专利名称：一种提高植物抗逆性的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和转基因植物技术领域，具体涉及一种外源基因(如小鼠古 洛糖酸内酯氧化酶基因)及其在植物组织中高效表达的载体，并涉及在植物组织中高效表 达外源基因的方法，以提高植物抗逆性能。还涉及被所说的表达载体转化的植物，以及表达 小鼠古洛糖酸内酯氧化酶的转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。
背景技术：
L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶(L-Gulono-1, 4-lactone oxidase, GLOase, EC 1. 1. 3. 8)是(除人和豚鼠以外)其他高等动物维生素C合成途径最后一步关键酶，催化古洛 糖酸内酯氧化成维生素C。高等植物叶片维生素C合成途径为L-半乳糖酸途径，该途径最 后一步关键酶L-半乳糖酸-1，4-内酯脱氢酶与L-古洛糖酸-1，4-内酯氧化酶在进化上比 较保守，均能够催化L-半乳糖酸-1，4-内酯氧化成维生素C (Nessler,2004)o维生素C(L-aSCorbiC acid，AsA)是植物抗氧化系统中非酶抗氧化物质的重要成 员之一。它协同相关作用酶清除植物在正常生理状态、干旱、盐碱等环境胁迫中产生的活性 氧(Reactive Oxygen Species, R0S)，保护机体免受氧化损伤(Conklin 和 Barth 2004 ； Pavet等2005)。通过转基因等遗传改造技术提高植物的抗逆境胁迫能力，同时改善植物的 特殊营养品质或提取天然植物VC有巨大意义。
发明内容
本发明的第一目的就是提供一种适合在植物组织中高效表达小鼠古洛糖酸内酯 氧化酶的融合基因及载体。本发明的第二目的是提供一种利用转基因植物的组织高效表达小鼠古洛糖酸内 酯氧化酶的方法，研究外源基因对植物生长的影响，增强植物的抗逆性能。本发明还提供了这种新的小鼠古洛糖酸内酯氧化酶及其编码序列在植物抗逆境 胁迫能力中的应用。本发明的第一方面，提供了在植物组织中高效表达融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL的载体，该载体从5’至3’依次包含以下元件35S启动子、小鼠古洛糖 酸内酯氧化酶全长cDNA编码序列(MLOase )和5个MYC标签组成的融合基因GWase polyEQKLISEEDL、终止子序列(Noster PolyA)。在本发明中，在所述启动子与小鼠古洛糖酸内酯氧化酶蛋白全长编码cDNA序列 之间带有一分el位点；MYC标签的编码序列的末段带有一fe坊II位点。更佳地，小鼠古洛糖酸内酯氧化酶融合基因ffiflase: poIyEQKLISEEDL具有SEQ ID N0. 4所示的核苷酸序列；以及由SEQ ID N0. 5所示的氨基酸序列。本发明选用小鼠的古洛糖酸内酯氧化酶基因作为研究的外源基因。本发明首先提供一种外源基因在植物组织中高效表达的载体，为使外源蛋白(小 鼠古洛糖酸内酯氧化酶)在植物组织中高效表达。
在本发明的一个实施例中，所构建的载体包括如下序列元件35S启动子、终止子 序列。在本发明的一个实施例中，为了在植物组织中检测小鼠古洛糖酸内酯氧化酶蛋 白，在小鼠古洛糖酸内酯氧化酶蛋白的全长编码序列后加上了 MYC标签的编码序列，从而 构建了融合基因 ffi^ase: polyEQKLISEEDL。本发明提出的通过在植物中表达所述的融合基因，实现提高植物抗逆性的方法， 包括如下步骤
1、将所述的含融合基因ffifeM:polyEQKLISEEDL的载体利用农杆菌介导法转化植物， 获得基因组中整合有融合基因GWase ·. polyEQKLISEEDL的转基因植物；
2、所获得的转基因植物因其组织如叶中含有表达的小鼠古洛糖酸内酯氧化酶而具有 增强抗逆能力。所述植物为高等植物，在实施例中，所述植物为拟南芥。
图ι·RT-PCR 获得 GLOase 基因。
图2·基因GWase在拟南芥中的检测。
图3·融合基因在拟南芥中表达情况。
图4·盐胁下拟南芥根长。
图5·盐胁迫下拟南芥侧根形态。
图6·盐胁迫下拟南芥叶片形态。
图7·拟南芥幼苗期盐胁迫下MDA含量。
图8·30% PEG-6000处理下拟南芥MDA含量变化。
图9·拟南芥中维生素C含量。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步的阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明，而不是用于限制本发明的范围。下面具体实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规的条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或者按照制造厂商所建议的条件。实施例1在植物组织中高效表达融合基因GLOase ·. polyEQKLISEEDL的载体的构 建
该实施例的载体构建过程如下所示，该基因构建物即为在组织中表达的融合基因 (ffiflase:polyEQKLISEEDL)的载体。其中在植物组织中高效表达的启动子来源于花椰菜病 毒的35S启动子CaMV35S，编码序列来源于小鼠古洛糖酸内酯氧化酶蛋白cDNA基因序列。含融合蛋白GWase ·. polyEQKLISEEDL的载体的构建过程 1. 基因GLOase的序列
根据GLOase的编码序列设计并合成如下引物
