专利名称：特异性免疫核糖核酸的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗、预防禽类疾病的特异性免疫核糖核酸的制备及应用，属生物医药技术领域。
背景技术：
畜牧业是我国国民经济的重要组成部分。目前畜牧业产值占全国农业总产值的三分之一，已成为我国农业经济中的支柱产业，在国民经济中发挥着越来越重要的作用。而禽类传染病作为影响畜牧业健康发展的重要因素，历来受到世界各国的重视。禽类疫病一旦爆发流行，如得不到有效控制和扑灭，就会造成重大的经济损失和公共卫生安全事故，影响社会稳定。
我国家禽养殖业受疾病因素的影响每年造成的经济损失占总收入的30%以上，严重制约了养殖业的可持续性发展。我国家禽养殖业主要受到三种疾病形式的威胁①过去已被控制的重大动物传染病，至今又卷土重来并大面积流行；②由于病原体逃避机体的免疫监视而发生变异，使过去已被基本控制的重大动物传染病至今又以新的流行特点、新的发病症状在我国流行(如禽流感、鸡传染性支气管炎等)；③新出现一些过去在我国从未流行的传染病(如鸡传染性贫血病等)。这种不同疾病的流行形式，使我们顾此失彼和防不胜防。毫无疑问，随着今后大规模集约化饲养家禽的发展，家禽传染病的发生和流行的周期会越来越短，对养殖业所造成的经济损失也会越来越大。因此如何及时控制家禽传染病的流行，保证我国养殖业重上新台阶，给动物预防部门和兽医科研人员提出了新的挑战，但同时又为我们进行生物技术产品的开发提供了难得的机遇。
另一方面，由于抗生素、激素饲料的大量使用，我国禽肉、蛋产品药物残留严重，食品安全亮起红灯。目前，我国养殖企业和养殖户急需有一类能够替代抗生素施治且能够满足食品安全要求、药效强力而无害无残留的药物。采用生物技术途径生产生物制剂不失为上策。因为生物产品疗效高，且采用纯物理方法制备，使这种制剂不含任何潜在的污染成分和药物残留问题。
特异性免疫核糖核酸(immune RNA, iRNA)是动物经某种病原体的抗原免疫后，从免疫动物的免疫活性细胞(存在于动物脾脏、肝脏、淋巴等脏器)中提取出来的核糖核酸 (RNA)，具有对病原高度的特异性和针对性；它具有传递相应抗原特异性免疫信息的能力， 因而注入体内后，可发挥对该抗原的杀灭、抑制、中和等免疫清除作用。
iRNA可使末致敏感的淋巴细胞转异性，且不受动物种属的影响。iRNA的作用发生迅速，维持时间也较长，可达数月至一年以上。iRNA具有免疫特异性，能特异地转移供体的迟发型超敏反应，这种免疫转移无种属特异性，能在种间交叉转移。由于iRNA是小分子成份(分子量在13500道尔顿左右)，无抗原性，长期应用，机体也不产生抗体。
免疫核糖核酸制剂已经在治疗人类疾病方面得到过应用，如乙肝、肿瘤、狂犬病等 (杨琳等，抗狂犬病免疫核糖核酸的分离纯化，中华微生物学和免疫学，2010年第30卷第2 期)。经检索，未见现有技术中有关治疗禽类疾病的特异性免疫核糖核酸相关的文献报道。发明内容
根据现有技术状况，本发明目的在于提供一种无毒副作用、原料易得、成本低廉且适合于工业化生产的能够用于治疗、预防禽类疾病的特异性免疫核糖核酸的制备；另一目的在于提供一种原料易得、成本低廉、适用于工业化生产的特异性免疫核糖核酸的应用技术。
本发明的技术实施方案如下
1、免疫原(疫苗)的制备用国家标准病原体毒株接种易感鸡胚胎，收获感染胚液，经提纯、浓缩、灭活，加MAC进口佐剂乳化而成制得免疫原(疫苗)，然后按程序单一或联合免疫健康禽类。
2、禽类免疫根据不同抗原、不同禽类采用不同的免疫途径，加强免疫后抽血检测抗体效价。此处的禽类除来源广泛的鸡、鸭外，还包括鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鸵鸟、孔雀等野生或饲养的禽鸟类。
现以养殖量和屠宰量最大的鸡为例。
用制备的上述鸡传染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康鸡群，皮下多点注射，每鸡1 5ml ；在首次免疫后的第7 20天进行强化免疫，肌肉注射每鸡1. 5 3ml ；在强化免疫后的第7 20天进行再强化免疫，肌肉注射每鸡1. 5 :3ml。
3、特异性免疫核糖核酸的制备免疫动物屠宰后，取脾脏、肝脏等，然后由脏器中制备特异性免疫核糖核酸。
1)粗提脾脏、肝脏、胰脏或淋巴结等脏器去掉结缔组织及被膜，用生理盐水洗净、切碎，洗去血液并挤干。每200g组织加100 300ml盐水，置高速组织捣碎机中制成勻浆；向上述勻浆中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振荡30min并置冰浴冷却，离心，取上清液置冰浴中。
