专利名称：鉴别葡萄球菌并检测其耐药性的多重pcr试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种试剂盒，尤其涉及一种快速鉴别感染性标本中的葡萄球胃(Staphylococcus) ^ W ^ IlJ ^ ft W ^ S PCR (multiplex polymerase chain reaction)试剂盒。
背景技术：
近年来，革兰阳性球菌感染有上升趋势，约占医院感染的40%。已经重新成为医院感染的主要病原菌，与20世纪五六十年代不同的是出现了耐药革兰阳性球菌的广泛传播和流行，甚至是爆发流行。其中最主要的是葡萄球菌的感染，金黄色葡萄球菌占所有革兰阳性球菌感染的第一位。金黄色葡萄球菌的流行。美国疾病控制与预防中心(CDC)报告，美国本土MRSA占临床分离的金葡菌菌株的16 % 22 %，现已高达50 %，因感染MRSA而没有得到及时治疗的死亡病例数也逐年增加。在我国上海地区70年代葡萄球菌中MRAS分离率为5 %，1985-1986 为M%，1989年则升至60%，2001年已达44% 77% [何述祥.金黄色葡萄球菌耐药性的变迁和耐药机理.[J].内蒙古医学杂志，2001 ;33(4) :342-345汪复，朱德妹，胡付品， 等.上海地区细菌耐药性监测分析.[J].中华医学杂志，2001 ;81(1) :17-19] 0 1995 1999年在大连、北京、南京等9大城市13家医院的细菌耐药检测调查中MRAS的检出率为 27. 55%，院内感染患者中MRSA检出率为81. 82% [李家泰，AnnaJJeinsetni.中国细菌耐药监测研究.中华医学杂志，2001 81 (1) :8-16.]。中南地区2006年6月-2007年6月临床分离菌株中儿童组(< 14岁)和成人组(> 15岁)耐甲氧西林金葡菌(MRSA)分离率分别为14. 8%禾口 51. 2%0非ICU中MRSA和MRSCN的分离率分别为45. 2%禾口 66. 3%, ICU 中MRSA分离率为77. 6% [简翠，叶涛，张蓓，等。Mohnarin2006-2007年度报告中南地区细菌耐药监测[J]中国抗生素杂志2008,33(10) :608-615]。葡萄球菌常见的金葡菌对青霉素的耐药率为85. 11% [陈翠卿罗立旷陈作严，医院细菌耐药性监测及抗菌药物应用对策[J].国际医药卫生导报2008，14(21) :81-83]，其中大部分MRSA同时对喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素类耐药。凝固酶阴性葡萄球菌的流行。20世纪70年代开始，凝固酶阴性葡萄球菌的致病性也得到了认识，近年来由于诊疗设备的不断增多，免疫抑制剂、皮质类激素与放射治疗以及抗生素的广泛应用，致使表皮葡萄球菌等血浆凝固酶阴性葡萄球菌引起的感染日益增多。美国国家医院感染检测系统提供的数据显示，自1990年1月至1999年5月患者血培养分离的病原菌中凝固酶阴性和凝固酶阳性葡萄球菌所占比例分别为37.3%、 12. 6% [von Eiff，C.，G. Peters，and C. Heilmann. Pathogenesis of infections due to coagulase-negative staphylococci. [J]Lancet Infect· 2002· 2 :677-685.]。凝固酶阴性葡萄球菌的致病性不容忽视。耐药葡萄球菌。金黄色葡萄球菌，尤其是甲氧西林或苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)是引起院内感染的多重耐药菌。在第一个耐青霉素酶的内酰胺类抗生素甲氧西林用于临床治疗葡萄球菌感染不久，1961年在英国发现了世界首例MRSA。从此， MRSA逐渐成为全世界院内感染的主要病原菌。目前在许多国家仍在增长，MRSA几乎对所有 β-内酰胺类抗生素耐药，甚至累及到红霉素，环丙沙星和庆大霉素。1996年在日本首次发现了 MRSA对万古霉素敏感性下降的菌株，即万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(VISA)。VISA 的出现预示着万古霉素治疗葡萄球菌感染的临床疗效下降，随之万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌(VRSA)临床株是否会分离到，成为人们监测和关注的热点。如果葡萄球菌一旦对万古霉素耐药，临床将如何治疗？所以连续监测金黄色葡萄球菌的耐药现状，了解葡萄球菌的耐药机制，感染的危险因素及其治疗对策具有重要的临床意义。葡萄球菌的耐药率是呈上升趋势的，该菌感染已成为当今世界范围内医务界面临的严重问题，已经被列为“超级细菌”之首。国际上将MRSA感染作为世界上三大感染之一。 MRSA和MRCNS对β -内酸胺类与氨基糖甙类抗生素几乎均有耐药性，对氟哇诺酮类抗生素的耐药性亦呈上升趋势。因此寻找一种快速检测MRS的方法已成当务之急，可使我们及时使用糖肽类抗生素，迅速控制耐甲氧西林葡萄球菌造成的感染，限制其播散，同时也可以减少糖肽类抗生素的滥用，减缓对糖肽类抗生素耐药的葡萄球菌的出现。琼脂稀释法是CLSI0/NCCL S推荐的检测MRSA的经典方法。M IC法费力、耗时、成本较高，临床上不宜作为常规方法开展。目前，m ecA基因的分子检测已取代了该法成为鉴定 MRSA 的“金标准” [B row η D F,Edw ardsD I,Haw key PM, et al. Guidelines for the Iabo rato ry diagno sis and suscep t ibility testing of methicillin2resistant Sta hylococcus aureus (MRSA)[J]. JA nt im icrob Chem other,2005,56 (6) :1000]o
