专利名称：微生物的培养方法及利用微生物制造物质的方法
技术领域：
本发明涉及将长链脂肪酸作为微生物能够适宜同化的碳源来利用，在工业上高效进行微生物的培养、利用微生物生产物质的方法。另外，还涉及使用所述碳源，在工业上高效地使微生物产生聚羟基烷酸酯(以下也称PHA)的方法。
背景技术：
在对环境问题、粮食问题、健康以及安全的意识提高，天然或自然意识提高等背景下，微生物的培养、利用微生物制造物质(发酵生产、生物转换等)的意义和重要性日益提
尚ο在微生物的培养、利用微生物制造物质中，需要有适宜被微生物同化的碳源(用于培养、发酵等的碳源)。作为该碳源的代表，可以列举出糖类、油脂、短链脂肪酸等。近年，在环境问题等背景下，作为碳源，日益期望可再生碳源(尤其非石油来源的碳源)、更理想的是不与食物冲突的碳源(所谓不适于食用的碳源)。从该观点上看，长链脂肪酸(例如来自植物的长链脂肪酸)应该是适宜碳源的候选之一。长链脂肪酸例如可以从椰子、棕榈(包括棕榈核)等中获得。已知椰子、棕榈等植物作为油脂中的组成脂肪酸，含有长链脂肪酸。作为这些来源于植物的代表性长链脂肪酸，可以列举出碳数12的月桂酸、碳数14的肉豆蔻酸、碳数16的棕榈酸等长链饱和脂肪酸和碳数 18的油酸等长链不饱和脂肪酸。这些长链脂肪酸被作为表面活性剂、肥皂、化妆品等的工业原料加以利用。但是， 并没有在利用微生物的产业中被广泛利用。尤其是，并没有充分进行将其作为用于培养微生物及利用微生物制造物质的碳源来利用的研究。报告了将月桂酸或者油酸单独作为碳源使用，培养嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)，生产PHA的例子(参见非专利文献1 )。但是，其主要讨论了将油酸单独作为碳源使用的情况，而没有讨论肉豆蔻酸和棕榈酸。另外，报告了将月桂酸或者肉豆蔻酸单独作为碳源使用，培养真氧产碱杆菌 (Ralstonia eutropha)，生产PHA的例子(参见专利文献1)，但是PHA的产量极低，在lg/L 以下。另外，没有利用棕榈酸。而且，报告了将月桂酸钠等盐单独作为碳源使用，培养大肠埃希氏菌 (Escherichia coli，大肠杆菌)，生产PHA的例子(参见非专利文献2)。但是没有利用肉豆蔻酸和棕榈酸。以上的研究仅停留在培养规模在几毫升至几升的小规模的实施上。如上所述，还没有达到在工业上将各种长链脂肪酸作为用于微生物的培养、利用微生物制造物质的碳源来适宜利用的目标。现有技术文献专利文献
专利文献1 美国专利申请公开第2002/0086377号说明书。
非专利文献
非专利文献 1 :Lee S.、et. al.、Biotechnol Bioeng.、67 :240-244 (2000)； 非专利文献 2 =Regina V.、et. al.、FEMS MICROBIOLOGY LETTERS、111-117 (2000)。
发明内容
本发明的课题在于提供一种有效利用迄今为止未必被有效产业利用的长链脂肪酸的方法。具体来说，课题在于提供如下方法，即提供一种将所述长链脂肪酸作为微生物能适宜同化的碳源来利用，在工业上高效进行微生物的培养以及利用微生物制造物质的方法。另外。以提供一种利用所述碳源，在工业上高效制造PHA的方法。本发明的发明人通过将月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸分别单独作为碳源使用，培养大肠杆菌，初步地研究了微生物对各脂肪酸的同化性。结果认为，肉豆蔻酸和棕榈酸的同化性均极低，将它们作为碳源利用是极其困难的。另外，月桂酸也未必显示出足够的同化性。因此本发明的发明人进行了锐意研究，以将作为对微生物的同化性不充分的长链脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸，在微生物的培养、利用微生物制造物质中适宜利用。结果，发现含有多种长链脂肪酸的组成物或者长链脂肪酸和油脂的混合组成物， 能极为适宜地利用作为用于微生物的培养及利用微生物制造物质(例如，PHA制造)的碳源， 从而完成了本发明。S卩，本发明是一种微生物的培养方法，包括在包含下述组成物中任意一种的碳源的存在下培养微生物的工序
(1)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少两种脂肪酸的脂肪酸组成物；
