专利名称：整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法
技术领域：
本发明涉及基因重组领域，特别涉及缺陷型慢病毒在介导锌指核酸酶于动物早期胚胎表达中的应用。
背景技术：
基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在遗传修饰疾病动物模型制备等方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。传统的动物基因组靶向修饰方法为DNA同源重组法，其不仅效率低，而且不适宜于除小鼠以外的其它哺乳类模式动物种属，从而限制这些技术的应用。锌指核酸酶(ZFN)的出现，给基因组靶向修饰技术带来了希望。锌指核酸酶能识别特异的DNA序列，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后细胞固有的
DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复，从而达到DNA靶向修饰的目的。锌指核酸酶技术不仅将基因组靶向修饰的效率提高了3 5个数量级，而且具有极高的特异性。利用ZFN对动物基因组靶向修饰，能够缩短动物良新品种的培育时间。但利用 ZFN创制转基因或基因敲出动物新品种，要求ZFN在动物早期胚胎暂时性表达的时间较长。 现有技术中，ZFN于动物早期胚胎表达的技术通常为向动物胚胎胞质或胞核注射编码ZFN 的mRNA，或向动物胚胎原核注射编码ZFN的质粒DNA。但由于mRNA极易降解，只能实现ZFN 于动物早期胚胎短暂表达，不利于ZFN活性充分发挥进而对动物早期胚胎基因组进行高效的位点特异性遗传修饰。虽然向早期胚胎细胞原核导入质粒DNA可实现ZFN较长时间的暂时性表达，但该方法要求动物胚胎原核清晰，不适合除小鼠以外的其它哺乳类动物种属。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供整合缺陷型慢病毒的新应用，该应用可以延长 ZEN动物早期胚胎的表达时间，为实现上述目的，本发明的技术方案为
整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用及方法。上述应用中，首建构建表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体；之后利用整合酶功能缺失的包装质粒包装表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体，获得表达锌指核酸酶的整合缺陷型重组慢病毒；通过卵周隙显微注射或共孵育等方式利用整合缺陷型慢病毒感染感染动物早期胚胎，实现锌指核酸酶于动物早期胚胎的表达。本发明的另一目的在于提供延长锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的方法，方法能显著延长ZEN于动物早期胚胎的表达时间。为实现上述目的，本发明的技术方案为
延长锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的方法，将缺陷型慢病毒用卵周隙显微注射感染动物早期胚胎，所述缺陷型慢病毒为表达锌指核酸酶的整合缺陷慢病毒表达载体。本发明的有益效果在于1、与向胚胎胞质或胞核注射mRNA相比，本发明显著延长ZFN 于动物早期胚胎的表达时间。体外检测表明，mRNA注射法表达时间为3 4天，本发明表达时间在7天以上。2、与向动物早期胚胎原核导入质粒DNA的方法相比，本发明可适用于除小鼠以外的其它种属哺乳动物，如大鼠、猪、羊、牛等。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1整合缺陷型慢病毒在介导锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的应用及方法
1、通过DNA重组将编码ZFN的基因序列亚克隆至慢病毒载体，获得表达ZFN的重组慢病毒载体。(1)利用BamHI和EcoRI内切酶双酶切质粒pST1374(左向锌指核酸酶)或ρ⑶NA3. 1 (右向锌指核酸酶)，切下包含有锌指核酸酶开放阅读框(ORF)的DNA片段；
(2)通过凝胶电泳使锌指核酸酶编码区DNA片段和质粒DNA片段分离，通过凝胶纯化回收锌指核酸酶编码区片段(操作见所用的商业化试剂盒说明书)；
(3)利用相同的核酸内切酶双酶切慢病毒载体FUW，并通过凝胶电泳按照步骤(2)回收、纯化酶切后线性化的慢病毒载体；
(4)将纯化的锌指核酸酶编码区片段和酶切后线性化的慢病毒载体，按照分子数量之比3 :1的比例混合，利用Τ4 DNA连接酶连接；
