专利名称：一种植物甾醇经微生物转化为add的方法及所用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及制药领域，具体而言，本发明涉及到一种植物留醇经微生物转化为ADD 的方法及所用培养基。
背景技术：
雄甾二烯二酮(简称ADD)是一种合成甾体激素类药物的重要中间体，通过它可合成包括地塞米松、泼尼松龙、倍他米松等10余种临床上广泛使用的激素药物。ADD的化学结构式如下面式I所示。
式I
合成雄留二烯二酮目前有两种方法一是用薯蓣皂甙为起始原料，经过11步化学合成反应得到。二是由植物留醇经过微生物转化直接得到ADD。其中微生物转化具有反应条件温和，节能环保等方面优势，决定其是否具有经济性包括反应底物浓度、转化率和转化特异性，转化特异性是指在转化过程中ADD和副产物AD(雄留-4-烯-3，17-二酮)的比值，其比值越高，说明其转化特异性愈好。美国专利USP4345(^9描述了采用分枝杆菌变种 (Mycobacterium phlei)转化得到AD和ADD ；美国专利USP7259005描述了采用另一种分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)转化植物留醇得到AD和ADD，但其转化效率和特异性均不高，转化率最高仅有64%，转化后发酵液中AD和ADD的最高浓度仅有2177mg/L。从经济角度计算，上述技术指标显示其无工业价值。
如何提高由植物留醇经过微生物转化直接得到ADD的经济性成为其能否完全替代化学合成法的关键。发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供一种在植物留醇经微生物转化为ADD的方法中使用的发酵培养基。本发明还提供一种植物留醇经微生物转化为ADD的方法。
具体而言，本发明提供
(1) 一种在植物甾醇经微生物转化为ADD的方法中使用的发酵培养基，其包含有溶解或分散在水中的下列物质
葡萄糖0.l-100g/L,
黄豆粉10-100g/L，
磷酸二氢钾0.5-10g/L,
碳酸钙0.l-10g/L，
硫酸亚铁0·001-0. 01g/L,
氯化锰0.0001-0. 001g/L，以及
植物甾醇10-100g/L；
所述发酵培养基的pH为5.0-8.0 ；并且，在所述发酵培养基中不含有植物甾醇助溶剂或分散剂。
(2)根据(1)所述的发酵培养基，其包含有溶解或分散在水中的下列物质
葡萄糖25g/L，
黄豆粉40g/L，
磷酸二氢钾2g/L，
碳酸钙lg/L，
硫酸亚铁0.0051g/L,
氯化锰0.0005g/L,以及
植物甾醇50g/L；
所述发酵培养基的pH为7. 2 ；并且，在所述发酵培养基中不含有植物甾醇助溶剂或分散剂。
(3)根据⑴或⑵所述的发酵培养基，其中所述植物甾醇助溶剂或分散剂为聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
(4) 一种植物留醇经微生物转化为ADD的方法，该方法包括，在发酵培养分枝杆菌 (Mycobacterium)时使用根据(1)至(3)中任一项所述的发酵培养基。
(5)根据中所述的方法，在该方法中，在种子罐种龄达到30-50小时的时候进行接种，接种量为5-10% (ν/ν)；然后，在的温度下进行发酵，并将溶氧控制为 35-80%。
(6)根据(5)中所述的方法，在该方法中，在所述种子罐种龄达到42小时的时候进行接种，接种量为5% (ν/ν)；然后，在30°C的温度下进行发酵，并将溶氧控制为35-45%。
