专利名称：乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基 因疫苗，还涉及该疫苗的制备方法。
背景技术：
乙肝病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型肝炎是由HBV引起，主要通过血液、 体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性HBV感染，我 国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌， 是当前WHO公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗HBV药物一 直是亟待解决的研究课题。目前，慢性HBV感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病 毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差， 不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性HBV感 染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内HBV复制的来源， 长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。CD8+T细胞是机体免疫系统的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微 生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。HBV感染 的慢性化主要是由于机体对HBV的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致 感染的持续存在。在急性HBV感染时，机体存在大量的针对HBV多个抗原表位的多特异性、 多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性HBV感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检 测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对HBV的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有 望清除病毒，终止慢性HBV感染。乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)是HBV的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击 HBV感染细胞的主要靶抗原。因此，增强HBcAg特异性的CTL应答，有望终止慢性HBV感染。 但是，HBV的慢性患者存在免疫应答低，特异性细胞免疫激活不足，外周免疫耐受等问题，在 设计治疗性疫苗时需增强免疫系统对HBV的识别能力以激发有力的特异性细胞免疫。0X40配体(0X40L)属肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，为II型跨膜糖蛋白。0X40/ 0X40L作为一对重要的免疫共刺激分子，为T、B细胞的激活提供了重要的第二信号。它们 的相互作用能促进CD4+T细胞的活化、增殖、迁移并延长其寿命，还能促进生发中心的形成 和树突状细胞的分化成熟。免疫刺激复合物(ISCOM)是由抗原、皂苷Quil A、胆固醇及磷脂混合后自发形成 的一种直径为30 40nm的球形笼状颗粒，具有佐剂和抗原递呈的双重功能，可大幅度提高 抗原的免疫原性。文献报道，以ISCOM为佐剂制得的DNA疫苗诱导的中和抗体水平和免疫 保护力明显高于裸DNA，可能的机制是经ISCOM包裹的DNA能免受体内核酸酶的降解，从而 保证该DNA在机体内持续表达。另外，ISCOM的结构特性使其更易于定居在淋巴组织内，从 而有利于抗原递呈细胞的吞噬。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种HBcAg的免疫增强型基因疫苗；目的 之二在于提供所述HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案1、HBcAg的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBcAg和0X40L双基因共表达重组 真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的ISCOM型疫苗。进一步，所述HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进 入位点(IRES)的双基因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和 0X40L 全长 cDNA ；进一步，所述HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及 卵磷脂的质量比为5 10 1 1。2、所述HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备方法，包括以下步骤a,HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体的构建将HBcAg全长cDNA插入含 有IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将0X40L全长cDNA插入该真核载体的 IRES下游，即得HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体；b、ISCOM的制备将HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓冲 液(PBS)溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和 0X40L双基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil Almg、胆固醇0. Img和卵磷脂0. Img, 冰浴超声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISC0M。进一步，所述步骤a的具体方法为al、HBcAg全长cDNA的克隆提取HBV转基因小鼠肝脏细胞总RNA，逆转录得到总 cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列为上下游引物，PCR 扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBcAg全长cDNA，PCR条件为94°C预变性 5分钟；然后94°C变性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延 伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入PGEM-T Easy载体，得重组载体pT_HBcAg ；a2、0X40L全长cDNA的克隆提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该 总cDNA为模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分 别带有BamH I和Sal I酶切位点的B细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为94°C预变性5 分钟 ’然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸 10分钟；PCR产物经纯化后克隆入PGEM-T Easy载体，得重组载体pT_0X40L ；a3、重组真核载体的构建自步骤al所得重组载体pT-HBcAg中用Pst I和 EcoR I双酶切出HBcAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核 载体pStar连接，得重组载体pStar-HBcAg ；再自步骤a2所得重组载体pT_0X40L中 用BamH I和Sal I双酶切出0X40L全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sal I双 酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，即得HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体 pStar-HBcAg-IRES-0X40Lo本发明的有益效果在于本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够促进HBcAg 特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制能力，且制备方法简单、成本低 廉，在抗病毒免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进 一步的详细描述，其中 图1为PCR扩增HBcAg全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图2为PCR扩增0X40L全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳结果；图3为透射电镜检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗的结构；图4为酶联免疫斑点(ELISP0T)法检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗激发T细胞 分泌干扰素_ Y (IFN- γ )的能力；图5为HBV转基因小鼠血清ALT活性检测结果；图6为HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测结果。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明 具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克 等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、HBcAg的免疫增强型基因疫苗的制备1、HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体的构建(1) HBcAg 全长 cDNA 的克隆根据GenBank登录号为NC_003977. 1的HBcAg基因序列，设计并合成如下引物以 PCR扩增两端带有酶切位点的HBcAg全长cDNA 上游引物Fl 5‘-aatctgcagggcatggacatcg acccttat-3，(SEQ ID No. 3)，下划线部分为 Pst I 酶切位点；下游引物 Rl :5，tacgaattcag ttccccaccttatgagtc-3’ (SEQ ID No. 4)，下划线部分为EcoR I酶切位点；分离HBV转基因 小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，调节细胞密度为2 X IO7个/mL，收集细胞， PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA ；将所得细胞总RNA逆转录为总cDNA， 再以该总cDNA为模板、Fl和Rl为上下游引物进行PCR扩增，PCR条件为94°C预变性3分 钟，然后94°C变性1分钟、58°C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸 7分钟；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy 载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳 性克隆，提取质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了 HBcAg全 长cDNA序列(SEQ ID No. 1)的阳性克隆质粒命名为pT_HBcAg ；PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳 道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。(2) 0X40L 全长 cDNA 的克隆根据GenBank登录号为NM_003326的0X40L基因序列，设计并合成如下引物以PCR 扩增两端带有酶切位点的0X40L全长cDNA 上游引物F2 5，-Ratc-RRatccatRRaaaRRRtcca accc-3，(SEQ ID No. 5)，下划线部分为 BamH I 酶切位点；下游引物 R2 :5’ acgcgtcgactcaa aggacacagaattcacca-3，(SEQ ID No. 6)，下划线部分为 Sal I 酶切位点；按 Trizol 试剂盒 说明书提取人脾脏组织总RNA，反转录得到总cDNA，再以该总cDNA为模板，采用上下游引物
5F2和R2进行PCR扩增，PCR总体系为50 μ L，PCR条件为94°C预变性5分钟；然后94°C变 性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与PGEM-T Easy载体连接，连 接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取 质粒，委托上海生工生物工程技术服务有限公司测序验证，将插入了 0X40L全长cDNA序列 (SEQ ID No. 2)的阳性克隆质粒命名为PT-0X40L。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳 道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符。(3) HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体的构建根据HBcAg和0X40L全长cDNA两端所设计的酶切位点，先将HBcAg全长cDNA插入 含有IRES的双基因共表达真核载体pStar的IRES上游，再将0X40L全长cDNA插入pStar载 体的IRES下游。具体方法为先将重组载体pT-HBcAg用PstI和EcoR I双酶切，双酶切产 物经凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与同样经Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar 连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克 隆，提取质粒，Pst I和EcoR I双酶切鉴定，将阳性克隆质粒命名为重组载体pStar-HBcAg; 再将重组载体PT-0X40L用BamH I和Sal I双酶切，双酶切产物经凝胶回收试剂盒切胶回 收纯化后，与同样经BamH I和Sal I双酶切的重组载体pStar-HBcAg连接，连接产物转化 大肠杆菌DH5ci感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取质粒，BamH I 和Sal I双酶切鉴定，阳性克隆质粒即为HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体，将其 命名为 pStar-HBcAg-IRES-0X40L。2、ISCOM 的制备将HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES_0X40L用PBS 溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg和0X40L双 基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil A lmg、胆固醇0. Img和卵磷脂0. lmg，冰浴超 声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的ISC0M，也即HBcAg 的免疫增强型基因疫苗。3、透射电镜分析将新鲜制备的ISCOM滴于200目铜网上，吸附3分钟，吸水纸吸干，晾干30秒，以 浓度为(w/v)的水溶性醋酸铀负染30秒，吸水纸吸干，晾干30秒，80kV透射电镜观察。 结果如图3所示，所得ISCOM呈大小均一的近圆形颗粒，绝大多数颗粒长径小于25nm。二、HBcAg的免疫增强型基因疫苗的体内免疫及检测将雄性BALB/c小鼠随机分为实验组、对照组和空白对照组，每组10只；实验组以 本发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗为免疫原，对照组以HBcAg基因疫苗(HBcAg单基因 重组表达载体的ISC0M)为免疫原，空白对照组以PBS为免疫原；三组小鼠按100 μ L的剂量 行腹腔免疫，每隔2周免疫1次，连续免疫3次。