实用新型内容本实用新型的目的是解决上述问题而提供一种结构简单，在保证结果准确的同时又有高通量的优势，更加省时省力，降低成本的快速鉴别感染性标本中的葡萄球菌并同时检测其耐药性的多重PCR试剂盒。本实用新型解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括壳体，壳体上设有溶葡萄球菌素放置仓、NaOH溶液放置仓、多重PCR反应液放置仓、标准阳性模板放置仓、阴性质控标准品放置仓和％ NaCl溶液放置仓。与现有技术相比，本实用新型取得了以下的技术效果1、此实用新型结构简单，与临床检测上传统的培养法相比多重PCR方法跟单一 PCR方法比较起来，在保证结果准确的同时又有高通量的优势，更加省时省力，降低成本；2、特异性好，灵敏度高，步骤简单，可重复性高，可同时进行高通量的样品检测，检测速度快，加上样品DNA的提取制备，5小时内可以完成。
图1为本实用新型俯视图。其中1-壳体、2-溶葡萄球菌素放置仓、3-NaOH溶液放置仓、4-多重PCR反应液放置仓、5-标准阳性模板放置仓、6-阴性质控标准品放置仓、7-NaCl溶液放置仓。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本实用新型的实施例。实施例1参见图1，一种鉴别葡萄球菌并检测其耐药性的多重PCR试剂盒，它包括壳体1，壳体上设有溶葡萄球菌素放置仓2、4% NaOH溶液放置仓3、多重PCR反应液放置仓4、标准阳性模板放置仓5、阴性质控标准品放置仓6和0. 9% NaCl溶液放置仓7。多重PCR反应液含有3对引物，引物分为正向引物和反向引物，分别为；mecA 5' -GTA GAA ATG ACT GAA CGT CCG ΑΤΑ A-3'5' -CCA ATT CCA CAT TGT TTC GGT CTA A-3'；femB 5’ -TTA CAG AGT TAA CTG TTA CC-3’5' -ATA CAA ATC CAG CAC GCT CT-3'；16SrDNA5' -AAC TCT GTT ATT AGG GAA GAA CA-3’5' -CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC-3'；标准阳性模板从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌标准菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌组DNA。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌标准菌株先用无菌TE缓冲液配制成细菌悬液，经过平板计数法及用定量接种环确定所配制的菌液浓度为108CFU/ml，经过热裂解提取细菌基因组DNA，具体地说a)标本DNA提取液包括20U/ml溶葡萄球菌素、4% NaOH溶液、0. 9% NaCl溶液b)多重PCR反应液 多重PCR反应液是由正向引物和反向引物3对，TaqDNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+， 10Xbuffer和无菌双蒸水组成。在本发明的一个具体方案中，多重PCR反应液由IOymol/ L的引物，各引物量分别为mecA正负向引物各0. 6 μ 1，femB正负向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA 正负向引物各 0. 6 μ 1，10Xbuffer3y 1，dNTP Mixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，无菌双蒸水 4. 3 μ 1，反应液总体积22 μ 1。其中引物为所示的核苷酸序列。c)标准阳性模板标准阳性模板从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌标准菌株(ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌组DNA。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌标准菌株(ATCC43300)菌落，溶于2ml的无菌TE缓冲液中配成细菌悬液，经平板计数法以及用定量接种环确定所配制的菌液浓度为10!