专利名称：纳米吸附改善酶稳定性的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高酶稳定性的方法，特别涉及一种以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法。
背景技术：
酶是由蛋白质组成，其空间结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热、强酸、 强碱、有机溶剂等均不够稳定，在反应中易失活。天然酶的不稳定性大大限制了其应用领域和应用效果，选择适宜的载体对酶进行固定化可以提高酶的稳定性。在酶固定化采用的方法中，吸附法是最简单的一种方法。它的最大优点是工艺简便、条件温和，酶分子不会被破坏，得到的固定化酶稳定性好。通过吸附作用对酶的稳定性进行改善，关键的问题是选择合适的载体。在众多载体中，纳米二氧化硅是比较常见的一种无机载体，它具有较高的表面能和生物相容性，价格低廉。此外，还有较高的机械强度有利于在生物反应器中进行工业生产。因此，在通过吸附对酶进行固定化中具有较高的应用价值。载体粒径大小、载体和酶吸附的方式直接影响固定化酶的稳定性，目前的研究结果已经证实，纳米载体优于微米载体。但是，目前采用正硅酸乙酯与Ν-(β-氨乙基)_氨丙基三乙氧基硅烷在油包水形成的微胶囊中同步水解的方法，一步法制备了氨基化的二氧化硅颗粒，以此作为载体，通过戊二醛作为交联剂，采用共价法对不同酶进行固定化。此种方法固定化时间长达几十小时，操作复杂，同时，由于交联剂的存在，不利于保持较高的酶活力，酶稳定性改善不显著。
发明内容
本发明在最大限度提高酶活保持率情况下，提供一种改善酶稳定性的方法。采用纳米SiO2作载体，调整介质的ρΗ，利用酶和纳米载体所带电荷不同，自组装形成酶-载体聚合体，从而达到提高酶稳定性的目的。本发明的目的通过如下技术方案实现纳米吸附改善胰蛋白酶稳定性的方法分别用pH4. 0-10. 0的缓冲液配制3. 3mg/ mL，10mg/mL和30mg/mL胰蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的缓冲液配制10mg/mL纳米SW2溶液。 各取IOmL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液使酶和载体质量比实现1 3，1 1和3 1三个比例，在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附池。所述胰蛋白酶是一种常用的动物蛋白酶，酶活力单位为^5U/mg，酶解最适pH7. 8，最适温度37°C。所述纳米SW2粒径分布均一，分别为 20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附ρΗ优选为7. 8，酶和载体质量比优选为1 1，载体SiO2粒径优选为20nm。本发明另一种通过纳米吸附改善木瓜蛋白酶稳定性的方法分别用pH4. 0-8. O的缓冲液配制3. 3mg/mL, 10mg/mL和30mg/mL木瓜蛋白酶溶液，再用相同ρΗ的缓冲液配制10mg/mL纳米SW2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和纳米SW2溶液使酶和载体质量比实现1 3，1 1和3 1三个比例。在室温下，用电动搅拌器搅拌吸附汕。所述木瓜蛋白酶是一种来源广泛的植物蛋白酶，酶活力单位为617U/mg，酶解最适pH6. 0，最适温度50°C。 所述纳米SW2粒径分布均一，分别为20nm、100nm、300nm。以吸附后的酶活保持率、热稳定性和酸碱稳定性为指标，吸附pH优选为6. 0，酶和载体质量比优选为1 1，载体SiO2粒径优选为20nm。本发明采用以纳米颗粒作为酶吸附载体改善酶稳定性的方法，与现有技术相比具有以下优点1.通过调整pH使纳米SW2载体和酶带有相反电荷，通过静电吸附的物理方法完成酶的固定化，避免了现有化学方法对酶分子结构的影响与破坏，使吸附后酶活性保持率较高。2.吸附时间与传统的化学交联法相比明显缩短。本方法吸附时间仅需池甚至更短，而传统的化学交联法要长达几十个小时。3.与化学交联法和微米SW2固定化酶的方法相比，本方法可以更有效提高酶稳定性。化学交联法对木瓜蛋白酶固定化后，80°C时固定化酶活力较游离酶提高了 53%，常规微米SiO2吸附后提高了 25%，而本发明采用的方法提高了 82%。4.本发明的方法操作简单，酶稳定性改善显著，易于推广，具有较高的经济效益。
具体实施例方式为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。实施例1分别用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液混合使酶和载体质量比为1 1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附池。经检测，吸附后酶活保持率为61 %。在pH7. 8的条件下，吸附在20nmSiA载体的胰蛋白酶在80°C时酶活力较游离酶提高了 88%;在温度为37°C、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了 78%。实施例2分别用0. lmol/L pH7. 8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和纳米SiO2溶液混合使酶和载体质量比例为1 1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附池。经检测，吸附后酶活保持率为56%，在pH7. 8的条件下，吸附在IOOnmSiA载体的胰蛋白酶在80°C时酶活力较游离酶提高了 72%;在温度为37°C、pH3.0的条件下，固定化酶括力较游离酶提高了 65%。实施例3分别用0. 05mol/L pH9. 0的硼砂-氢氧化钠缓冲液配制10mg/mL胰蛋白酶溶液和 10mg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL胰蛋白酶溶液和300nm SiO2溶液混合使酶和载体质量比例为1 3，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附池。
