专利名称：一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法。
背景技术：
石油资源的短缺、价格波动及诸多环境问题使一种新型的液体燃料——生物丁醇受到越来越多的关注。丁醇是一种极具潜力的生物燃料，具有诸多的优点丁醇热值和辛烷值与汽油相当，且抗暴性能好；丁醇不腐蚀管道，便于管道运输，可以使用现有的汽油的供应和分销系统；与其他生物燃料相比，丁醇的安全性更高；丁醇和汽油的混合比更高，不需对现有车辆进行改造。虽然生物丁醇作为石油替代品的前景诱人，但目前其生产成本较高， 仍缺乏市场竞争力。原料成本约占丁醇生产成本的60% 70%，是丁醇商业化生产的瓶颈问题。国内丁醇发酵的传统原料主要是玉米，考虑到我国粮食安全问题，以非粮作物为原料生产丁醇将是未来发展的方向。其中，秸秆、玉米芯等木质纤维素类农业废弃物来源广泛、价格低廉， 是丁醇发酵的理想原料。丁醇生产菌——丙酮丁醇梭菌不能直接利用木质纤维素原料，需将其水解成单糖后才能用于发酵。稀酸处理是目前研究最为广泛的预处理方法，玉米芯等半纤维含量较高的原料尤其适合用稀酸进行处理。但纤维原料经预处理酶解后，生成可发酵糖的同时也生成了一定量的发酵抑制物，已报道的发酵抑制物主要包括有机酸、醛类、酚类化合物等。这些水解副产物在超过一定浓度时对丁醇发酵菌株的生长与发酵均有显著的抑制作用。目前国内外丁醇发酵方面的研究多集中在淀粉质原料上，以纤维素为原料的报道极少，且产量不高，一般在4g L—1 8g L—1间，发酵得率在0. 182 0. 299间(发酵得率=总溶剂浓度gL_7初总糖浓度g L—1)，发酵时间一般>72h。水解副产物对丁醇生产菌的抑制作用是造成发酵水平不高的主要原因之一。以玉米芯为原料生产丁醇的方法还未见报道。目前从纤维素原料水解物中除去丁醇生产微生物生长抑制物的方法仅见氢氧化钙过中和法、大孔树脂吸附法和电渗析法。氢氧化钙过中和法虽可有效去除酚类化合物，显著改善水解物的发酵性能，但过量氢氧化钙造成的碱性条件会使糖类成分遭到破坏，使糖的回收利用率降低，国外报道，经氢氧化钙过中和法处理玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)水解物，可使丁醇浓度提高至7. 2g Γ1。大孔树脂法也主要针对水解物中的酚类化合物，但同样会造成糖的损失，国外报道，经大孔树脂吸附法处理玉米纤维水解物，可使丁醇浓度提高至6.4g L—1。电渗析法在阴、阳离子交换膜和直流电场的作用下主要用于脱除盐类。为防止膜堵塞，水解物需提前通过微生物孔滤膜，而且交换膜的寿命有限，操作成本较高。因此需根据不同原料产生抑制物的成分特点和丁醇生产微生物对不同抑制物的耐受性，针对性地开发廉价、操作性高的脱毒方法，降低水解液的毒性，减少其对丙酮丁醇梭菌生长和发酵的抑制作用。
发明内容
本发明的目的是针对目前以纤维素为原料发酵生产燃料丁醇工艺中丁醇含量低的不足，发明一种以玉米芯水解液为底物，阳离子交换树脂脱毒后发酵生产丁醇的新方法， 以提高丁醇产量、降低生产成本。本发明所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现本发明以农业废弃物玉米芯为原料，主要包括如下工艺单元玉米芯纤维素粉的预处理及酶水解；玉米芯水解液的脱毒；发酵培养基的配制；种子液的制备；发酵。具体步骤如下1.玉米芯纤维素粉的预处理及酶水解玉米芯60°C烘干，粉碎后过35目筛，将玉米芯纤维素粉与0.5% (ν/ν)的稀硫酸按1 10(质量体积)的比例混合，110°C作用 15min，冷却至室温后用Ca(OH)Jjf pH为4. 8，按20 25Iu/g纤维素加入纤维素酶，50°C作用2 3d。反应结束后，离心除去固体物质，上清即为玉米芯水解液。(Iu为国际标准酶活 每分钟催化底物生成1 μ mol葡萄糖的酶量为一个酶活单位，IIu)2.玉米芯水解液的脱毒用清水对阳离子交换树脂进行冲洗至水清澈无杂质，然后用lmol/L的盐酸浸泡池 4h，用清水冲至中性后再用lmol/L氢氧化钠浸泡池 4h， 清水冲至中性再用lmol/L盐酸浸泡池 4h，放尽酸液，清水冲至中性即得活化好的阳离子交换树脂。将60ml活化好的阳离子交换树脂装在直径为25mm的玻璃柱中，玉米芯水解液以6ml/min的速度流过树脂柱，过柱后的液体为玉米芯水解液的脱毒液。3.水解液及脱毒液中发酵抑制成分的分析采用高效液相色谱法。