% CO2培养箱中培养。细胞状态稳定后，用含 有15 μ g/mL 8-A的完全培养基培养15 20h后换液。融合前一周细胞保持对数生长。饲 养细胞的准备四免17天后制备饲养细胞，取一只6 10周龄BALB/c小鼠，眼眶取血，断颈处死 小鼠，浸泡于75%酒精中消毒5 15min。在无菌条件下，用无菌眼科剪刀剪开皮肤，暴露 腹膜。用无菌眼科剪刀将腹膜间开一小口，用玻璃滴管加入约5mL无血清1640培养液，轻 轻吹吸数次再将腹腔内液体吸出，并重复一次。IOOOrpm离心lOmin，弃上清，用选择性培养 液(HAT)悬浮，细胞计数，调整细胞密度至2 X IO5个/mL。将饲养细胞移入4块96孔培养 板中，每孔100 μ L，置于37°C、5% CO2培养箱中培养，待用。免疫小鼠脾脏细胞的制备四免18天后将加强免疫的小鼠眼球放血并分离血清，断颈处死后浸泡于75%酒 精中消毒5 15min，在无菌条件下取出脾脏，去除脾脏周围的脂肪和其它组织，用无血清 1640培养液冲洗后，将脾脏置于平皿上的200目不锈钢筛网上，用注射器内芯研磨挤压过 筛，用无血清1640培养液冲洗；将脾细胞溶液转至50mL离心管，IOOOrpm离心5min，弃去上 清，并重复一次。用少量不完全培养液悬浮，加入台盼兰染液后进行细胞计数。细胞融合将已计数的SP2/0细胞与脾细胞按1 4 10的比例混合于50mL塑料离心管 内，用不完全培养液补充至45mL，混勻后1200rpm离心lOmin，弃去上清，轻轻震荡离心管。 在预先调至37°C的水浴中按以下程序进行融合在Imin内缓慢加入PEG 4000溶液lmL，静 置Imin ；在2min内缓慢加入ImL RPMI 1640不完全培养液并轻轻摇动；3min内缓慢加入 30mLRPMI 1640不完全培养液。IOOOrpm离心lOmin，弃上清，用35mL HAT选择性培养基悬 浮，轻轻吹勻，然后按150 μ L/孔加到含有饲养细胞的96孔培养板中，放入37°C、5% CO2培 养箱中培养；在融合后的第4天和第8天进行HAT选择性培养基换液；从第12天开始培养 液更换为HT培养基。(5)杂交瘤细胞筛选在杂交瘤细胞生长到占孔底1/4左右时吸取上清，使用建立好的间接ELISA进行 阳性筛选。间接ELISA的基本参数为包被抗原浓度1 μ g/mL ；包被条件37°C Ih ；封闭液为 2%617，封闭条件为371311;—抗作用条件为371211;二抗浓度为1 5000，二抗作用条 件为370C 2h ；显色时间15min。(6)杂交瘤细胞亚克隆亚克隆的前一天制备饲养细胞(同细胞融合中的饲养细胞准备)。将阳性孔中的 细胞吹散成悬液，进行细胞计数，用HT (培养基添加剂)稀释到5 40个细胞/mL ；将细胞 悬液分别加入已培养有饲养细胞的96孔培养板的小孔中，每孔0. ImL,使每孔相应分别为 0. 5 4个细胞；将细胞培养板放在5% C02，37°C饱和湿度的培养箱中培养，4 5天后观 察各孔中细胞的生长情况，并将记录每孔细胞中生长情况(克隆数量和大小)，换培养液频率视细胞生长的速率而定，一般约3天更换一次。培养7 10天，根据克隆生长快慢，分批 抽取培养上清液进行检测；当细胞生长至孔底的1/4时，开始测定培养液中的相应特异性 抗体活性，选择抗体效价高、呈单个克隆生长、形态良好的细胞孔，继续按上法再进行克隆 和扩大培养；经过三次亚克隆及反复冻存与复苏后，最终获得一株稳定分泌DMT特异性单 克隆抗体的杂交瘤细胞株；将所得细胞株进行冻存。(7)杂交瘤细胞株的亚型鉴定使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒(Envirologix公司)对获得的单克隆抗体杂交瘤 细胞株培养液上清进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgGl型，轻链类型为κ型。(8)单抗的制备及IC5tl值、交叉反应率和亲和力的测定单抗的制备取8-10周龄Balb/C小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油0. 5mL ； 10天后每只小鼠腹腔 接种5 X IO5个杂交瘤细胞；10天分阶段收集腹水，将收集腹水通过辛酸_硫酸铵法纯化后， 获得的单抗置于_20°C保存。IC50值、交叉反应率和亲和力的测定采用间接竞争酶联免疫法测定单抗对DMT、丙酸睾酮酯(testosterone propionate, TP)、群勃龙(trenbolone，TB)的IC5tl值包被封闭后，先加入50 μ L不同 浓度(0ng/mL,0. 