Gulo_F :ATACTAGTATGGTCCATGGGTACAAAGGGG (SEQ ID NO. 1)
Gulo_R TTGGATCCGTAGAAAACCTTTTCCA (SEQ ID NO. 2)其中Gulo_F引物序列有分el酶切位点(加框序列)、Gulo_R引物序列有I酶切 位点(加框序列)。以小鼠肝脏总RNA为模板，采用如上所述的引物通过RT-PCR获得GWase基因全 长序列(图1)。2. 融合基因 ffiflase: polyEQKLISEEDL 的序列
将含有克隆出的序列的质粒载体用RBmM I双酶切，切下ffiflase基因连入已 经用分el RBanM I酶切改造的含有polyEQKLISEEDL基因序列的pHB载体大片段中，获 得融合基因polyEQKLISEEDL (SEQ ID NO. 4)，该融合基因全长长度为1578bp，编 码525个氨基酸残基，分子量为60，236道尔顿，等电点(pi)为6. 11。融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL 全长可由 Gulo_F (SEQ ID NO. 1)和如下引物 PCR 获得 MYC_R :ATGGTAACCTTACCCCGGGCTGCAGGAAT (SEQ ID NO. 3) 其中WK有BstE II酶切位点(加框序列)。3. 酶切
将含有克隆出的融合基因GWase ·. polyEQKLISEEDL全长序列的质粒载体用及 BstE II 双酶切，切下融合基因 ffiflase: polyEQKLISEEDL。4.连接
将切下的基因连入已经用分el RBstE II酶切好的经过改造的含有35S启动子的基因 质粒PCAMBIA2301植物表达载体大片段中，筛选检测转化的大肠杆菌阳性克隆。实施例2 获得含融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL的农杆菌及转基因拟南芥 植株的获得
该实施例的转化过程如下所述，该步骤的结果是获得带有目的基因的转基因拟南芥植株。1.含目的基因(融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL)表达载体的农杆菌菌株的获
得
在成功地构建了含ffiflase:polyEQKLISEEDL融合基因的植物表达载体 p2301-GL0ase-polyEQKLISEEDL 的基础上，通过冻融法将 p2301_GL0ase-polyEQKLISEEDL 导入农杆菌(如EHA105)中，利用农杆菌介导法技术转化模式植物拟南芥。2.转基因拟南芥植株的获得
1)拟南芥种子灭菌后播于1/2MS培养基上，约30天左右长出含若干花苞的植株；
2)取用甘油保存于_20°C的农杆菌50-100μ 1于2 ml的LB液体培养基中(酵母粉5g; 蛋白胨10g;NaCl 10g; PH 7.0 ；总体积1升。需要高压灭菌)，并加入相应的抗生素[如 利福平50 ppm;链霉素25 ppm ；卡那霉素100 ppm]，在摇床上以250rpm左右、25°C摇菌 24-36小时至OD600=L 0。再取新摇菌100-200 μ 1于30ml的LB液体培养基中，并加入相应 的抗生素(浓度、条件同上)，经12小时左右，菌液达到OD6tltl=L 5-2. 0时，即可用来转化；
3)室温下4000g离心IOmin；
4)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，倒置盆栽拟南芥将其花苞浸泡5秒钟；
5)在无菌滤纸上吸干菌液；将拟南芥平放于一个密封的暗室保持湿度过夜；
6)第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长。实施例3基因ffiflase在转基因拟南芥中的检测
5本实验用于检测转基因植株中的融合基因。1.样品处理
非转基因的拟南芥及转基因的拟南芥，按常规操作取叶片，-20° C保存备用。2.检测方法
基因组DNA的快速抽提将保存的叶片按照改良的CTAB法进行总DNA的抽提。用Gul0_F，Gul0_I^t为引物，经过PCR检测上述拟南芥叶片总DNA中基因ffiflase。如2图所示，除19号为阴性外，其余全为阳性，共获得20个独立的转基因拟南芥 株系，融合基因GLOase: polyEQKLISEEDL成功整合到拟南芥基因组中。实施例4 融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL在转基因拟南芥植株中的表达检 测
本实验用于转基因植株中的小鼠古洛糖酸内酯氧化酶蛋白的表达检测。1.蛋白的提取
取50 mg转基因拟南芥莲座叶叶片，加入5% SDS(w/v)，稍加研磨后沸水浴5 min, 13， 000 rpm，4° C离心10 min ；取上清，备用。2. SDS-PAGE 分离蛋白质
SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)
1)加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2X加样缓冲液甘油2. 4g, IM Tris-HCl ρΗ6· 8 lml;溴酚兰 0. 01%, H20 定容至 20ml )，煮沸 5 分钟；
2)室温，100V电压下电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶底部。3.蛋白质向硝酸纤维膜上转移.