色谱系统: Lab AllianceseriesIII 泵，Thermo AS3000 自动进样器，Thermo UV6000 紫外检测器，波长 280nm ；色谱条件流动相为20 80的甲醇和水，流速lml/min，采用GraceSmart RP185u C18分析柱Q50mmX4. 6mm)，柱温25°C，进样量20 μ L，检测器在检测色谱图的同时自动逐点进行200nm-800nm波段的光谱扫描，得到以时间-波长-吸收值为坐标的三维色谱光谱图。4.发酵培养基的配制每升脱毒液中加入IgCH3COO (NH4)、0. 2g MgS04、0· 6g KH2PO4,用Ca(OH)Jf pH为7. 0，此过程会生成沉淀，3000r/min离心IOmin去沉淀，取上清加入到厌氧瓶中，每升上清液中加入2. 5g 3. 5g豆粕作为发酵氮源。向厌氧瓶中充氮气去除氧气，盖好内外塞，115°C灭菌20min备用。5.种子液的制备玉米晒干，粉碎后过35目筛。将玉米粉与自来水按1 15 20(质量体积)的比例混合均勻，煮成糊状，补足蒸发水分后，分装到厌氧管中，充氮气去除氧气后121°C灭菌60min，即配制成种子培养基。从保存有丙酮丁醇梭菌菌种的种子培养基中吸取孢子液，按1 8 1 12(体积体积)的比例接种到新配制的种子培养基中， 沸水浴热击90s，37°C静止培养2 2 可用做种子液。6.发酵过程每升发酵培养基中加入80ml 120ml种子液，同时加入IOml 20ml 维生素混合液，37°C静止发酵60h 72h。所述的纤维素酶，购自宁夏和氏璧生物技术有限公司。滤纸酶活FPA彡4万u/g、 羧甲基纤维素酶活彡100万u/g。酶活定义lg酶粉于50°C、pH4. 8条件下，Imin水解底物 (滤纸、CMC、脱脂棉或水杨素)产生Iug葡萄糖的量为一个酶活力单位。所述的树脂为阳离子交换树脂，优选强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂001X7(732)。所述的豆粕提前过60目筛。所述的菌种为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)CICC 8012，购自中国工业微生物菌种保藏中心。申请人已于2010年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为 CCTCC M 2010148。所述的维生素混合液包括生物素、维生素Bi、烟酸、维生素B6和肌醇，其在混合液中的终浓度为生物素O.OlgL—1、维生素B10.8g L—1、烟酸0.8g L—1、维生素B60. 8g L-1、肌醇 2g Γ1,自来水配制后过滤除菌，4°C保存备用。本发明的特点1.本发明利用农业废弃物玉米芯进行微生物丁醇转化，在生产清洁的生物燃料的同时，解决大量玉米芯不能被合理利用对环境造成的压力。2.玉米芯水解物经阳离子交换树脂脱毒后，发酵抑制物的含量大幅度降低，其丁醇得率也较高，将阳离子树脂脱毒方法用在丁醇生产上具有显著的进步。3.本发明工艺路线简单、可靠，成本低廉。发酵结束后，丁醇浓度为10. 11. 7 !/1,总溶剂(ABE)的浓度为16. HgL—1 17. SSgL—1，发酵得率大于0.400。其发酵指标达到了同等条件下以玉米为原料的发酵水平。与玉米为原料生产丁醇相比，具有优势。
图1为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(未经脱毒处理)；图2为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(经阴离子树脂脱毒处理)；图3为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(经非离子型大孔树脂脱毒处理)；图4为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(经Ca (OH)2过中和脱毒处理)；图5为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(经脱毒处理，脱毒前调pH至 7)；图6为玉米芯水解液中发酵抑制物的液相色谱图(经脱毒处理，脱毒前不调pH)。