(2)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少一种脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率为10重量％以上的混合组成物。优选的是，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少一种以及油酸，
所述混合组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少一种、 油酸以及油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物包含月桂酸和油酸， 所述混合组成物包含月桂酸、油酸和油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物包含棕榈酸和油酸， 所述混合组成物包含棕榈酸、油酸和油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少三种，
所述混合组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少三种以及油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸所构成的组中选择的至少两种以及油酸，
所述混合组成物包括从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少两种、 油酸以及油脂。
优选的是，所述脂肪酸组成物包含月桂酸、棕榈酸和油酸， 所述混合组成物包含月桂酸、棕榈酸、油酸和油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸， 所述混合组成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸和油脂。优选的是，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物中包含的长链脂肪酸中的长链饱和脂肪酸的含有率为20重量％以上。优选的是，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物中包含的长链脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕榈酸的合计含有率为5重量％以上。优选的是，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物的上升熔点为培养温度+10°C 以下。优选的是，所述混合组成物中的脂肪酸的含有率为45重量％以上。优选的是，所述微生物为细菌。优选的是，所述微生物为属于贪铜菌(Cupriavidus)属或者埃希氏菌 (Esherichia)属的微生物。优选的是，所述微生物为属于贪铜菌(Cupriavidus)属的微生物。优选的是，所述微生物为钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)0优选的是，所述微生物为嵌入了如下聚羟基烷酸酯合成酶基因的钩虫贪铜菌，所述聚羟基烷酸酯合成酶基因为
编码序列编号1所表示的氨基酸序列的聚羟基烷酸酯合成酶基因，或者编码相对于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羟基烷酸酯合成活性的多肽的聚羟基烷酸酯合成酶基因。优选的是，所述微生物是属于埃希氏菌属的微生物。优选的是，所述微生物是大肠埃希氏菌。优选的是，所述微生物是酵母。而且，本发明还涉及一种微生物代谢产物的制造方法，该制造方法包括 在包含所述组成物中任意一种的碳源的存在下，培养微生物的工序、以及
回收所培养的所述微生物产生的代谢产物的工序。优选的是，所述微生物代谢产物为聚羟基烷酸酯。优选的是，所述聚羟基烷酸酯为3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚体。通过本发明，使得能够有效利用迄今未必被有效产业利用的长链脂肪酸、尤其是长链饱和脂肪酸。具体地说，通过将所述长链脂肪酸、尤其是所述长链饱和脂肪酸作为微生物能适宜同化的碳源来利用，而使得能够在工业上高效进行微生物的培养及利用微生物制造物质。另外，能够使用所述碳源，在工业上高效地制造PHA。