1)转移之前，用转移缓冲液(39mmol甘氨酸，48 mmol Tris Base,0. 037% SDS, 20% 甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；
2)室温下用半干式电转仪转移1小时，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。4.硝酸纤维膜上蛋白质的检测
1)将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37°C缓慢摇动、封闭60分钟(封闭液取5g脱脂奶 粉溶于100ml IXPBS (含0. 5g叠氮钠))；
2)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37°C洗涤两次，每次15分钟；
3)加入第一抗体(鼠抗MYC的抗体)，37°C温育30分钟；同步骤2)，洗涤三次；
4)加入第二抗体(碱性磷酸酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白)，37°C温育30分钟；
5)同步骤2)，洗涤两次；
6)加入底物显色观察到融合蛋白GLOase:polyEQKLISEEDL的特异条带。随机挑选的转基因植株中，2、3、9、10、11、12、13、15、16、20、21号得到了不同丰度 的表达。说明融合蛋白GLOase: polyEQKLISEEDL成功得到了表达，且为独立转化事件。实施例5 表达融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL转基因拟南芥的抗盐胁迫性 能测定
本实验用于转基因植株的抗盐胁迫性能的测定。1.子叶期抗盐胁迫性能测定
1)分别萌发拟南芥种子于含 0mmol/L，50mmol/L，1 OOmmo 1/L, 150mmol/L, 200mmol/L NaCl的1/2MS培养基中。每个盐浓度在同一培养基上划分区域分别培养转基因拟南芥及非转基因拟南芥。2)萌发8d以后每株系每浓度随机挑选6棵拟南芥拍照并用精确到0. 5mm钢尺测 量根部长度；
3)萌发14d以后每株系每浓度随机挑选6棵拟南芥拍照纪录其根部侧根发育情况。2.幼苗期抗盐胁迫性能测定
1)1/2MS培养基中萌发的转基因拟南芥和非转基因拟南芥移栽到土壤中并正常灌溉2 周后，用 0mmol/L，50mmol/L，100mmol/L，150mmol/L，200mmol/L NaCl 水溶液每 4 天灌溉一 次，处理2周后拍照；
2)上述处理的拟南芥测定丙二醛含量参照《植物生理生化实验原理和技术》(李合生， 2000)。取单位重量拟南芥叶片，加入4倍体积0. 25%硫代巴比妥酸(溶于10%三氯乙酸) 溶液后充分研磨，于95 ！水浴加热30分钟，冰浴快速冷却，12，000 rpm离心10 min，取上 清液测定0D532，0D600，0D450。按照下列公式计算MDA浓度，并换算成单位鲜重叶片的MDA含量。MDA (ymol/L) =6. 45 (OD532 - OD600) - 0. 56 OD450 子叶期抗盐胁迫能力
拟南芥种子分别在含0 mmol/L，50 mmol/L, 100 mmol/L, 150 mmol/L,200 mmol/L NaCl 的1/2 MS培养基中萌发8 d后，表达融合基因ffiftase: polyEQKLISEEDL的拟南芥株系平均 根长长于WT和CK ；WT与CK根长未达到显著水平。在50 mmol/L NaCl浓度下，表达融合基 因ffiflase: polyEQKLISEEDL的拟南芥株系的平均根长显著高于WT G°<0. 05)。150 mmol/ L NaCl浓度下，四种基因型拟南芥根长趋于一致，表明该浓度超出了转基因拟南芥可调节 的范围。在200 mmol/L NaCl的1/2 MS培养基上，4种基因型拟南芥均发黄死亡，表明200 mmol/L NaCl为拟南芥萌发的致死盐浓度。在萌发14 d时，侧根生长形态出现明显差异。 WT、CK拟南芥侧根数量、长度明显低于gul0-12，gul0-21。综上说明表达古洛糖酸内酯氧化 酶能够提高拟南芥子叶期对盐胁迫的耐受性。幼苗期抗盐胁迫能力
