一种β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn11C)基因的克隆及分析的制作方法

专利名称：一种β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn11C)基因的克隆及分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及来源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的一种新型β-1， 4-内切木聚糖酶基因(Aus xynllC)完整mRNA和DNA序列的克隆以及分析，属于生物工程技术领域。
背景技术：
木聚糖是仅次于纤维素含量的第二丰富的可再生多糖，广泛存在于陆生植物细胞壁中，由于木聚糖在动物体内具有很强的抗营养作用，因而大大限制了大麦、小麦等禾谷类饲料在畜牧生产中的应用。木聚糖完全降解需要几种酶协同作用，其中β_1，4-内切木聚糖酶(endo-i3-l，4-Xylanase，EC3. 2. 1.8)最为关键，它以内切方式随机作用于木聚糖的主链，产生长度不同的木寡糖。木聚糖酶广泛存在于真核和原核微生物、以及某些动植物中，微生物β -1，4-D-内切木聚糖酶是由一条多肽组成，其分子量在8 145kDa之间，在pH 值为3 10. 5范围内较稳定，最适酶促反应pH值一般在4 7之间，最适酶促反应温度一般位于40 60°C之间。根据Henrissat (1993)的分类标准，木聚糖酶分别属于第11家族糖苷酶和第10家族糖苷酶。第10家族的木聚糖酶的结构、理化性质较相似，但第11家族的木聚糖酶在pI、pH值、热稳定性及酶分子的结构等方面相差较大。到目前为止，国内外已有300余种不同来源的木聚糖酶基因的报道，其中100多种基因被克隆和表达在合适的宿主中，但研究较多的是细菌来源的木聚糖酶基因，目前生产应用中的木聚糖酶主要来源于真菌，因为真菌产生的木聚糖酶多为胞外酶，易于纯化分离。木聚糖酶在造纸、食品、饲料等工业以及能源和环境科学等领域具有潜在的应用价值。但微生物产木聚糖酶热稳定性不高。近年来，主要采用基因工程技术和蛋白质工程技术来改变木聚糖的性质。

发明内容
宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)来源的木聚糖酶具有良好的耐酸性。目前已经从A.usamii中克隆了第11家族的β _1，4-内切木聚糖酶A (XynllA)及β_1，4_内切木聚糖酶B(XynllB)，并在多种不同表达体系中进行了表达，一种新型内切β_1，4_木聚糖酶是A.usamii EOOl发现的第三种11家族的木聚糖酶，命名为Aus XynllC，其相应的基因命名为Aus xynllC。本发明的目的是提供一种A.usamii EOOl新型内切β_1，4_木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列，并对该基因序列及其编码的氨基酸序列进行了详细的分析，为下一步表达载体的构建和遗传转化奠定了基础。A. usamii EOOl菌株由江南大学筛选和保藏，已于2005年在《食品与发酵工业》杂志的Vol. 31，No. 4，Pg. 50公开，本发明人承诺该菌株在20年内向公众发放。本发明的技术方案一种源自A. usamii EOOl的新型β _1，4_内切木聚糖酶(Aus XynllC)，其基因(Aus xynllC)完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别为SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO :2。获取完整mRNA和DNA序列的流程如图1所示。
所述的由完整mRNA推导的Aus XynllC氨基酸序列为SEQ ID NO :3。所述的Aus xynllC完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法(I)Aus xynllC 3'端 mRNA 序列的克隆首先对 Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillusflavus NRRL3357 和 Neosartorya fischeri NRRL181 β _1，4-木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，找出两段约10个氨基酸的不同于XynllA和XynllB的保守序列；再对该两段氨基酸序列的mRNA进行同源比对，设计两条正向简并引物XynllC-Fl和 XynllC-F2XynllC-Fl 5' -TTCCT(C/G)GC(T/C)GGAAAGGGCT-3‘XynllC-F2 5' -AC(T/C)GAGTGGTAC(G/A)TTGTCGA-3‘提取A.usamii EOOl 的总 RNA，按照 TaKaRa RNA PCR Kit (Ver. 3. 0)说明书进行 RT-PCR扩增。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T 载体连接(pUCm-T-XynllC3')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC3'端 mRNA 序列。(2)Aus xynllC 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端mRNA 序列，设计两条反向引物XynllC-Rl和XynllC-R2。XynllC-Rl 5' -AAATGGCCAAAGTCCAGTCC-3‘XynllC-R2 5' -TGAAATAACCGTCCCAGGTC-3‘按照TaKaRa的5' -Full RACE Kit说明书进行5' -RACE。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-XynllC5')，转化
JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC 5'端mRNA序列。(3)Aus xynllC 5'端启动子序列的克隆利用一种连接介导的PCR扩增法(Wu Minchenet al. Cloning of an alkaline lipase gene from Penicillium cyclopium and its expression inEscherichia coli，Lipids, 2003，Vol. 38，No. 3，Pg. 191)，以处理后的 A.usamii EOOl 基因组 DNA 为模板，LP (5' GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)禾Π XynllC-Rl 为引物进行第一轮PCR，LP和XynllC-R2为引物进行第二轮PCR。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-xynllCP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC 5'端启动子序列。