专利名称：一种坏死梭杆菌的基因检测分型方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明提供一种坏死梭杆菌的基因检测分型方法及试剂盒。根据坏死梭杆菌白细 胞毒素启动子区序列设计3条引物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法和试剂盒，达到 特异、灵敏和快速对坏死梭杆菌进行检测分型，并能够快速诊断坏死梭杆菌引起的腐蹄病、 肝脓肿等，属于医疗诊断技术领域。
背景技术：
坏死梭杆菌(/^soAacieriWB necrophorum,简称Fn)是一种严格厌氧的革兰氏阴 性多形态杆菌(长丝到短杆状)，它广泛存在于动物和人的口腔、胃肠道及泌尿生殖道中， 是一种条件致病菌。通过DNA-DNA同源性分析，坏死梭杆菌被分为两个生物亚型-.F. necrophorum subsp. Necrophorum (简禾尔 Fnn)禾口 F. necrophorum subsp. Funduliforme (简禾尔 Fnf), 前者主要感染家畜；后者对动物的致病力较低，主要引起人类发病。尽管坏死梭杆菌的两个 生物亚型均能引起疾病，但是Frm更经常从坏死病灶中分离到，通常认为Frm比Fnf具有更 强的致病性[2]。这两个亚种主要在菌体形态、菌落特征、肉汤培养基中的生长模式、红细胞 凝集作用、溶血活性、白细胞毒素活性、LPS的化学组成以及对小鼠的致病力等方面存在差
已坏死梭杆菌的常规鉴定方法主要是菌体形态、菌落特征、生化试验、耐药性试验、 血清学试验和酶特性试验等。由于坏死梭杆菌是严格厌氧菌，培养条件相当苛刻，必须在严 格无氧的条件下才能生长，而且同一分离菌株在不同代次甚至不同培养管间呈现出不同的 形态，因此从菌体形态上很难对其进行初步鉴别；另外对坏死梭杆菌的分离纯化也相对困 难，需要在加有抗生素(坏死梭杆菌不敏感)血琼脂平板中才可能进行纯化，否则大量杂菌 的生长会抑制坏死梭杆菌的生长，从而导致使用常规的鉴定方法耗时、费力、误诊率高，很 难对坏死杆菌病做出及时准确的诊断。研究发现坏死梭杆菌两个亚种白细胞毒素(Ikt)操纵子的启动子区存在差异，且 每个亚种Ikt启动子区高度保守，因此可以使用这个独特的启动子序列来鉴别坏死梭杆菌 两个亚种。
发明内容
本发明的目的在于提供一种坏死梭杆菌快速检测分型的方法，通过聚合酶链式反 应(PCR)检测生物样本中的坏死梭杆菌。本发明还提供了利用上述方法制备的试剂盒，用于快速检测坏死梭杆菌。本发明的技术解决方案如下
根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条特异性引物，两个亚种FNN和FNF 分别扩增出1076 bp和809 bp的特异性片段，其中Pl和P2分别位于坏死梭杆菌FNN亚种 和FNF亚种白细胞毒素启动子区，P3为下游公共引物。
引物如下
Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3 P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 P35-GCACGACAAACCAAATAGC-3
本发明所述坏死梭杆菌的基因检测分型方法，它的检测步骤如下 1、采集并初步处理待检样品。2、从待检样品中抽提DNA。3、使用上述特异性引物按照优化好的条件进行PCR扩增。4、对步骤3中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带。5、对电泳结果进行分析，确定样品中是否有坏死梭杆菌以及是坏死梭杆菌的哪个 亚种感染。所述的坏死梭杆菌检测分型方法，进一步阐述此检测方法的详细步骤如下
1、样品采集将怀疑患有腐蹄病的牛羊蹄部用清水刷洗干净，使用削蹄刀刮除蹄部腐 烂创口的表面坏死组织，用高压灭菌后的棉拭子沾取病健结合处的组织或脓汁，将拭子放 入灭菌的冻存管中，低温冷藏保存备用。2、DNA模板的抽提将采回来的病料使用200 μ L IXTE悬浮，自然沉淀5 min, 2000 rpm/min 离心 3 min, 4000 rpm/min 离心 1 min ；吸取上清至另一灭菌 EP 管，12000 rpm/min离心5 min，弃上清；加200 μ L 1 X TE重悬沉淀，12000 rpm/min离心5 min，弃上 清，洗三次；沉淀加200 μ L IXTE重悬，加100 μ L新鲜配制的裂解液(0. 1 mol/L NaOH, 2 mol/L NaCl，0. 5%SDS)，沸水浴20 min进行裂解；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1) 混合液，充分混勻，12000 rpm/min离心5 min,吸取上层液体置另一灭菌EP管中，避免吸 入变性蛋白及酚层，约200 μ L ；加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，充分混勻，12000 rpm/ min离心5 min，吸取上层液体置另一灭菌EP管中；加等体积异戊醇，颠倒混勻，室温静置30 min,4 "C, 12000 rpm/min 离心 15 min ；弃上清，加入 500 μ L 75% 冰乙醇洗涤，4°C，12000 rpm/min离心10 min ；弃乙醇，通风橱中干燥20 min ；加20 μ L灭菌双蒸水溶解，_20°C保 存备用。3、聚合酶链式反应