各个NaCl浓度浇灌下，维生素C含量更高的gulo-21组叶片生长状态优于gulo-12组， 后者优于WT、CK，具体表现在相同盐浓度处理下高维生素C含量组叶片更绿、莲座叶叶面积 更大、枯黄坏死现象更少，丙二醛(MDA)含量更低，表明表达古洛糖酸内酯氧化酶有助于增 强拟南芥子叶期对盐胁迫的耐受性。实施例6 表达融合基因ffiflase: polyEQKLISEEDL转基因拟南芥的抗干旱胁迫 性能测定
本实验用于转基因植株的抗干旱胁迫性能的测定。1) 1/2MS培养基中萌发的转基因拟南芥和非转基因拟南芥移栽到土壤中并正常灌 溉4周后，用30%的PEG-6000水溶液分别处理0分钟，90分钟，120分钟，300分钟，600分钟。2)上述处理的拟南芥测定丙二醛含量。同实施例6. 2. 2)。30% PEG-6000模拟的干旱胁迫下，随着时间的推移，WT、CK拟南芥叶片中MDA含量 增加量大于转基因组拟南芥gulo-12和gulo-21。其中，高维生素C含量组gulo-21在各时 间点MDA含量均为最低。由此可见，表达古洛糖酸内酯氧化酶有助于增强拟南芥的耐旱性。
7
本实验选用的外源基因据报道对植物的维生素C含量提高有贡献(Nessler， 2004)，我们对转基因植株进行维生素C含量测定。结果如图9显示，野生型(WT)维生素 C含量为1. 66 μ mol/g Fff,转空质粒对照(CK)维生素C含量为1. 80 μ mol/g FW。过量表 达融合基因GLOase :polyEQKLISEEDL拟南芥株系中，最高为gulo-21，其维生素C含量达 到5. 74 μ mol/g Fff,是野生型(WT)的3. 46倍，空质粒转化对照组(CK)的3. 19倍。株系 81110-12的维生素(含量为2.52 411101/^ FW。由此可见，维生素C含量的提高与拟南芥抗 逆能力增强呈正相关。在本发明所提及到的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了上述所讲授的内容以后，本领域技术人员 可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明的权利要求书所限定的范围。
权利要求
一种适合在植物组织中高效表达小鼠古洛糖酸内酯氧化酶的融合基因，其特征在于具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，以及由SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。
2.一种在植物组织中高效表达融合基因的载体，其特征在于，该载体以5’至3’依 次包含以下元件35S启动子、小鼠古洛糖酸内酯氧化酶全长cDNA编码序列(ffife^)和 MYC (EQKLISEEDL)标签组成的融合基因 ffiflase polyEQKLISEEDL、终止子序列(Noster PolyA)。
3.—种通过在植物中表达权利要求1所述的融合基因从而实现提高植物抗逆性的方 法，其特征在于，包括如下步骤(1)将权利要求2所述的含融合基因GLOase polyEQKLISEEDL的载体利用农杆菌介导 法转化植物，获得基因组中整合有融合基因GLOase-. polyEQKLISEEDL的转基因植物；(2)所获得的转基因植物因其组织中含有表达的小鼠古洛糖酸内酯氧化酶而具有增强 抗逆能力
全文摘要
本发明属于基因工程和转基因植物技术领域，具体提供一种适合在植物组织中高效表达小鼠古洛糖酸内酯氧化酶的融合基因及载体；提供一种利用转基因植物的组织高效表达小鼠古洛糖酸内酯氧化酶的方法，还提供小鼠古洛糖酸内酯氧化酶及其编码序列在植物抗逆境胁迫能力中的应用。所述融合基因为GLOase:polyEQKLISEEDL，由小鼠古洛糖酸内酯氧化酶全长cDNA编码序列以及5个MYC标签组成；所述载体以5′至3′依次包含以下元件35S启动子、融合基因GLOase:polyEQKLISEEDL、终止子序列。本发明还涉及被所述表达载体转化的植物，以及表达小鼠古洛糖酸内酯氧化酶的转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。
文档编号C12N15/62GK101892254SQ20101022886
公开日2010年11月24日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者唐克轩, 孙小芬, 李坤岚, 郭新波 申请人:复旦大学