专利名称：一种生产D-α-羟基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产D-α _羟基丁酸及α _酮基丁酸的方法，具体地说，涉及利用 含NAD (烟酰胺腺嘌呤双核苷酸)非依赖性L-羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分 外消旋α-羟基丁酸生成D-α-羟基丁酸及α-酮基丁酸的方法。
背景技术：
α -羟基丁酸是合成异亮氨酸和某些药物的中间体。高纯度手性α _羟基丁酸单 体可以用来合成高聚物聚α-羟基丁酸[Ρ(2ΗΒ)]。此高聚物可生物降解，并可应用于生物 医学、制药以及环境方面1。另外，0-(1-羟基丁酸可用来制备拟1110让1^(^11家族抗癌抗
生素23。文献报道高纯度D-α-羟基丁酸的生产有两种，一是酶法还原α-酮基丁酸生成 D-α-羟基丁酸，如利用D-乳酸脱氢酶还原α-酮基丁酸为α _羟基丁酸，但此方法需要添 加昂贵的电子受体NADH，难以实现产业化规模4；二是酶法立体选择性拆分外消旋α -羟 基丁酸，如利用脂肪酶催化的立体选择性乙酰化α -羟酸生成R-α -羟酸，其对映体过量率 达99%以上，所用底物浓度在1毫摩尔/升左右5;通过乙醇酸氧化酶立体选择性氧化外消 旋α-羟酸生成R- α -羟酸和α -酮酸，随后D-乳酸脱氢酶还原α -酮酸为R- α -羟酸， 所用底物浓度不超过1毫摩尔/升6。由于外消旋α-羟基丁酸较α-酮基丁酸便宜，且 反应过程不需添加共底物，所以此途径较为可行。但上述制备方法存在D-α-羟基丁酸产 量低的问题，其应用受到限制。NAD非依赖性羟酸脱氢酶分为L-羟酸脱氢酶和D-羟酸脱氢酶，可分别催化 L- α -羟基丁酸与D- α -羟基丁酸生成α -酮基丁酸，含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的生物催 化剂可高效率催化高浓度的外消旋α-羟基丁酸生成0_酮基丁酸7。针对性的保留生物 催化剂中L-羟酸脱氢酶，失活D-羟酸脱氢酶，则可以实现外消旋α-羟基丁酸的拆分，生 成两种重要的中间体α-酮基丁酸与D-α-羟基丁酸。经检索，利用含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分外消旋 α -羟基丁酸生产D- α -羟基丁酸以及α -酮基丁酸的方法未见报道。参考文献1Tsuji, H. , Okumura, Α. , 2009. Stereocomplex formation between enantiomeric substitutedpoly(Iactide) s :blends of poly [ (S)-2-hydroxybutyrate] and poly[(R)-2-hydroxybutyrate]. Macromolecules 42,7263-7266.2Karl, J. , Jia, C. , Soraya, Μ. , Andrew, P. , 1995. Synthetic studies on the azinothricin famiIyof antibiotics. 4. enantioselective synthesis of the northern half of antitumour antibioticsA83586C and citropeptin.Tetrahedron Lett.36, 6965-6968.3Nakagawa, A. , Kato, K. , Shinmyo, A. , Suzuki , Τ. , 2007. Asymmetric hydrolysis of2-hydroxy-carboxylic esters using recombinant Escherichia coli.Tetrahedron :Asymmetryl8,2394-2398.4Simon,Ε· S. ,Plante, R. ,ffhitesides,G. Μ. , 1989. D-Iactate dehydrogenase. Substratespecificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids. App1. Biochem. Biotechnol. 22,169-179.5Adam, W. , Lazarus, Μ. , Schmerder, A. , Humpf, H-U. , Saha- Moller, C. R., Schreier, P.,1998.Synthesis of optically active α -hydroxy acids by kinetic resolution through lipase-catalyzedenantioselective acetylation. Eur. J. Org. Chem. 9,2013-2018.6Adam, W. , Lazarus, Μ. , Saha-Moller, C. R. , Schreier, P. , 1998. Quantitative transformationof racemic 2-hydroxy acids into (R)-2-hydroxy acids by enantioselective oxidation withglycolate oxidase and subsequent reduction of 2—keto acids with D-Iactate dehydrogenase. Tetrahedron :Asymmetry 9,351-355.7Gao，C.，Zhang,W.，Lv, C. J.，Li, L. X.，Ma, C. Q.，Hu, C. H.，Xu, P. ,2010. Efficientproduction of 2-oxobutyrate from 2-hydroxybutyrate using whole cells of Pseudomonasstutzeri strain SDM. Appl. Envrion. Microbiol. 76,1679-1682.