2)精制在上清中加入一半量的苯酚溶液，室温下剧烈振荡，离心，取水相；加2 3倍体积90% 95 %酒精，置冰箱8h，离心，弃上清，沉淀物即为要制备的特异性免疫核糖核酸。
4、检测取上述沉淀，进行理化、活性检测。
1)ρΗ值取沉淀溶于IOml蒸馏水中，其pH值应为6. 8 8. 0。
2)吸收度用紫外分光光度计检测，其0拟60/0D280应不小于2. 0。
3)DNA含量测定用标准DNA作对照，以紫外法测定，DNA含量不大于5%。
4)RNA含量测定按《中国药典》二部附录法测定，含量应在0.95mg以上。
5)分子量测定以核糖核酸酶A(相对分子质量13700)、胰岛素(5808)、胸腺肽 al (3108)、生长激素释放因子(1521)作相对分子质量标准，制作标准曲线，采用高效液相色谱法测定。
6)异常毒性以注射用生理盐水制成0. 5mg/ml溶液，家兔可静脉注射，应无异常反应。
7)无菌检查溶于6ml无菌水中，分别接种于普通培养基，厌氧培养基及霉菌培养基，培养1周，应无菌生长。
8)活性测定采用白细胞粘附抑制试验。其原理为正常白细胞在体外培养时，可粘附于玻璃表面，而用iRNA处理过的白细胞，其粘附于玻璃表面的能力则被抑制，测知该粘附抑制率，即知iRNA活性。方法为取绵羊抗凝血，分离白细胞，将白细胞调节为在血细胞计数板上每大格内含40 80个细胞的浓度。取细胞悬液，加等体积iRNA溶液，37°C水浴后，移入血细胞计数板，置37°C温育后，用生理盐水冲洗、计数。同时作正常白细胞(不加 iRNA)对照。计算白细胞粘附抑制率，如大于20%为合格。
将采用本发明制得的特异性免疫核糖核酸进行临床试验，方法及结果如下
以鸡传染性新城疫病为例。
已被确诊患新城疫病的817肉食鸡，以死亡、体重减轻、检出病毒或检出抗体为判定标准，将其分为治愈、有效、无效三个等级进行统计，用制备的抗新城疫的特异性免疫核糖核酸进行紧急预防与治疗实验，预防用量为每鸡肌注0. 5ml，治疗肌注1ml。结果如下表
表1紧急预防与治疗效果统计
权利要求
1.特异性免疫核糖核酸的制备及应用，其特征在于(1)、免疫原(疫苗)的制备用国家标准病原体毒株接种易感鸡胚胎，收获感染胚液，经提纯、浓缩、灭活，加MAC进口佐剂乳化而成制得免疫原(疫苗)，然后按程序单一或联合免疫健康禽类；用鸡传染性新城疫(副粘病毒)疫苗免疫健康鸡群，皮下多点注射，每鸡1 5ml ；在首次免疫后的第7 20天进行强化免疫，肌肉注射每鸡1. 5 3ml ；在强化免疫后的第7 20天进行再强化免疫，肌肉注射每鸡1. 5 3ml ； (2)、特异性免疫核糖核酸的制备将上述经免疫的鸡养7 10天后屠宰，取脾脏、肝脏、胰脏或淋巴结等脏器去掉结缔组织及被膜，用生理盐水洗净、切碎，洗去血液并挤干；每200g组织加100 300ml盐水，置高速组织捣碎机中制成勻浆；向上述勻浆中加入苯酚溶液及0. SDS，混勻，置30 70°C水浴振荡30min并置冰浴冷却，离心，取上清液置冰浴中；在上清中加入一半量的苯酚溶液，室温下剧烈振荡，离心，取水相； 加2 3倍体积90% 95%酒精，置冰箱8小时，离心，弃上清，沉淀物即为要制备的特异性免疫核糖核酸。
2.根据权利要求1所述的特异性免疫核糖核酸，其特征在于采用权利要求1所述的方法制备而得。
3.根据权利要求1所述的特异性免疫核糖核酸的应用，其特征在于由于特异性免疫核糖核酸无种属特异性，因而制备时可以使用成本低廉、饲养量和屠宰量较大的肉食鸡作为特异性免疫核糖核酸的来源，而用于治疗鸡本身及鸭、鹅、鸽、鹌鹑、火鸡、雉鸡、鸵鸟、孔雀等野生或饲养的禽鸟类的各种疾病。
全文摘要
本发明公开了一种特异性免疫核糖核酸(iRNA)的制备及应用，属生物医药技术领域。该方法用国家标准病原体毒株接种易感鸡胚胎而制得免疫原(疫苗)，然后按程序单一或联合免疫健康禽类，收集其健康的脾脏、肝脏等脏器，经过粗提、精制，即由脏器中获取针对禽类各种疾病的特异性免疫核糖核酸。本发明制备的特异性免疫核糖核酸使用后具有疗效显著、作用迅速、无毒副作用的特点，容易保存，便于运输，生产工艺简单，适合于工业化生产。
文档编号C12N15/11GK102477425SQ20101055712
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者曹吉祥 申请人:曹吉祥