具体实施例方式以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。实施例1 (不脱毒)取IOg玉米芯纤维素粉置于250ml的三角瓶中，加入IOOml 0. 5% (ν/ν)的稀硫酸，110°C作用15min，冷却至室温后用Ca (OH) 2调pH为4. 8，加入纤维素酶，50°C作用3d，反应结束后，离心除去固体物质得水解液。采用液相色谱系统分析水解液(结果见图1)，出峰时间随PH变化略有变化，在 2. Smin左右出现第一种发酵抑制物的特征性吸收峰，峰面积为3886023 ；在3. Omin左右出现第二种发酵抑制物的特征性吸收峰，峰面积为1843106 ；在3. :3min左右出现第三种发酵抑制物的特征性吸收峰，峰面积为2296615 ；在3. 6min左右出现第四种发酵抑制物的特征性吸收峰，峰面积为2717806。取上清液IOOml，加入0130)0(朋4)0· lg、MgS040. 02g,KH2PO4O. 06g，用 Ca (OH) 2 调 pH 为7. 0,3000r/min离心IOmin除去沉淀，取50ml上清加入到IOOml厌氧瓶中，并在厌氧瓶中加入0. 15g小于60目的豆粕，充氮气除氧后115°C灭菌20min备用。接入5ml种子液， 同时加入0. 5ml维生素混合液，37°C静止培养72h，发酵液中丁醇含量仅2. 33g/L，ABE含量
3.65g/L，发酵得率为0. 074。实施例2 (阴离子交换树脂脱毒)水解液制备同对照例1，水解液过活化好的强碱性苯乙烯系阴离子树脂柱得脱毒液。采用液相色谱系统分析脱毒液(结果见图2)，四种发酵抑制物的峰面积分别减少至2640531,233180,137284和554778。与未脱毒相比，峰面积分别减少32. 05%,87. 35%,
94.02% 和 79. 59%。取经脱毒的上清液100ml，进行发酵培养，发酵培养基的配制和接种同对照例1， 37°C静止培养72h，发酵液中丁醇含量仅0. 45g/L，ABE含量0. 58g/L，发酵得率为0. 019。实施例3 (非离子型大孔树脂脱毒)水解液制备同对照例1，水解液过活化好Amberlite XAD-4大孔树脂得脱毒液。采用液相色谱系统分析脱毒液(结果见图3)，四种发酵抑制物的峰面积分别减少至1658745，417942，888364和1167483。与未脱毒相比，峰面积分别减少57. 31%, 77. 32%, 61. 32%和 57. 04%。取经脱毒的上清液100ml，进行发酵培养，发酵培养基的配制和接种同对照例1， 37°C静止培养72h，发酵液中丁醇含量仅2. 86g/L，ABE含量3. 98g/L，发酵得率为0. 164。实施例4 (Ca (OH) 2过中和脱毒)水解液制备同对照例1，将水解液用Ca(OH)2调pH = 11，摇勻后于50°C水浴锅中恒温30min，之后用60% (ν/ν)的H3PO4调pH = 7. 0,4000rpm离心lOmin，所得上清液即为
脱毒液。采用液相色谱系统分析脱毒液(结果见图4)，四种发酵抑制物的峰面积分别减少至3698956，1899723,2449663和沘8859187。与未脱毒相比，峰面积分别减少
4.81%, -3. 07%, -6. 66%和-5. 20%。取经脱毒的上清液100ml，进行发酵培养，发酵培养基的配制和接种同对照例1， 37°C静止培养72h，发酵液中丁醇含量仅1. 91g/L，ABE含量2. 15g/L，发酵得率为0. 105。实施例5玉米芯的预处理及酶水解同实施例1。取酶水解结束后离心得到的上清液用 Ca(OH)2调pH为7. 0，再离心后的上清液过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂脱毒得脱毒液。采用液相色谱系统分析脱毒液(结果见图幻，四种发酵抑制物的峰面积分别减少至275698，54951，98959和582966ο与未脱毒相比，峰面积分别减少92. 91%,97. 02%,
95.69%和 78. 55%。取脱毒液的上清液100ml，加入 CH3COO(NH4)O. lg、MgSO4O. 02g、KH2PO4 0. 06g,用 Ca(OH)2调pH为7. 0，此过程生产沉淀，3000r/min离心IOmin除去沉淀，取50ml上清液加入到IOOml厌氧瓶中，并在厌氧瓶中加入0. 15g小于60目的豆粕，充氮气除氧后115°C灭菌20min备用。接入5ml种子液，同时加入0.5ml维生素混合液，37°C静止培养60h。发酵液中丁醇含量达到10. 25g/L，ABE含量为17. 58g/L，发酵得率为0. 423。