(4)Aus xynllC 3'端转录终止区序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3' 端mRNA序列，设计两条正向引物Xynl 1C-F3和Xynl 1C-F4。XynllC-F3 5' -TGGTTACCCTGGAAGGCTTT-3‘Xyn11C-F4 5‘ -ACTTCACCGTTAGTGCATAG-3‘利用我们前期申请的《一种T载体介导的测定3'端侧翼未知序列的方法》(专利申请号201010550861. 9)，以处理后的A. usamii E001基因组DNA为模板，XynllC_F3和 T-PrimerR为引物进行第一轮PCR，Xynl 1C-F4和T-PrimerR为引物进行第二轮PCR。将两轮 PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-XynllC3T)， 转化JM109，经酶切鉴定后送上海生工测序，得到Aus xynllC 3'端转录终止区序列。(5)Aus xynllC编码区DNA序列的测定基于上述得到的Aus xynllC 5'和3' 端mRNA序列，设计一对引物XynllC-F和Xynl 1C-R。XynIlC-F 5' -GGCAAACAACCGTTGCTATC-3‘
XynIlC-R 5' -AGAGCAGGCTCTAAGAGAAG-3‘以 A. usamii EOOl 基因组 DNA 为模板，XynllC-F 禾Π XynllC-R 为引物进行PCR。将PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接 (pUCm-T-xynllC-DNA)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC 编码区DNA序列。(6) Aus xynllC基因的生物信息学分析将Aus xynllC的5‘和3‘端mRNA序列进行拼接，得到自转录起始位点至Poly(A)完整的mRNA序列；在NCBI上对开放阅读框架 (OpenReading Frame)进行分析，进而推导出Aus XynllC的氨基酸序列；进行信号肽预测。 将AusxynllC的编码区DNA序列与其两侧序列进行拼接，获得完整的DNA序列，并对其5' 端启动子区域和3'端转录终止区的功能进行预测。本发明的有益效果本发明提供了一种来源于A. usamii EOOl的新型内切β_1， 4-木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆及分析，为该基因的异源高效表达和产业化生产奠定了理论基础。生物信息学分析表明该基因所编码的内切木聚糖酶属于A. usamii EOOl中发现的第三种11家族的木聚糖酶，所以命名为Aus XynllC，其相应的基因命名为 Aus xynllC。


图1 获取A. usamii EOOl xynllC完整mRNA和DNA序列的流程图
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例1 Aus xynllC 3'端mRNA序列的克隆以Oligo dT-Adaptor I^rimer为引物进行反转录合成cDNA的第一条链；以 M13 Primer M4和XynllC-Fl为引物进行第一轮PCR，其反应条件为94°C anin，30个循环(94 °C 30s，54 °C 30s，72 °C 45s)，72 °C IOmin ；以 M13 Primer M4 禾口 XynllC_F2 为弓| 物进行第二轮 PCR，其反应条件为94°C 2min，30 个循环(94°C 30s, 53 °C 30s, 72 °C 45s)， 72°C IOmin0将两轮PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与pUCm-T连接 (pUCm-T-xynllC3')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。实施例2 Aus xynllC 5'端mRNA序列的克隆以 5' -Full RACE Kit 的 Outer Primer 和 XynllC-Rl 为引物进行第一轮 PCR， 其反应条件为94 °C 3min, 30 个循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s)，72 °C IOmin ；以 Inner I^rimer和Xyn 11C-R2为引物进行第二轮PCR，其反应条件为94°C 3min，30个循环 (94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s)，72°C IOmin0将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析， 回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-XynllC5')，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。实施例3 Aus xynllC 5'端启动子序列的克隆第一轮PCR以LP和XynllC-Rl为引物，反应条件为94 °C 4min, 30个循环 (94°C 30s, 54°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin ；第二轮 PCR 以 LP 和 XynllC-R2 为引物，反应条件为94°C，3min，30 个循环(94°C 30s，54°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 将两轮 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-xynllCP)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC 5'端启动子序列。实施例4 Aus xynllC 3'端转录终止区序列的克隆以经处理的A.usamii EOOl基因组DNA为模板，第一轮PCR以Xynl 1C-F3和 T-PrimerR 为引物，反应条件为94°C 4min，30 个循环(94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 30s), 72°C IOmin ；第二轮 PCR 以 XynllC_F4 和 T-PrimerR 为引物，反应条件为94°C 3min，30 个循环(94 °C 30s, 54 °C 30s, 72 °C 30s), 72 °C IOmin。将两轮PCR产物用琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-XynllC3T)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序。实施例5 Aus xynllC编码区DNA序列的测定以A. usami i EOO1基因组DNA为模板，Xyn 11C-F和Xyn 11C-R为引物进行PCR，反应条件为:94°C 4min, 30 个循环(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin)，72°C IOmin0 将其产物用 1 % 琼脂糖凝胶电泳分析，回收目的条带并与PUCm-T连接(pUCm-T-xynllC-DNA)，转化JM109， 经酶切鉴定正确后送上海生工测序，得到Aus xynllC编码区DNA序列。