经检测，吸附后酶活保持率为47% ；在pH7. 8的条件下，吸附在300nmSiA载体的胰蛋白酶在80°C时酶活力较游离酶提高了在温度为37°C、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了 48%。实施例4分别用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 20nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和20nm SiO2溶液混合使酶和载体质量比为1 1，在室温条件下，用电动搅拌器搅拌吸附池。经检测，吸附后酶活保持率为53%，在pH6. 0的条件下，吸附在20nmSiA载体的木瓜蛋白酶在80°C时酶活力较游离酶提高了 82%;在温度为50°C、pH3.0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了 49%。实施例5分别用0. lmol/L pH5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL IOOnm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和IOOnmSiO2溶液混合使酶和载体质量比为1 1，在室温条件下，在电动搅拌器作用下搅拌吸附池。经检测，吸附后酶活保持率为42%，在pH6. 0的条件下，吸附在IOOnmSiA载体的木瓜蛋白酶在80 0C时酶活力较游离酶提高了 61 % ；在温度为50 0C、pH3. 0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了四％。实施例6分别用0. lmol/L pH6. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制10mg/mL木瓜蛋白酶溶液和lOmg/mL 300nm SiO2溶液。各取IOmL木瓜蛋白酶溶液和300nmSi02溶液混合使酶和载体质量比为1 1，在室温条件下，在电动搅拌器作用下搅拌吸附池。经检测，吸附后酶活保持率为39%，在pH6. 0的条件下，吸附在300nmSiA载体的木瓜蛋白酶在80 0C时酶活力较游离酶提高了 60 % ；在温度为50 0C、pH3. 0的条件下，固定化酶活力较游离酶提高了 25%。
权利要求
1.本发明涉及一种通过纳米颗粒作为吸附载体改善酶稳定性的方法，其特征在于选择不同粒径纳米颗粒为载体，将酶通过物理吸附作用固定在该载体上。
2.权利要求1中所提到的酶主要有两种胰蛋白酶(最适温度37°C，最适pH7.8，等电点川^，最适条件下的酶活力为观日"!^)和木瓜蛋白酶(最适温度50°C，最适pH6.0，等电点8. 75，最适条件下的酶活力为617U/mg)
3.权利要求1中所提到的纳米颗粒是二氧化硅颗粒，粒径有20nm、100nm和300nm三种。
4.权利要求1所提到改善酶稳定性的方法，具体步骤如下用不同PH的缓冲液配制一定浓度的酶溶液和纳米S^2溶液。取酶溶液和纳米S^2溶液按一定比例混合，于室温下在电动搅拌器作用下搅拌吸附一定时间。
5.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于对于胰蛋白酶，配制酶和载体缓冲溶液的PH范围在4. 0-10. 0 ；对于木瓜蛋白酶，配制酶和载体缓冲溶液的pH范围在4. 0-8. 0。
6.根据权利要求4中所述的方法，其特征在于纳米SiO2溶液的浓度10mg/mL；酶溶液的浓度为3. 3mg/mL，10mg/mL和30mg/mL，使酶和载体的质量比实现1 3，1 1和3 1 三个比例。
7.权利根据权利要求4中所述的方法，其特征在于纳米S^2和酶的吸附时间是池。
8.根据权利要求5中所述的方法，其特征在于pH在4.0-8. 0的缓冲液是0. lmol/L的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；PH范围在8. 1-8. 9的缓冲液是0. 05mol/L的Tris-盐酸缓冲液；PH范围在9. 0-10. 0的缓冲液是0. 05mol/L的硼砂-氢氧化钠缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种通过纳米颗粒作为吸附载体提高酶稳定性的方法，该方法采用不同纳米粒径的SiO2作载体，选用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶为模型酶，分别在pH4.0-10.0和pH4.0-8.0范围内，使载体-酶质量比实现3∶1，1∶1和1∶3三个不同的比例，室温下搅拌3h，使二者通过静电作用相互吸附。本方法可以大大提高酶稳定性，以20nmSiO2为载体的胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，在80℃时酶活力较天然酶分别提高了88％和82％，同时，本发明的方法操作简单，条件温和，酶稳定性改善显著，易于推广，具有较高的经济效益。
文档编号C12N11/14GK102344918SQ201010245800
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月5日 优先权日2010年8月5日
发明者于国萍, 姜毓君, 徐红华, 李丽 申请人:东北农业大学