本发明致力于提高植物留醇通过生物转化合成雄留二烯二酮转化效率的方法。经过本发明人研究发现，提高转化效率的关键环节涉及到发酵工艺的设计。本发明人发现对发酵培养基和发酵过程包括PH、搅拌转速、通气、补料、温度等工艺参数进行优化设计，可显著提高转化效率。优化后的发酵工艺，发酵底物浓度可达到50g/L，转化率可达到70%，发酵结束后，发酵液中ADD与AD的重量比为98 2，显著高于公开报道的技术指标。
具体实施方式
以下通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本发明的发酵培养基包含有溶解或分散在水中的下列物质葡萄糖0. I-IOOg/L，优选为25g/L ；黄豆粉10-100g/L，优选为40g/L ；磷酸二氢钾0. 5-lOg/L，优选为2g/L ； 碳酸钙:0. l-10g/L，优选为lg/L ；硫酸亚铁0. 001-0. 01g/L，优选为0. 0051g/L ；氯化锰 0. 0001-0. 001g/L，优选为0. 0005g/L ；以及植物甾醇:10_100g/L，优选为50g/L ；所述发酵培养基的PH为5. 0-8. 0，优选为7. 2 ；并且，在所述发酵培养基中不含有植物留醇助溶剂或分散剂，特别是聚乙二醇、葵花油、乙二醇，更特别的是葵花油。
在本文中，黄豆粉也称为大豆粉，是把黄豆经粉碎制备而得的。在本发明中，黄豆粉优选为通过80目筛的细粉。
在本文中，植物甾醇为主要包括β-谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的混合物。其中， β -谷甾醇、豆甾醇和菜油甾醇的母核相同，其结构式分别为
在本文中，植物留醇助溶剂或分散剂是指为了增加植物留醇在发酵培养基中的溶解度或分散程度而添加的助剂，包括聚乙二醇、葵花油、乙二醇等。
本发明的植物甾醇经微生物转化为ADD的方法包括，在发酵培养分枝杆菌 (Mycobacterium)时使用本发明的发酵培养基。
优选的是，在本发明的方法中，在种子罐种龄达到30-50小时的时候进行接种，接种量为5-10% (ν/ν)；然后，在的温度下进行发酵，并将溶氧控制为35-80%。更优选的是，在所述种子罐种龄达到42小时的时候进行接种，接种量为5% (ν/ν)；然后，在 30°C的温度下进行发酵，并将溶氧控制为35-45%。
在本文中，溶氧是指发酵过程的发酵液中的氧浓度与发酵初始时发酵液中的氧浓度的百分比值(即DO值)。
本发明涉及的发酵工艺技术特征描述如下
(1)本发明改进了生物转化体系。根据现有的文献报道，植物留醇微溶于水，必须要增加其在水中的溶解度，才能提高转化效率。传统的反应体系是用双水相系统和环糊5精包埋等技术，尽管转化率达到了 80%以上，底物植物留醇加入量仅0. 1-0.8%，发酵液中 ADD产量很少，发酵单位很低，仍无法工业化生产。现有技术中，有的采用植物油如葵花油进行分散，增加底物植物留醇加入量。事实上，后期纯化很困难，因为产物ADD很容易溶解于植物油中，需要用柱层析解决。本发明开发一种生物转化体系，不在培养基中添加任何植物甾醇助溶剂或分散剂，让植物留醇悬浮于培养基中直接进行转化，在保证转化效率前提下， 又为发酵结束后产品分离纯化带来便利。
( 本发明优化了发酵培养基。对包括碳源、氮源、金属离子等营养元素进行优筛， 确定了以葡萄糖为碳源、以硝酸铵为氮源、添加钙盐、氯化镁等作为金属离子试剂，可促进植物甾醇转化为ADD。
C3)本发明优化了发酵过程中的关键工艺控制参数。对包括种龄、种量、发酵温度、 PH、溶氧、泡沫控制方法等发酵关键控制参数优化，提高了 ADD的转化效率。
由本发明得到的发酵液中ADD的测定方法如下所示
测定条件
色谱柱Kromasil C18 5ym 200X4. 6mm (可购自日本岛津公司)；
流动相甲醇水=80 20 (V/V)；
流速1. Oml/min ；
检测波长242nm。