具体实施例方式以下将详细说明本发明。在微生物的培养以及利用微生物制造物质中，一般葡萄糖和蔗糖等糖类作为碳源被广泛利用。由于这些糖类在水中的溶解度高，因此在通常的培养条件下，其溶解于微生物所生长的培养液等液体中作为碳源的利用效率较高。另一方面，一般，微生物对在水中溶解度低的碳源利用率(同化性)较低。本发明的发明人确认了，在微生物对水中溶解度极低的长链脂肪酸、尤其是长链饱和脂肪酸(其中尤其是肉豆蔻酸和棕榈酸)的同化性非常低。此外，在研究了月桂酸、肉豆蔻酸或者棕榈酸和油脂的混合物的同化性之后，确认了随着混合物中脂肪酸的含量的提高，同化性降低。但是，利用本发明，能够将这些脂肪酸作为碳源极有效地利用。本发明中的碳源包括下列组成物中的任意一种
(1)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少两种脂肪酸的脂肪酸组成物；
(2)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少一种脂肪酸以及油脂，所述脂肪酸的含有率为10重量％以上的脂肪酸-油脂混合组成物。本发明中，通过将同化性低的各种脂肪酸、油酸组合作为碳源使用，能够改善同化性，而且，在使得能够有效利用这些脂肪酸这一点上极有意义。能在所述脂肪酸-油脂混合组成物(2)中使用的油脂并不特别限定，但是优选的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸或者油酸作为构成成分的油脂。具体来说，例如可以列举出来源于棕榈的油脂、来源于椰子的油脂、来源于玉米的油脂、来源于大豆的油脂、来源于油菜籽的油脂、来源于油橄榄的油脂、来源于麻风树的油脂等。从提高同化性同时有效利用脂肪酸的观点上来说，所述脂肪酸-油脂混合组成物 (2)中的脂肪酸的含有率为10重量％以上。优选的是20重量％以上，更优选的是30重量％ 以上，进一步优选的是40重量％以上，尤其优选的是45总量％以上，最优选的是50重量％ 以上。所述含有率的上限并不限定，只要低于100重量％即可。这里，脂肪酸的含有率是指， 脂肪酸(这里的“脂肪酸”的概念是不包含构成所述油脂的脂肪酸)相对于脂肪酸和油脂的合计量的重量比。根据本发明的较佳的一实施方式，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物 (2)包含油酸，并且包含从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少一种。作为长链不饱和脂肪酸的油酸，不仅其自身对微生物的同化性高，而且具有提高作为长链饱和脂肪酸的月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸的同化性的效果。因此，通过将油酸和所述长链饱和脂肪酸并用，不仅能有效利用长链饱和脂肪酸，而且能协同达到高同化性。从有效利用长链饱和脂肪酸的观点上来看，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2 )中，相对于长链脂肪酸(长链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸的合计)，长链不饱和脂肪酸的含有率优选的是20重量％以上，更优选的是30重量％以上，进一步优选的是40 重量％以上，特别优选的是50重量％以上。这里，长链不饱和脂肪酸相对于长链脂肪酸的含有率是指，长链饱和脂肪酸相对于所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)中使用的长链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸的合计量的重量比。另外，在计算所述含有率时， 未考虑构成所述油脂的长链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸。这里，长链饱和脂肪酸是指月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸，长链不饱和脂肪酸是指油酸。更佳的是，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)包括油酸、而且包含月桂酸或者棕榈酸。根据本发明的适宜的其他实施方式，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物 (2)包括从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少三种脂肪酸。