1、ELISP0T法检测HBcAg的免疫增强型基因疫苗激发CTL分泌IFN- γ的能力末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细 胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓 度为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为IX 106个/mL，作为效应细胞；采用ELISP0T检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作在96孔培养板中，每孔加入 体积百分浓度为70%的乙醇100μ L，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入IFN-γ捕获抗体 (稀释度为1 100) 100yL，温度4°C孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2%的脱 脂奶粉100 μ L，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100 μ L，温度37°C孵育48小时， PBST (即含有质量百分浓度为0. 的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗IFN-γ 抗体(稀释度为1 100) 100 μ L，温度37°C孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素 标记的碱性磷酸酶(稀释度为1 5000) 100 μ L，温度37°C孵育1小时，PBST洗涤，拍干培 养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100 μ L，室温避光显色2 10分钟至斑点形成， 用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；各组斑点数以3个复孔的均值表示。结果见图4，实验组的斑点数明显高于对照组和空白对照组，表明本发明的HBcAg 的免疫增强型基因疫苗具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌IFN- γ。2、HBV转基因小鼠血清ALT活性检测末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清ALT活 性。结果见图5，实验组的血清ALT活性明显高于对照组和空白对照组，表明本发明的 HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤HBV感染肝细胞，从 而导致血清ALT活性明显升高。3、HBV转基因小鼠血清HBV DNA抑制率检测末次免疫后1周，断颈处死小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清HBV DNA抑制率。结果见图6，实验组的血清HBV DNA抑制率明显高于对照组和空白对照组，表明本 发明的HBcAg的免疫增强型基因疫苗能够有效抑制HBV的复制，显著降低血清HBV DNA载量。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参 照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可 以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明 的精神和范围。
权利要求
乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于该疫苗是由乙肝病毒核心抗原即HBcAg和OX40配体即OX40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物型疫苗。
2.根据权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于所述 HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体是在含有内部核糖体进入位点即IRES的双基 因共表达真核载体的IRES上游和下游分别插入HBcAg全长cDNA和T细胞激活因子全长 cDNA。
3.根据权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗，其特征在于所 述HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂的质量比为 5 10 1 1。
4.权利要求1所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征在 于包括以下步骤a、HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体的构建将HBcAg全长cDNA插入含有 IRES的双基因共表达真核载体的IRES上游，再将0X40L全长cDNA插入该真核载体的IRES 下游，即得HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体；b、免疫刺激复合物的制备将HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体用磷酸盐缓 冲液即PBS溶解后，加入皂苷Quil A，再加入胆固醇及卵磷脂，使每毫升溶液中含有HBcAg 和0X40L双基因共表达重组真核载体0. 5mg、皂苷Quil A lmg、胆固醇0. lmg和卵磷脂 0. lmg，冰浴超声处理使溶液充分混勻并乳化，再用PBS透析，所得微絮状物即为形成的免 疫刺激复合物。
5.根据权利要求4所述乙肝病毒核心抗原的免疫增强型基因疫苗的制备方法，其特征 在于所述步骤a的具体方法为al、HBcAg全长cDNA的克隆提取乙肝病毒转基因小鼠肝脏细胞总RNA，逆转录得到总 cDNA，再以该总cDNA为模板，以SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示序列为上下游引物，PCR 扩增两端分别带有Pst I和EcoR I酶切位点的HBcAg全长cDNA，PCR条件为94°C预变性 5分钟；然后94°C变性50秒，58 °C退火50秒，72 °C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延 伸10分钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT_HBcAg ；a2、0X40L全长cDNA的克隆提取人脾脏组织总RNA，逆转录得到总cDNA，再以该总 cDNA为模板，以SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示序列为上下游引物，PCR扩增两端分别带 有BamH I和Sal I酶切位点的T细胞激活因子全长cDNA，PCR条件为94°C预变性5分钟； 然后94°C变性50秒，58°C退火50秒，72°C延伸2分钟，共30个循环；最后72°C延伸10分 钟；PCR产物经纯化后克隆入pGEM-T Easy载体，得重组载体pT_0X40L ；a3、重组真核载体的构建自步骤al所得重组载体pT-HBcAg中用Pst I和EcoR I双酶 切出HBcAg全长cDNA，经纯化后与同样用Pst I和EcoR I双酶切的真核载体pStar连接， 得重组载体pStar-HBcAg ；再自步骤a2所得重组载体pT_0X40L中用BamH I和Sal I双酶 切出0X40L全长cDNA，经纯化后与同样用BamH I和Sail双酶切的重组载体pStar-HBcAg 连接，即得HBcAg和0X40L双基因共表达重组真核载体pStar-HBcAg-IRES_0X40L。
全文摘要
本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的免疫增强型基因疫苗，该疫苗是由HBcAg和OX40配体(OX40L)双基因共表达重组真核载体、皂苷Quil A、胆固醇及卵磷脂组成的免疫刺激复合物(ISCOM)型疫苗，能够促进HBcAg特异性T细胞免疫应答，高效诱导免疫细胞的抗病毒复制能力，在抗乙肝病毒感染领域具有良好的应用前景；本发明还涉及该疫苗的制备方法，操作简便，成本低。
文档编号C12N15/79GK101884793SQ20101021320
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者吴玉章, 杨曌 申请人:中国人民解放军第三军医大学