发明内容
针对已报道制备方法中产物D-α-羟基丁酸产量和对映体过量率值低的问题，本 发明要解决的问题是利用含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的微生物完整细胞或粗酶液拆分外 消旋α-羟基丁酸生产D-α-羟基丁酸。本发明方法具有底物利用率高、产物浓度高、光学 纯度高以及后提取简便等优点。本发明的生产D-α-羟基丁酸的方法，其步骤如下(1)微生物完整细胞或粗酶液的制备选取含NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力的假 单胞菌，常规培养，期间以高效液相色谱(HPLC)法检测细胞NAD非依赖性羟酸脱氢酶活力， 至其活力达到120 200单位/升时，终止发酵培养；分离并收集菌体，用pH 7. 2 7. 5磷 酸钾缓冲液洗涤菌体2 4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升， 得到含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液，或者将完整细胞悬液用超声波破碎得粗 酶液，4°C储存备用；其中在上述步骤中，NAD非依赖性羟酸脱氢酶酶活单位U定义为37°C，每分钟催 化底物α“羟基丁酸钠转化生成1微摩尔α“酮基丁酸钠所需的酶量；(2)热变性使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活取步骤⑴制得的含NAD非依赖 性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45 65°C水浴中处理5 50分钟，得到仅含 有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂，4°C储存，备用；(3)拆分外消旋α “羟基丁酸以浓度为5 120克湿细胞/升的步骤(2)所述生 物催化剂与浓度为100 800毫摩尔/升外消旋α -羟基丁酸钠水溶液混合；在5 40°C， pH 5. 0 10. 0条件下，以50 180转/分钟振荡5 30小时，使底物外消旋α -羟基丁 酸钠、生物催化剂与氧气充分混合，得含D-α -羟基丁酸钠以及α -酮基丁酸钠的转化液； HPLC法检测D- α -羟基丁酸钠的浓度，计算对映体过量率；其中在上述步骤中，对映体过量率的计算公式为
权利要求
一种生产D α 羟基丁酸的方法，步骤包括(1)以假单胞菌制备含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或其粗酶液；(2)热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液，使NAD非依赖性D 羟酸脱氢酶失活，得到仅含有NAD非依赖性L 羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；(3)以步骤(2)制得到的生物催化剂拆分外消旋α 羟基丁酸，得含D α 羟基丁酸钠和α 酮基丁酸钠的转化液；(4)转化液预处理；(5)预处理后的转化液酸化；(6)D α 羟基丁酸和α 酮基丁酸的分离；(7)D α 羟基丁酸精制；其特征在于步骤(1)所述假单胞菌选恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)ATCC 12633、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC 10145或施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)ATCC17588；步骤(2)所述热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液的方法是取步骤(1)制得的含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或粗酶液置于45～65℃水浴中处理5～50分钟，得到仅含有NAD非依赖性L 羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；步骤(3)所述生物催化剂拆分外消旋α 羟基丁酸的方法是以浓度为5～120克湿细胞/升的生物催化剂与浓度为100～800毫摩尔/升外消旋α 羟基丁酸钠水溶液混合，在5～40℃，pH 5.0～10.0条件下，以50～180转/分钟振荡5～30小时；步骤(6)所述D α 羟基丁酸和α 酮基丁酸的分离的方法是将阴离子交换树脂D301树脂、330树脂、D345树脂或335树脂按通用方式处理成氯型，装入玻璃层析柱，然后将步骤(5)所述酸化后的转化液以0.5～3柱体积/小时的流速上样，收集流出的含D α 羟基丁酸的液体至上样结束，得收集液A；上样结束后再以0.5～3柱体积/小时的流速用去离子水淋洗，收集1～4柱床体积的流出液，得收集液B；步骤(7)所述D α 羟基丁酸精制的方法是合并步骤(6)所述收集液A和B，用1摩尔/升的NaOH调节pH至7，在真空度0.075～0.095兆帕，温度45～70℃的条件下减压蒸馏浓缩，得D α 羟基丁酸钠。
2.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述热变性 步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液的热处理温度为50 60°C，热处理时间为10 30分钟。
3.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述生物催化 剂以完整细胞悬液的细胞浓度计为20 80克湿细胞/升。
4.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述外消旋 α -羟基丁酸钠的浓度为200 600毫摩尔/升。
5.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(3)所述温度为 30 37°C，所述ρΗ值为6. 5 7. 5，所述振荡转速为180转/分钟，震荡时间为14 24小 时。
6.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(6)所述阴离子交 换树脂是D301或330阴离子交换树脂。
7.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(6)所述上样流速 为0. 5 2柱体积/小时，上样体积为2 3倍柱体积，去离子水淋洗流速为1 2倍柱体 积/小时，去离子水淋洗体积为2 4倍柱体积。
8.如权利要求1所述生产D-α-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(7)所述真空度为，0. 075 0. 09兆帕，温度为55 65°C。
全文摘要
本发明公开了一种生产D-α-羟基丁酸的方法，步骤包括(1)以假单胞菌制备含NAD非依赖性羟酸脱氢酶的完整细胞悬液或其粗酶液；(2)热变性步骤(1)制备的完整细胞悬液或其粗酶液，使NAD非依赖性D-羟酸脱氢酶失活，得到仅含有NAD非依赖性L-羟酸脱氢酶活力的生物催化剂；(3)以步骤(2)制得到的生物催化剂拆分外消旋α-羟基丁酸，得含D-α-羟基丁酸钠和α-酮基丁酸钠的转化液；(4)转化液预处理；(5)预处理后的转化液酸化；(6)D-α-羟基丁酸和α-酮基丁酸的分离；(7)D-α-羟基丁酸精制。本发明具有培养基成分简单、生长周期短，成本低，后续分离提取简单，以及产物D-α-羟基丁酸对映体过量值高等特点，奠定了高效生产D-α-羟基丁酸的基础。
文档编号C12R1/40GK101974603SQ20101029733
公开日2011年2月16日 申请日期2010年9月30日 优先权日2010年9月30日
发明者张文, 许平, 马翠卿, 高超 申请人:山东大学