更适宜的是，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)包括油酸，并且包括从由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少两种。进一步适宜的是，所述脂肪酸组成物(1) 或者所述混合组成物(2)包括月桂酸、棕榈酸和油酸，尤其适宜的是包含月桂酸、肉豆蔻酸、 棕榈酸以及油酸。特别是从有效利用同化性低的肉豆蔻酸和棕榈酸的观点上看，优选的是所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)包含肉豆蔻酸和/或棕榈酸。在这种情况下，优选的是，所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)中包含的长链脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕榈酸的合计含有率为5重量％以上。更优选的是10重量％以上，进一步优选的是15重量％以上。所述合计含有率的上限并不特别限定，为了进一步提高同化性，70重量％以下优选，65重量％以下更优选，60重量％以下更为优选，55重量％以下尤其优选。根据本发明的适宜的另一种的实施方式，本发明的脂肪酸组成物(1)或者混合组成物(2)的上升熔点为微生物的培养温度+10°C以下。更优选的是微生物的培养温度+9°C 以下，进一步优选的是微生物的培养温度+8°C以下，尤其优选的是微生物的培养温度+7°C 以下。用于工业上的大多数微生物一般生长最适温度是37°C以下。因此，大多数情况下，优选的是，本发明的脂肪酸组成物(1)或者混合组成物(2)的上升熔点为47°C以下。更优选的是46°C以下，进一步优选的是45°C以下，尤其优选的是44°C以下。但是，本发明中使用的组成物的上升熔点并不限于上述温度。可以根据微生物的培养温度适当地设定上升熔点， 选择满足该上升熔点的组成物。上升熔点的下限不特别规定。本发明的发明人明确了长链饱和脂肪酸的上升熔点为，月桂酸约43°C，肉豆蔻酸约52°C，棕榈酸约62°C，作为长链不饱和脂肪酸的油酸的上升熔点为约12°C。根据本发明，通过含有多种上述脂肪酸，能够根据微生物的生长温度适宜地调节组成物的上升熔点，提高对微生物的同化性。即使在上升熔点高的肉豆蔻酸和棕榈酸的情况下，也能适宜地发挥本发明的效果。令人惊讶的是，在培养温度方面，即使是固体状态的组成物也能作为碳源有效利用。本发明中，脂肪酸组成物(1)或者混合组成物(2)的上升熔点可以通过以下的方法进行测定
(1)将两端开口的毛细管(内径1mm、外径2mm以下，长5(T80mm)的一端浸入到完全溶解的试样中，直到试样充满约IOmm的高度，迅速用冰片等固化毛细管内部的试样；
(2)将包含固化的试样的毛细管在10°C以下放置24h或者冰上放置Ih后供试验用；
(3)将毛细管设置在上升熔点测定器(ELEXSCIENTIFIC公司生产的EX-871A)上；
(4)将毛细管浸在装满了比预想熔点低约20°C的温度的水中，使温度计的下端置于水面下30mm的深度；
(5)在以适当的方法搅拌容器中的水的同时，进行加热，使得最开始以2VMn的速度使水温升高；
(6)达到预想熔点10°C下之后，加热使水温以0.5°C /min的加热速度升高；
(7)试样在毛细管中开始上升的温度为上升熔点。本发明的脂肪酸组成物(1)和混合组成物(2)的具体组成根据使用的微生物的种类、微生物产生的物质的种类、培养的各种条件(培养基成分、PH、培养温度等)等而不同，不一定能够统一规定。但是，能够示出几组适宜的组成。适宜的组成之一是，月桂酸含有率30^70重量％、肉豆蔻酸含有率5 30重量％，棕榈酸含有率5 30重量％，油酸含有率10 30 重量％。适宜的组成之一是，月桂酸含有率1(Γ40重量％，肉豆蔻酸(TlO重量％、棕榈酸含有率2(Γ40重量％、油酸3(Γ50重量％。适宜的组成之一是，月桂酸含有率15 45重量％、棕榈酸含有率15 45重量％、油酸含有率2(Γ50重量％。以上的含有率的数值是表示相对于组成物中包含的脂肪酸(这里的“脂肪酸”的概念是不包含构成所述油脂的脂肪酸)的合计量的比例。混合组成物(2)是除去油脂后的含有率。但是，上述组成终究是适宜的组成的例子，本发明并不限于上述组成。另外，上述组成物也可以根据需要而增加油脂。