实施例6玉米芯的预处理及酶水解同实施例1，酶解结束后离心得到的上清液不调PH直接过强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂脱毒得脱毒液。采用液相色谱系统分析脱毒液(结果见图6)，四种发酵抑制物的峰面积分别减少至236841，252918，M5523和1936729。与未脱毒组相比，峰面积分别减少93. 91%, 86. 28%,89. 31%和 28. 74%取经脱毒的上清液100ml，进行发酵培养，发酵培养基的配制和接种同实施例1， 37°C静止培养60h。发酵液中丁醇含量为11.75g/L，ABE含量为17. 27g/L，发酵得率为 0. 422。
权利要求
1.一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法，其特征是包含以下步骤纤维素的预处理及酶水解、纤维素水解液的脱毒、发酵培养基的配制、丁醇生产微生物种子液的制备、接种和发酵。
2.根据权利要求1所述的一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法，其特征是所述的纤维素水解液的脱毒是用阳离子交换树脂进行脱毒。
3.根据权利要求2所述的一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法，其特征是所述的纤维素水解液的脱毒是用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行脱毒。
4.根据权利要求1所述的一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法，其特征是具体生产步骤为1)纤维素粉的预处理及酶水解纤维素烘干、打粉、过筛，将纤维素粉与0.5% (ν/ν)的稀硫酸按质量/体积比为1 10的比例混合，110°C作用15min，冷却至室温后用Ca(OH)2 调pH为4. 8，加入纤维素酶，50°C作用2 3d，反应结束后，离心除去固体物质，上清即为纤维素水解液；2)纤维素水解液的脱毒将水解液通过活化好的阳离子树脂交换柱；3)发酵培养基的配制每升脱毒液中加入IgCH3COO(NH4)、0.2gMgS04、0. 6g 1^#04，用 Ca(OH)2调pH为7. 0，离心除去沉淀，取上清加入到厌氧瓶中，每升上清液中加入2. 5g 3. 5g豆粕作为发酵氮源；向厌氧瓶中充氮气去除氧气，盖好内外塞，灭菌备用；4)种子液的制备将玉米粉与自来水按质量/体积比为1 15 20的比例混合均勻，煮成糊状，补足蒸发水分后，分装到厌氧管中，充氮气去除氧气后121°C灭菌60min，即配制成种子培养基；在保存有丙酮丁醇梭菌菌种的种子培养基中吸取孢子液，按体积/体积为1 8 1 12的比例接种到新配制的种子培养基中，沸水浴热击90s，37°C静止培养 23h 25h ；5)接种和发酵将步骤4)制备的种子液接种到步骤幻制备的发酵培养基中，每升发酵培养基中加入80ml 120ml种子液，同时加入IOml 20ml维生素混合液，37°C静止发酵 60h 72h。
5.根据权利要求4所述的以纤维素为原料生产燃料丁醇的方法，其特征是维生素混合液包含生物素、维生素Bi、烟酸、维生素B6和肌醇，其在混合液中的终浓度为生物素 O.OlgL—1、维生素B10.8g L—1、烟酸0.8g L—1、维生素B60. 8g L—1、肌醇2g L—1，自来水配制后过滤除菌，4°C保存备用。
6.权利要求1或2或3或4或5所述的以纤维素为原料生产燃料丁醇的方法，其特征是所述的纤维素为玉米芯。
全文摘要
本发明属于微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种以纤维素为原料发酵生产丁醇的方法。本发明方法包含以下步骤纤维素的预处理及酶水解、纤维素水解液的脱毒、发酵培养基的配制、丁醇生产微生物种子液的制备、接种和发酵。纤维素水解液的脱毒是用强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂进行脱毒。本发明工艺路线简单、可靠，成本低廉，易于工业化。
文档编号C12R1/145GK102311978SQ20101021307
公开日2012年1月11日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者孙彦平, 方扬, 赵海, 靳艳玲 申请人:中国科学院成都生物研究所