(5)将步骤(4)的连接反应产物转化至感受态细菌DH5α，通过筛选培养获得抗性克隆，即为含有表达锌指核酸酶的重组慢病毒载体的转化细菌。2、利用质粒抽提试剂盒分别提取ZFN慢病毒表达载体质粒、表达包膜蛋白VSV-G 的包装质粒和表达病毒结构蛋白和缺陷型整合酶的包装质粒，浓度为400μ g/mL。3、在10个10 cm无菌培养皿中，每个培养皿接种3 XlO6细胞，并培养至 70%汇合。4、将6yg表达包膜蛋白的包装质粒、15 μ g表达结构蛋白和整合酶的包装质粒和20 μ g表达ZFN的重组慢病毒载体质粒混勻于无菌去离子水中至终体积1095 μ L，加入 155 μ L 2 mol/L CaC12，然后滴加1250yL 2XHBS,边滴加边混勻，滴加完毕后静置2分钟，待沉淀形成后滴加到培养四3 1的10 cm培养皿中。5、培养1 后，吸去上清，加入10 mL新鲜的含10%小牛血清的DMEM，继续培养48小时。6、收集上清，将每个平板中的细胞上清汇集在灭菌的50mL尖底离心管中，1000转 /分钟离心10分钟，取上清以0.45μπι滤器过滤至新的灭菌的50mL离心管中。7、20000 Xg离心6小时(或70000 Xg离心2小时)。8、弃去上清，确定沉淀所在位置，用200 μ L HBSS重悬沉淀，之后将重悬液置于 ImL 20%蔗糖的HBSS溶液上，50000 X g梯度离心2小时，弃去上清。用适量HBSS (40 μ L) 充分重悬后，分装成小管置于-80°C冰箱备用。
9、利用针对病毒蛋白PM的ELISA检测试剂盒测定病毒滴度。采用方阵滴定法，具体步骤如下(1)将病毒蛋白PM用包被液倍比稀释(1:20、 1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，包被酶标板，100 μ L/孔，置4°C湿盒孵育过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(2)加入100 μ L/孔封闭液，37°C湿盒封闭lh，洗板机洗涤1次， 5min/次，拍干；(3)加入待测样品，100 μ L/孔，37°C湿盒作用，洗板机洗涤3次，5min/次， 拍干；(4)将病毒蛋白P24 IgG倍比稀释(1 20、1 40、1 80、1 160、1 320、1 640)，加入酶标板中，100 μ L/L，37°C湿盒孵育Ih,洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(5)加入1 2000稀释的抗体IgG-HRP，100 μ L/孔，37°C反应45min,洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；(6)加入TMB 底物100 μ L/孔，25°C避光显色201^11后，加入5(^17孔2mol/L硫酸终止反应；(7)检测 用酶标仪测OD45tlnm值。同时以1%的BSA/PBS溶液作空白对照，测定病毒滴度。10、将病毒悬液滴度调整至lX109TU/mL以上，即可用于感染动物早期胚胎、实现 ZFN于动物早期胚胎较长时间的暂时性表达。二、技术有效性检测
以小鼠早期胚胎为实验材料、以同时表达绿色荧光蛋白(eGFP)和ZFN的整合缺陷慢病毒表达载体(IDL-ZFN-IRES-GFP)为实验载体，通过卵周隙显微注射感染动物早期胚胎，测定IDL介导的ZFN表达于动物早期胚胎中的表达持续时间。由于ZFN与eGFP在同一载体中共转录与共表达，因此通过观察胚胎中的荧光强度及持续时间即可反映ZFN的表达强度及持续时间。同时设立质粒DNA原核注射组、mRNA胞质注射组。结果表明本发明介导的ZFN在动物早期胚胎表达的持续时间显著长于mRNA注射组(7.1 士2. 3d vs 3. 6士 1.7d，P<0. 01);与质粒DNA原核注射组无显著差异(7. 1 士2. 3d vs 7. 3士2. 7d, Ρ>0· 05)。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的介导剂中的应用。
2.延长锌指核酸酶于动物早期胚胎表达的方法，其特征在于将整合缺陷型慢病毒用卵周隙显微注射感染动物早期胚胎，所述整合缺陷缺陷型慢病毒为表达锌指核酸酶的整合缺陷慢病毒表达载体。
全文摘要
本发明涉及基因重组领域，特别涉及整合缺陷型慢病毒在制备锌指核酸酶于动物早期胚胎表达中的介导剂中的应用，本发明与向胚胎胞质或胞核注射mRNA相比，本发明显著延长ZFN于动物早期胚胎的表达时间；体外检测表明，mRNA注射法表达时间为3～4天,本发明表达时间在7天以上；与向动物早期胚胎原核导入质粒DNA的方法相比，本发明可适用于除小鼠以外的其它种属哺乳动物，如大鼠、猪、羊、牛等。
文档编号C12N5/10GK102559652SQ201010618188
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者刘勤, 刘宇, 刘昌峨, 周晓杨, 江雯, 王勇, 王露露, 郭科男, 魏泓 申请人:中国人民解放军第三军医大学