本发明的包含脂肪酸组成物(1)或者混合组成物(2)的碳源，也可以还含有其他的脂肪酸、糖类、蛋白质、氨基酸等。作为通过本发明培养微生物使微生物产生的代谢物，例如可以列举出乙醇、丁醇、 丙醇等醇类、乳酸、醋酸、氨基酸、核酸等酸类、脂质类、油脂类或聚羟基烷酸酯(PHA)等。PHA 是很多微生物种的细胞中作为能量贮藏物质而产生、贮藏的热塑性聚酯，具有生物降解性。 现在由于环保意识的提高，非石油来源的塑料受到关注。尤其是，微生物菌体内生成、贮藏的PHA由于能进入自然界的碳循环，因此预计对生态系统的不良影响较小，期望其实用化。 因此，PHA是使用本发明生产的物质的很好的示例之一。作为PHA的种类，只要是微生物产生的PHA即可，并不特别限定。优选的是从碳数 ri6的3-羟基烷酸中选择的一种单体聚合形成的PHA、从碳数Γ16的3-羟基烷酸中选择的两种以上的单体共聚形成的共聚PHA。例如，可以列举出由碳数4的3-羟基烷酸形成的聚羟基丁酸酯(PHB)、碳数4和6的3-羟基烷酸构成的聚羟基丁酸己酸(PHBH)、碳数4和5 的3-羟基烷酸所构成的聚羟基丁酸戊酸酯(PHBV)、碳数Γ14的3-羟基烷酸所构成的聚羟基烷酸酯(PHA)。作为本发明的微生物的培养以及利用微生物制造有用物质中使用的微生物，并不特别限定，可以适宜地使用从天然分离的微生物、基因操作过的微生物等。具体来说， 优选使用青枯菌(Ralstonia)属、贪铜菌(Cupriavidus)属，沃特氏菌(Wautersia)属、 气单胞菌(Aeromonas)属、埃希氏菌(Escherichia)属、产碱杆菌(Alcaligenes)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、芽胞杆菌(Bacillus)属、固氮菌(Azotobacter)属、诺卡氏菌 (Nocardia)属、鞘脂单胞菌(Sphingomonas)属、丛毛单胞菌(Comamonas)属等的细菌类，酵母(Saccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、假丝酵母(Candida)属等的酵母类。当然，也可以使用对所述微生物进行人工突变处理得到的变异株及通过基因工程的方法变异处理的菌株。作为制造PHA中使用的微生物，例如可以列举出钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)等贪铜菌属、广泛产碱杆菌(Alcaligenes latas)等产碱杆菌属、恶臭假单胞 lif (Pseudomonas putida)、iMftfx^-MM (Pseudomonas f luorescens)> 參录月农单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、食树月旨假单胞菌(Pseudomonas resinovorans)、食油假单胞 |if (Pseudomonas oleovorans) ^jix-^-lfi |1 Μ> lEL^v^lfilf lif (Bacillus megaterium)等芽胞杆菌属、固氮菌属、诺卡氏菌属、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、嗜水气单胞菌 (Aeromonaso hydrophila)等气单胞菌属、青枯菌(Ralstonia)属、沃特氏菌(Wautersia) 属、丛毛单胞菌(Comamonas)属等(Microbiological Reviews,450-472 项，1990 年)。也可以通过使用基因工程的方法导入PHA合成酶基因等，人为实施使之生产PHA的改良的生物细胞。也可以利用例如埃希氏菌(Esherichia)属等革兰氏阴性细菌、芽胞杆菌(Bacillus) 属等的革兰氏阳性细菌、酵母(Saccharomyces)属、亚罗酵母(Yarrowia)属、假丝酵母 (Candida)属等的酵母类，植物等的高等生物细胞，但是从能够储存大量PHA这一点上看， 优选使用微生物。在生产作为PHA的一种的3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚体(PHBH)中，可以使用例如豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌等本身生产PHBH的微生物，也可以使用通过对本身不生产PHBH的微生物使用基因工程的方法、导入聚羟基烷酸酯合成酶基因，而人为施加了使之生产PHBH的改良的生物细胞。