25 μ L的PCR反应体系dNTP混合物0. 2 0. 25 mM，引物0. 3 0. 4 mM，MgS04溶液2 2. 5 mM, Taq聚合酶1 U。PCR反应程序95°C 10 min ；94°C 1 min, 56°C 50 s，72°C 1 min，30个循环；72°C 延伸10 min。4、琼脂糖凝胶电泳
对3中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。量取电泳缓冲液IXTAE(50XTAE的配置方 法242 g Tris,57. 1 mL 冰乙酸，37.2 g EDTA，用蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH8. 6) 100 mL, 电子天平调零后称取琼脂糖1 g，加入IXTAE后，混勻，在微波炉中加热溶解，倒板，胶凝固 后点样，根据点样孔体积自行确定点样量(不少于5 μ L)，电泳仪电压设定100 V, 40 min, 结束，紫外仪下查看结果。5、结果判定
坏死梭杆菌分为两个亚种FNN和FNF，通过本方法FNN亚种扩增出1076 bp特异性片段，FNF亚种扩增出809 bp特异性片段。根据本发明方法制成的坏死梭杆菌检测试剂盒，由DNA提取液、PCR反应液、标准 阳性模板、坏死梭杆菌基因特异性引物对和阴性质控标准品构成；
引物如下
Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3 P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 P35-GCACGACAAACCAAATAGC-3
标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守基因 的1 076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUClS-Τ重组载体或其他重组载体。PCR 反应液由上述 3 条引物 Pl、P2、P3，10 X PCR Buffer (含 Mg2+)，dNTP 混合物 及无菌双蒸水组成。坏死梭杆菌标准阳性模板所包含的Frm型和Fnf型白细胞毒素启动子区的核苷酸 序列见 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2。所述的坏死梭杆菌检测分型详细步骤，对此方法进行评价。1、灵敏性验证
扩增结果表明，使用该试剂盒对坏死梭杆菌两个亚种的检测灵敏度均达到10-2 μ g/ mL。能够检测坏死梭杆菌基因组DNA的最小浓度为10 pg/yL。见图1、图2。2、特异性验证
根据扩增结果表明，建立的方法具有较好的特异性。对坏死梭杆菌的Frm和Fnf的两 个亚种无论是亚种混合感染，还是在一个亚种单独感染均能够进行正确的检测；对感染症 状相关菌种，比如节瘤拟杆菌、变形杆菌、魏氏梭菌等均能进行特异性的区分，而且还能区 分出坏死梭杆菌的两个亚种。见图3。3、重复性验证
根据扩增结果表明，建立的方法在不同次数，不同的PCR仪上能够得出相同的结果。反 应体系具有优良的重复性。见图4 4、序列测定及分析结果
经PCR鉴定正确的重组质粒送宝上海英骏有限公司进行序列测定，测定结果与下载的 基因序列完全一致，结果如下SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2。本发明的积极效果在于根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条引 物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法，制成的试剂盒具有检测速度快，特异性好，灵 敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以快速的对坏死梭杆菌进行检测分型。
图1为菌Frm敏感性验证电泳图； 图2为菌Fnf敏感性验证电泳图。注M为 DL2000 ； 1 为 1 μ g/mL 的模板 DNA ；2 为 ICT1 μ g/mL 的模板 DNA ;3 为 1(Γ2 μ g/mL 的模板 DNA ；4 为 10_3 μ g/mL 的模板 DNA ；
图3为双重体系特异性验证电泳注M为DL2000 ；1为Fnn和Fnf在同一体系中PCR结果；2为Fnn菌株5 ;3为Fnn菌株AB ;4为Fnf菌株B ；5为节瘤拟杆菌D型；6为节瘤拟杆菌E型；7为节瘤拟杆菌H型；8 为变形杆菌；9为牛型魏氏梭菌；10为羊型魏氏梭菌； 图4为双重体系重复性验证；
注M为DL2000 ；1-7分别为不同次数在不同PCR仪上反应的结果； 图5为坏死梭杆菌临床阳性样本检测结果；
注M为DL2000 ；1-15为检测为坏死梭杆菌阳性的临床样本；16为阳性对照；17为阴性对照。
具体实施例方式通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离 本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改 动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。实施例1 1样品采集