^^/1111，取40(^1经过热裂解提取细菌基因组 DNA, -20°C保存，做为阳性模板备用。d)阴性质控标准品阴性质控标准品为无菌双蒸水。本实用新型的使用方法包括下列步骤a)按阳性标本处理方法提取送检标本细菌DNA用于多重PCR反应；b)将标准阳性模板从-20°C冰箱取出，平衡至室温待用；c)分别取等量的a)步中的标本中的细菌组DNA和b)步中标准阳性模板加入到多重PCR反应液(正向引物和反向引物3对，TaqDNA聚合酶，dNTPMi xtur e, Mg2+，IOXbuffer和无菌双蒸水)中，用PCR扩增仪进行扩增；d)将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。本方法可对临床分离的可疑葡萄球菌进行快速鉴定，并同时检测其耐药性，缩短一直沿用的传统培养药敏法的诊断时。实施例1 快速鉴定葡萄球菌及检测耐药基因的多重PCR试剂盒组成与配制。试剂组成a、标本 DNA 提取液al_20U/ml 溶葡萄球菌素、a2~4% NaOH 溶液、a3-0. 9% NaCl 溶液b、多重PCR反应液正向引物和反向引物3对(ΙΟμπιοΙ/L)，其中引物量分别为 mecA正负向引物各0. 6μ 1，femB正负向引物各1. 9 μ 1，16SrRNA正负向引物各0. 6 μ 1， 10 X buffer3 μ 1，dNTPMixture3 μ 1，Mg2+2. 5 μ 1，无菌双蒸水 4. 3 μ 1，反应液总体积 22μ 1 ；C、标准阳性模板标准阳性模板从耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌标准菌株 (ATCC43300)中提取的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌细菌组DNA ；d、阴性质控标准品为无菌双蒸水。实施实例2 用快速鉴定葡萄球菌及检测耐药基因的多重PCR试剂盒检测标本中的葡萄球菌。 1、临床标本DNA的提取脓液取Iml于无菌瓶中，加入4倍体积4% NaOH溶液，室温放置，液化30min， 充分振荡，取Iml液化后液体于无菌EP管中，12000rpm离心lOmin，弃上清；加Iml生理盐水于沉淀中，打勻，12000rpm离心lOmin，弃上清；重复一次；收集沉淀，将沉淀溶于 300 μ ITE (ΡΗ8. 0)的EP管中；加入20U/ml溶葡萄球菌素20 μ 1，放入37°C恒温水浴箱作用30min ；金属浴100°C加热IOmin ；不等冷却，4°C低温离心机12000gX lOmin，取上清液 50 μ 1即得细菌总DNA。血液取阳性报警血培养瓶中血液Iml于无菌EP管中，3000rpm离心5min，取血清于另一 EP管，12000rpm离心lOmin，弃上清；用生理盐水洗2 3次后收集最终沉淀，采用上述方法提取DNA。体液包括脑脊液、胸腹腔液、前列腺液等，可直接离心沉淀用生理盐水洗2 3次后收集最后沉淀，采用1.所述方法提取DNA;成分粘稠同脓液处理方法，加入4倍体积4% NaOH溶液，室温放置，液化30min，充分振荡，取Iml液化后液体于无菌EP管中，12000rpm 离心lOmin，弃上清；加Iml生理盐水于沉淀中，打勻，12000rpm离心lOmin，弃上清；重复一次；收集沉淀，采用上述方法提取DNA。2、将标准阳性模板从-20°C冰箱取出，平衡至室温待用；3、分别取等量的细菌组DNA和标准阳性模板(3 μ 1)加入到多重PCR反应液 22μ 1(正向引物和反向引物3对，TaqDNA聚合酶，dNTP Mixture，Mg2+，IOXbuffer和无菌双蒸水)中，用PCR扩增仪进行扩增；扩增条件为94°C 3min预变性，94°C 40s 58°C 40s 72°C Imin 20cycles, 94°C Imin 50°C Imin 72°C 2min 25cycles ；72°C IOmin 延伸；4、将扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件100v 80mA 50min凝胶浓度
61. 5%电泳结束后紫外灯下观察结果；5、结果的判读
权利要求1.鉴别葡萄球菌并检测其耐药性的多重PCR试剂盒，其特征在于它包括壳体(1)，壳体上设有溶葡萄球菌素放置仓O)、Na0H溶液放置仓(3)、多重PCR反应液放置仓、标准阳性模板放置仓(5)、阴性质控标准品放置仓(6)和NaCl溶液放置仓(7)。
专利摘要本实用新型涉及鉴别葡萄球菌并检测其耐药性的多重PCR试剂盒，它包括壳体，壳体上设有溶葡萄球菌素放置仓、NaOH溶液放置仓、多重PCR反应液放置仓、标准阳性模板放置仓、阴性质控标准品放置仓和NaCl溶液放置仓。本实用新型结构简单，与临床检测上传统的培养法相比多重PCR方法跟单一PCR方法比较起来，在保证结果准确的同时又有高通量的优势，更加省时省力，降低成本。
文档编号C12Q1/14GK201952436SQ2010205545
公开日2011年8月31日 申请日期2010年10月9日 优先权日2010年10月9日
发明者李艳, 汪明, 胡慧霞 申请人:李艳, 汪明, 胡慧霞