权利要求
1.一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001、归属于糖苷水解酶第11家族的新型β-1，4-内切木聚糖酶(Aus Xynl 1C)，其基因完整mRNA和DNA的核苷酸序列分别对应于序列表中的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2。
2.由权利要求1所述的β-1，4-内切木聚糖酶基因(AusxynllC)编码的新型β_1， 4-内切木聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO :3。
3.Aus xynllC完整mRNA和DNA序列的获取方法(1)AusxynllC 3'端 mRNA 序列的克隆对 11 家族的 Aspergillus oryzae RIB40, Aspergillusflavus NRRL3357 和 Neosartorya fischeri NRRL181 木聚糖酶的氨基酸序列进行同源比对，设计两条简并引物XynllC-Fl和XynllC-F2 ；XynllC-Fl 5' -TTCCT(C/G)GC(T/C)GGAAAGGGCT-3‘XynllC-F2 5' -AC(T/C)GAGTGGTAC(G/A)TTGTCGA-3‘以 A. usamii EOOl 总 RNA 为模板，Oligo dT-Adaptor Primer 为引物反转录合成 cDNA 的第一条链；以M13 Primer M4和XynllC-Fl为引物进行第一轮PCR扩增(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s，54°C 30s，72°C 45s ;72°C IOmin)；以 M13 Primer M4 禾口 XynllC_F2 为弓|物进行第二轮 PCR 扩增(94°C 2min ；30 个循环，94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 45s ；72°C IOmin)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xynllC 3'端mRNA序列;(2)AusxynllC 5'端mRNA序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端mRNA序列，设计两条反向引物XynllC-Rl和XynllC-R2 ；XynllC-Rl 5' AAATGGCCAAAGTCCAGTCC-3‘Xyn11C-R2 5‘ TGAAATAACCGTCCCAGGTC-3‘以反转录合成的cDNA第一条链为模板、5' RACE Outer Primer和XynllC-Rl为引物进行第一轮 PCR 扩增(94°C 3min ；30 个循环，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 5' RACE Inner Primer 和 XynllC_R2 为引物进行第二轮 PCR扩增(94°C 3min ；30 个循环， 94°C 30s,55°C 30s,72°C 30s ；72°C IOmin)；目的条带经克隆、测序，得到 Aus xynllC 5'端 mRNA序列；(3)AusxynllC 5'端启动子序列的克隆以经处理的A. usamii E001基因组DNA为模板，以 LP(5 ‘ GGATCCCTTCACTCTCAAG-3 ‘)和 XynllC-Rl 为引物进行第一轮 PCR 扩增 (940C 4min ；30 个循环，94°C 30s，54°C 30s，72°C Imin ；72°C IOmin)；以 LP和 XynllC_R2 为弓丨物进行第二轮 PCR扩增(940C 3min ；30 个循环，94°C 30s，54°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)； 目的条带经克隆、测序，得到Aus xynllC 5'端启动子序列；(4)AusxynllC 3'端转录终止区序列的克隆基于上述得到的Aus xynllC 3'端 mRNA序列，设计两条正向引物Xynl 1C-F3和Xynl 1C-F4 ；XynllC-F3 5' -TGGTTACCCTGGAAGGCTTT-3‘Xyn11C-F4 5 ‘ -ACTTCACCGTTAGTGCATAG-3‘以经处理的A. usamii E001基因组DNA为模板，Xynl 1C-F3和T-PrimerR为引物进行第一轮 PCR 扩增(94°C 4min ;30 个循环，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；以 XynllC-F4 和 T-PrimerR 为引物进行第二轮 PCR 扩增(94 °C 3min ;30 个循环，94 °C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s ；72°C IOmin)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xynllC 3'端转录终止区序列；(5)Aus xynllC编码区DNA序列的测定基于上述得到的Aus xynllC 5'和3'端mRNA 序列，设计一对引物XynllC-F和XynllC-R ； XynllC-F 5' -GGCAAACAACCGTTGCTATC-3‘ XynllC-R 5' -AGAGCAGGCTCTAAGAGAAG-3‘ 以A. usamii EOOl基因组DNA为模板，XynllC-F和XynllC-R为引物进行PCR扩增扩增(940C 4min ；30 个循环，94°C 30s, 55°C 30s, 72°C Imin ；72°C IOmin)；目的条带经克隆、测序，得到Aus xynllC编码区DNA序列。
全文摘要
本发明提出了一种源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001菌株的新型β-1，4-内切木聚糖酶基因完整mRNA和DNA序列的克隆和分析方法，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。生物信息学分析表明该β-1，4-内切木聚糖酶是在A.usamii E001中发现的第三种11家族的木聚糖酶，所以命名为Aus Xyn11C，其氨基酸序列为SEQ ID NO3，相应的基因命名为Aus xyn11C。这为该基因的异源表达和工业化生产奠定了理论基础，有较大的工业化生产和应用潜力及经济价值，也为其它β-1，4-内切木聚糖酶的研究奠定了理论基础。
文档编号C12N15/56GK102154242SQ20101058142
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者刘高磊, 张慧敏, 李剑芳, 邬敏辰 申请人:江南大学