将怀疑患有腐蹄病的牛羊蹄部用清水刷洗干净，使用削蹄刀刮除蹄部腐烂创口的表面 坏死组织，用高压灭菌后拭子沾取病健结合处的组织及部分脓汁，将拭子放入灭菌的冻存 管中，低温冷藏保存备用。共计从吉林省、黑龙江省、河北省、天津市采集疑似坏死杆菌病的 病样36份。2 DNA模板的抽提
将采回来的病料使用200 yL IXTE悬浮，自然沉淀5 min,2000 rpm/min离心3 min， 4000 rpm/min离心1 min ；吸取上清至另一灭菌EP管，12000 rpm/min离心5 min，弃上清; 加200 μ L IXTE重悬沉淀，12000 rpm/min离心5 min，弃上清，洗三次；沉淀加200 μ L IXTE 重悬，加 100 μ L 新鲜配制的裂解液(0.1 mol/L NaOH，2 mol/L NaCl，0. 5%SDS)，沸 水浴20 min进行裂解；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)混合液，充分混勻，12000 rpm/min离心5 min，吸取上层液体置另一灭菌EP管中，避免吸入变性蛋白及酚层，约200 μ L ；加等体积的氯仿/异戊醇(24/1)，充分混勻，12000 rpm/min离心5 min,吸取上层液 体置另一灭菌EP管中；加等体积异戊醇，颠倒混勻，室温静置30 min,4 °C, 12000 rpm/min 离心15 min ；弃上清，加入500 μ L 75%冰乙醇洗涤，4°C，12000 rpm/min离心10 min ；弃 乙醇，通风橱中干燥20 min;加20 μ L灭菌双蒸水溶解，_20°C保存备用。3聚合酶链式反应
25 μ L的PCR反应体系dNTP混合物0. 2 0. 25 mM，引物0. 3 0. 4 mM,MgS04溶液2 2. 5 mM, Taq 聚合酶 1 U。PCR 反应程序95°C 10 min ；94°C 1 min, 56°C 50 s，72°C 1 min, 30 个循环；72°C延伸10 min。4琼脂糖凝胶电泳
对3步中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。量取电泳缓冲液1 X TAE (50 X TAE的配置 方法242 g Tris, 57. 1 mL 冰乙酸，37. 2 g EDTA，用蒸馏水定容至 1000 mL，调 pH8. 6) 100 mL,电子天平调零后称取琼脂糖1 g，加入1 XTAE后，混勻，在微波炉中加热溶解，倒板，胶 凝固后点样，根据点样孔体积自行确定点样量(不少于5 μ L)，电泳仪电压设定100 V,40 min，结束，紫外仪下查看结果。
5结果判定
坏死梭杆菌分为两个亚种FNN和FNF，通过本方法两个亚种分别扩增出1 076 bp和809 bp的特异性片段。本次试验共计对36份坏死梭杆菌病病样进行检测，共通过检测发现共有 15份样品为坏死梭杆菌检测阳性，其中有2个为Fnf型，其余均13个为Frm型。如图5。实施例2坏死梭杆菌检测分型方法的试剂盒
试剂盒由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、坏死梭杆菌基因特异性引物对和阴 性质控标准品构成； 引物为
Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3 P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 P35-GCACGACAAACCAAATAGC-3
标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守基因 的1 076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUClS-Τ重组载体或其他重组载体。PCR 反应液由上述 3 条引物 Pl、P2、P3，10 X PCR Buffer (含 Mg2+)，dNTP 混合物 及无菌双蒸水组成。是坏死梭杆菌标准阳性模板所包含的Frm型和Fnf型白细胞毒素启动子区的核苷 酸序列见 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2。进行PCR扩增所有的条件指标即特异性引物0. 3 0. 4 mM，怀疑发病病料中提 取的DNA模板1 2ug，4种三磷酸腺苷混合物20 mM,50ul体系taq聚合酶1. 5 2 U， 25ul体系taq聚合酶1 U，MgS042 2. 5 mM, IOX (NH4)2SO4的反应缓冲液2 5ul。PCR扩 增 95°C 10 min ；94°C 1 min，56°C 50 秒，72°C 1 min, 30 个循环；72°C延伸 10 min。试剂盒的制备方法，包括以下步骤
1)DNA 提取液包括如下组分PBS (137mM Nacl, 2. 7 mM Kcl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, PH7. 4) , 10ΧΤΕ (0· 1 M Tris-HCl，0· 1 M EDTA, ρΗ 8.0)；
