专利名称：一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物，可用于对样品中蜡蚧轮枝菌的分子检测。
背景技术：
蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)是ー种地理分布和寄主范围均很广泛的昆虫病原真菌，最早由Nivter于1861年在锡兰首次发现，我国是1959年日本泽田兼吉从台湾的样本中分离得到蜡蚧轮枝菌。蜡蚧轮枝菌一直归于Verticillium属，但是根据菌株形态差异和分子遗传分析，现在将它更改为Lecanicillium属，包含种类非常丰富，可以感染多种作物上的病原真菌、害虫和病原线虫。蜡蚧轮枝菌已被证实是一种极具潜力的微生物杀虫剂，欧美、前苏联等国成功将其应用于温室防治蚜虫、白粉虱和蓟马等害虫。但是，蜡蚧轮枝菌与常见的昆虫病真菌白僵菌和绿僵菌的特性不同，无法使用“大蜡螟诱集法”(大蜡螟对蜡蚧轮枝菌不敏感)和“平板计数法”(缺乏对蜡蚧轮枝菌的选择性培养)对样品中的蜡蚧轮枝菌进行有效研究，只能通过自然界染病虫尸的数量对蜡蚧轮枝菌的流行状况做简单评估，这严重制约了该类有益真菌在害虫综合防治体系中的应用。
发明内容
本发明是为了解决目前缺乏引物从样品DNA中扩增出蜡蚧轮枝菌靶标序列的问题，而提供一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物。本发明用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物为正向引物 5，-CGGCGTCCGGACGCGGACCCAG-3，和反向引物 5，-CCCCAACGCCGACTTCCCCGAG-3，。将本发明所用引物对命名为VF/VR。本发明的引物是根据真菌核糖体rDNA的序列碱基存在差异的特点而设计的。应用本发明的引物VF/VR可从各类样品DNA中直接扩增出长度为299bp的蜡蚧轮枝菌目的片段。
图1为实施例1中VF/VR弓丨物对7种属真菌DNA扩增产物的凝胶电泳图。图2为实施例2中VF/VR弓丨物对土壤样品DNA扩增产物的凝胶电泳图。
具体实施例方式实施例1分别以赌蚧轮枝菌(Verticilliumlecanii)、大丽轮枝菌(Verticillium dahiiae)、i^Jfe|=i1:i;|i| (Beauveria bassiana; (Metarnizium anisopliae) > 攻烟拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、尖擁抱菌(Fusarium oxysporum)、灰霉菌(Botrytis cinrea)和链格孢菌(Alternaria alternata) 7个属真菌DNA为模板进行引物 VF/VR的特异性验证试验。PCR扩增体系为25 μ L由0. 5 μ LDNA模板(约IOng)、0· 5 μ L正向弓丨物 VF(10yM)、0.5yL 反向引物 VR(10 μ Μ)、0· 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L IOXPCR buffer (with MgC12) ,0. 2μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，灭菌双蒸水补足 25 μ L。PCR 扩增反应条件为预变性94°C 3min,变性94°C 30s，退火55°C 30s,延伸72°C 45s，共35个循环，72 °C延伸5min，4°C保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示，图1 中M泳道为标准ΒΜ2000，1-4号泳道分别为含有蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii) 4株不同菌株DNA的扩增结果，5-11号泳道分别为含有大丽轮枝菌(Verticillium dahliae), 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、玫烟拟青霉(Paecilomyces fumosoroseus)、尖键抱菌(Fusarium oxysporum)、灰霉菌(Botrytis cinrea)和链格孢菌(Alternaria alternata)DNA的扩增结果，12号泳道为不含DNA空白对照的扩增结果。从图1中可以看出本实施方式用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物VF/ VR能够准确的扩增出蜡蚧轮枝菌的靶标序列片段，而未能从近缘真菌DNA和空白对照中扩增出核酸片段。将1、2、3、4号泳道对应的序列片段分别于T载体连接后转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞测序，测序结果为序列长度为^9bp，并且经blast分析，为蜡蚧轮枝菌 (Verticillium lecanii)的特异序列。实施例2应用引物VF/VR对24份土样(采自河北廊坊市和湖北武汉市)DNA进行PCR扩增试验。PCR扩增体系为25yL由0. 5yL DNA模板(约10ng)、0. 5 μ L正向引物VF (10 μ M)、 0.5yL 反向弓I 物 VR(IOyM)、0.5yL dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L 10XPCR buffer (with MgCl2)、0. 2 μ 1 TaqDNA聚合酶(5U/ μ L)，灭菌双蒸水补足25 μ L。PCR扩增反应条件为 预变性94°C 3min，变性94°C 30s，退火55°C 30s，延伸72°C 45s，共；35个循环，72°C延伸 5min，4°C 保存。将本实施方式扩增出的序列进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示，图2 中M泳道为标准BM2000，1-12号泳道分别为河北廊坊市土壤样品DNA的扩增结果，13-24号泳道分别为湖北武汉市土壤样品DNA的扩增结果。从图2中可以看出本实施方式用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物VF/VR能够准确的扩增出所有土壤样品DNA中的蜡蚧轮枝菌的靶标序列片段。随机挑选2、4、8、16J4号泳道对应的序列片段分别于T载体连接后转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞测序，测序结果为序列长度为^9bp，并且经blast分析，为蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)的特异序列。
权利要求
1. 一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物，其特征在于用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物为正向引物 VF :5，-CGGCGTCCGGACGCGGACCCAG-3， 反向引物 VR :5，-CCCCAACGCCGACTTCCCCGAG-3’。
全文摘要
一种用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物，它涉及一对用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物。本发明解决了目前缺乏引物从样品DNA中扩增出蜡蚧轮枝菌靶标序列的问题。本发明用于扩增蜡蚧轮枝菌的特异性引物为VF(5’-CGGCGTCCGGACGCGGACCCAG-3’和VR(5’-CCCCAACGCCGACTTCCCCGAG-3’)。本发明的引物能够准确扩增出蜡蚧轮枝菌目的片段。
文档编号C12Q1/68GK102533942SQ201010581469
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月10日 优先权日2010年12月10日
发明者张艳军, 谢明, 邱卫亮 申请人:谢明