01ng/mL,0. 05ng/mL,0. 25ng/mL,1. 25ng/mL,6. 25ng/mL,31. 25ng/mL, 156. 25ng/mL, 781. 25ng/mL) DMT、TP或TB标准溶液，每个浓度2个平行，再加入50 μ L最佳 稀释倍数的一抗。交叉反应率=(IC5ciDMiyiC5tl竞争物)X 100%。结果见表1。表1单抗IC5tl和交叉反应率 通过运用origin软件对数据进行Iogict 4参数拟合，制备的单抗最低检测限 (IC15值)分别为0. 30 μ g/L，说明所得到的抗体具有较高的检测灵敏度，可用于DMT的免疫 分析。抗体的亲和力为亲和力的测定DMT单抗的亲和常数=抗体相对分子质量/(抗体蛋白浓度X效 价)。单抗蛋白浓度的测定按公式进行计算蛋白质浓度(mg/mL) = 1. 45A280-0. 74A260 ；效 价的测定采用间接ELISA法。最终测得的单抗蛋白浓度为0.868mg/mL，其抗体效价为1 32000，单抗的亲和 常数为5. 53X IO9LAioI。一般认为亲和常数K在IO8 IOltl之间即为高亲和力的单抗，说 明本研究得到的单克隆抗体可以应用于DMT免疫分析方法的开发。综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡 依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
权利要求
去氢甲睾酮单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.3807的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株UJS-1D6F10B4所分泌。
2.权利要求1所述的去氢甲睾酮单克隆抗体，其特征在于按照下述步骤制备得到(1) 肟化通过去氢甲睾酮与羧甲基羟胺反应，引入具有反应活性的氨基基团，并进行检测确 认；(2)完全抗原制备通过活化酯法，将具有氨基的去氢甲睾酮肟偶联到钥孔血蓝蛋白 和鸡卵清蛋白载体上，并进行检测确认；(3)动物免疫将制备的具有免疫活性免疫原免 疫Balb/C小鼠，并采用间接ELISA检测其效价；⑷细胞融合采用聚乙二醇法将经免疫 的Balb/C小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合；(5)杂交瘤细胞筛选利用建立起的 间接ELISA方法检测融合细胞上清，筛选出阳性的杂交瘤细胞；(6)杂交瘤细胞亚克隆采 用有限稀释法将阳性孔的细胞进行亚克隆，以得到纯化的杂交瘤细胞株；(7)杂交瘤细胞 株的亚型鉴定采用小鼠单克隆抗体免疫胶体金亚型试剂盒对单克隆抗体进行亚型鉴定； (8)单抗的制备及IC5(I值、交叉反应率和亲和力的测定采用ELISA方法对得到的单克隆抗 体进行IC5(I、亲和力和特异性进行测定。
3.权利要求1所述的去氢甲睾酮单克隆抗体的应用，可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。
4.分泌权利要求1所述的去氢甲睾酮单克隆抗体的杂交瘤细胞，是保藏编号为 CGMCCNo. 3807的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株UJS-1D6F10B4。
全文摘要
本发明去氢甲睾酮单克隆抗体、制备方法及其应用，属于医学免疫学检测领域。公开了去氢甲睾酮单克隆抗体，由保藏号为CGMCC No.3807的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株所分泌。通过在不同的蛋白载体上偶联一定数目的去氢甲睾酮分子，制备具有免疫原性的完全抗原和用于ELISA的包被抗原；再利用完全抗原免疫Balb/C小鼠，经过细胞融合并利用间接ELISA筛选，并经过亚克隆纯化培养，得到了能稳定分泌DMT单克隆抗体、高亲和力、高特异性的杂交瘤细胞株；本发明的单克隆抗体对DMT具有较高的亲和力和灵敏度，并具有显著的专一性，与类似物丙酸睾酮酯、群勃龙的交叉反应率低于1％。本发明可以应用于去氢甲睾酮的快速检测。
文档编号C12N5/20GK101885774SQ201010213218
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者储晓刚, 张勋, 王云, 董英 申请人:江苏大学