2)PCR反应液由3条引物Pl、P2、P3，10XPCRBuffer (含Mg2+)，dNTP混合物及无菌 双蒸水组成；
3)标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守 基因的1 076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUClS-Τ重组载体或其他重组载体；
4)坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区基因特异性引物序列 Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3
P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3 P35-GCACGACAAACCAAATAGC-3
5)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
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权利要求
一种坏死梭杆菌快速检测分型的方法，根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条特异性引物，两个亚种FNN和FNF分别扩增出1076 bp和809 bp的特异性片段，其中P1和P2分别位于坏死梭杆菌FNN亚种和FNF亚种白细胞毒素启动子区，P3为下游公共引物；引物如下P1:5 GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC 3P2:5 GATCTTTGTTGGAAGCGAGT 3P3:5 GCACGACAAACCAAATAGC 3具体步骤如下1)采集并初步处理待检样品；2)从样品中抽提DNA；3)使用上述特异性引物进行PCR扩增；4)对步骤(3)中的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的条带；5)对电泳结果进行分析，确定样品中是否有坏死梭杆菌以及是坏死梭杆菌的哪个亚种感染。
2.实现权利要求1所述坏死梭杆菌检测分型方法的试剂盒，其特征在于由DNA提取液、PCR反应液、标准阳性模板、坏死梭杆菌基因特异性引物对和阴性质控 标准品；Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3P35-GCACGACAAACCAAATAGC-3标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守基因 的1 076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUClS-Τ重组载体或其他重组载体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是PCR反应液由上述3条引物Pl、P2、P3，10 X PCR Buffer (含Mg2+)，dNTP混合物及无 菌双蒸水组成。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是坏死梭杆菌标准阳性模板所包含的Frm型 和Fnf型白细胞毒素启动子区的核苷酸序列见SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2。
5.权利要求1所述的试剂盒的制备方法，包括以下步骤1)DNA提取液包括如下组分PBS (137mM Nacl, 2. 7 mM Kcl, 10 mM Na2HP04, 2 mM KH2P04, PH7. 4) , 10ΧΤΕ (0· 1 M Tris-HCl，0· 1 M EDTA, ρΗ 8.0)；2)PCR反应液由3条引物Pl、P2、P3，10XPCRBuffer (含Mg2+)，dNTP混合物及无菌 双蒸水组成；3)标准阳性模板含有坏死梭杆菌两个亚种FNN和FNF白细胞毒素启动子区高度保守 基因的1076个和809个碱基的核苷酸片段构成的pUClS-Τ重组载体或其他重组载体；4)坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区基因特异性引物序列 Pl5-GCTCTCCTGCTTGTTTATTTC-3P25-GATCTTTGTTGGAAGCGAGT-3P35-GCACGACAAACCAAATAGC-35)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。
全文摘要
本发明公开一种致病性坏死梭杆菌的基因检测分型方法。根据坏死梭杆菌白细胞毒素启动子区序列设计3条引物，建立了聚合酶链式反应(PCR)检测方法，制成的试剂盒具有检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用步骤简单，可重复性高，可以快速的对坏死梭杆菌进行检测分型。
文档编号C12Q1/04GK101956010SQ20101028979
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月25日 优先权日2010年9月25日
发明者冯二凯, 刘晓颖, 姚志利, 王克坚, 陈立志 申请人:陈立志