标准曲线的测定配制一系列不同浓度的ADD标准溶液(50-500 μ g/ml)，分别取各浓度标准溶液的过滤液20 μ 1注入高效液相色谱仪中，测定其吸收峰面积，然后对浓度 (Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归，得到一元线性回归方程。
ADD含量计算方法将待测样品制成合适浓度(50-500 μ g/ml)的甲醇溶液，用 0. 45 μ m的微孔滤膜过滤，准确吸取滤液20 μ 1注入HPLC中，记录色谱图，将ADD峰面积代入上述的回归方程中，计算得到样品中ADD量。
下述实施例1中使用的分枝杆菌菌种来源于美国菌种保藏中心(ATCC)，该菌种于 1959年提交永久保藏，保藏号为NCTC1542，目前无任何限制发放给公众。
实施例1 植物甾醇生物转化为ADD的发酵、提取工艺
ADD来自于分枝杆菌培养液，其培养、提取和纯化步骤如下
(1)种子培养
一级种子瓶、二级种子罐的培养基的配比和配制方法相同，液体培养基组成如表1 所示。
表1种子培养基组成(克/每升)
权利要求
1.一种在植物留醇经微生物转化为ADD的方法中使用的发酵培养基，其包含有溶解或分散在水中的下列物质葡萄糖0. l-100g/L, 黄豆粉10-100g/L， 磷酸二氢钾0. 5-10g/L, 碳酸钙0. l-10g/L, 硫酸亚铁0. 001-0. 01g/L, 氯化锰0. 0001-0. 001g/L,以及植物甾醇:10-100g/L；所述发酵培养基的PH为5. 0-8. 0 ；并且，在所述发酵培养基中不含有植物甾醇助溶剂或分散剂。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其包含有溶解或分散在水中的下列物质 葡萄糖25g/L，黄豆粉40g/L， 磷酸二氢钾2g/L， 碳酸钙lg/L， 硫酸业铁0. 0051g/L, 氯化锰0. 0005g/L,以及植物甾醇50g/L ； 所述发酵培养基的PH为7. 2。
3.根据权利要求1或2所述的发酵培养基，其中所述植物留醇助溶剂或分散剂为聚乙二醇、葵花油、或乙二醇。
4.一种植物留醇经微生物转化为ADD的方法，该方法包括，在发酵培养分枝杆菌 (Mycobacterium)时使用根据权利要求1至3中任一项所述的发酵培养基。
5.根据权利要求4中所述的方法，在该方法中，在种子罐种龄达到30-50小时的时候进行接种，接种量为5-10% (ν/ν)；然后，在的温度下进行发酵，并将溶氧控制为 35-80%。
6.根据权利要求5中所述的方法，在该方法中，在所述种子罐种龄达到42小时的时候进行接种，接种量为5% (ν/ν)；然后，在30°C的温度下进行发酵，并将溶氧控制为35-45%。
全文摘要
本发明涉及一种植物甾醇经微生物转化为ADD的方法及所用培养基。其中，本发明的发酵培养基包含有溶解或分散在水中的下列物质葡萄糖0.1-100g/L，黄豆粉10-100g/L，磷酸二氢钾0.5-10g/L，碳酸钙0.1-10g/L，硫酸亚铁0.001-0.01g/L，氯化锰0.0001-0.001g/L，以及植物甾醇10-100g/L；所述发酵培养基的pH为5.0-8.0；并且，在所述发酵培养基中不含有植物甾醇助溶剂或分散剂。采用本发明的方法及培养基，植物甾醇转化为ADD的转化率更高；反应底物的浓度更高，使得转化效率也得到提高；转化特异性更高，简化了分离提纯工艺。
文档编号C12N1/20GK102477404SQ20101055712
公开日2012年5月30日 申请日期2010年11月24日 优先权日2010年11月24日
发明者何勇崴, 何晶, 刘省伟, 岳光, 赵德 申请人:北大国际医院集团有限公司, 北大国际医院集团重庆大新药业股份有限公司, 北大方正集团有限公司