作为导入基因的宿主微生物，例如可以适宜使用钩虫贪铜菌。另外，作为聚羟基烷酸酯合成酶基因，可以使用来源于豚鼠气单胞菌、嗜水气单胞菌的聚羟基烷酸酯合成酶基因或者其改良体。作为改良体，可以使用编码在天然的聚羟基烷酸酯合成酶中缺失、添加、插入或者置换了氨基酸残基的聚羟基烷酸酯合成酶的碱基序列。具体来说，可以使用嵌入了如下聚羟基烷酸酯合成酶基因的钩虫贪铜菌，所述聚羟基烷酸酯合成酶基因为编码序列编号1中表示的氨基酸序列的聚羟基烷酸酯合成酶基因，或者编码相对于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羟基烷酸酯合成活性的多肽的聚羟基烷酸酯合成酶基因。在利用本发明培养微生物时，使用在培养基中添加碳源的方法。关于培养基组成、 碳源的添加方法、培养规模、通气搅拌条件和培养温度、培养时间，根据培养的微生物的种类适当决定即可，并不特别限定。优选的是连续或者间歇性地添加碳源。本发明中的碳源可以在添加到培养基中时已经是混合组成物，也可以是分别添加各组成成分，在培养基内
混合ο本发明的PHA等微生物代谢产物的制造方法只要是通过上述培养方法使微生物内储存微生物代谢产物，此后，再使用公知的方法从菌体内回收微生物代谢产物即可。在微生物代谢产物是PHA的情况下，例如，可以通过以下的方法进行。培养结束后，从培养液中用离心分离机等分离菌体，将该菌体用蒸馏水和甲醇等有机溶剂洗净、干燥。从该干燥菌体中用氯仿等有机溶剂提取PHA。从该含有PHA的溶液中利用过滤等除去菌体成分，在滤液中加入甲醇、己烷等弱溶剂，使PHA沉淀。接着，在利用过滤、离心分离除去上清液之后，可以干燥并回收PHA。本发明的发明人确认了本发明在2. 5L规模的培养下能够适宜实施，而且在 16000L以上的规模也能适宜地再现。该5000倍以上的放大的实现，意味着在较大工业规模中的制造中，适宜地并且最大限度地发挥了本发明的效果。在本发明中，将所述脂肪酸组成物(1)或者所述混合组成物(2)作为碳源使用而带来的同化性提高是指，由于含有多种难以同化的长链饱和脂肪酸(月桂酸、肉豆蔻酸或者棕榈酸)，或者含有难以同化的所述长链饱和脂肪酸和容易同化的长链不饱和脂肪酸(油酸)，与将其单独使用的情况相比，难以同化的所述长链饱和脂肪酸的同化性提高的意思。 或者，由于含有难以同化的所述长链饱和脂肪酸和油脂，与将其单独使用的情况相比，难以同化的所述长链饱和脂肪酸的同化性提高的意思。另外，本发明中，同化性的提高是指，每小时的碳源的消耗量增加，结果微生物菌体的产量和微生物产生的物质的产量增加的意 )思ο
微生物菌体的产量可以通过吸光度法、干燥菌体重量测定法等公知的方法测定。 微生物产生的物质的产量可以通过GC法、HPLC法等公知的方法测定。细胞中贮藏的PHA的含量，可以按照加藤等的方法(Appl. MicroBiol. Biotechnol.，第45卷，第363页，(1996); Bull. Chem. Soc.，第69卷，第515页(1996))，用氯仿等有机溶剂从培养细胞提取、干燥细胞中贮藏的PHA来进行测定。实施例
以下，通过实施例进一步具体说明本发明。但是，本发明并不限于这些实施例。各组成物的上升熔点利用前面述及的方法算出。(实施例1)大肠杆菌的培养
使用各种碳源，培养E. coli HBlOl株(宝生物公司(夕力才社)生产)。作为预培养基使用LB培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨(Bact0-trypt0ne)，5g/L细菌用酵母抽提物(Bacto-yeast extract), 5g/L NaCl)。生长试验中使用 M9 培养基(6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,0. 5g/L NaCl, lg/L NH4Cl, ImM MgSO4,0. OOlw/v% 硫胺，0. ImM CaCl2)。将大肠杆菌(Ε. coli)的甘油菌(glycerol stock)在预培养基上接种，于37°C培养12小时，进行预培养。之后，将预培养液以2v/v%的浓度接种在加入了 50ml的M9培养基的500ml用的坂口摇瓶(Sakaguchi flask)中。接着，作为碳源，将表1所示的各种脂肪酸组成物以0. 25w/v%的浓度加入到坂口摇瓶中，在37°C振荡培养96小时。碳源一并添加到坂口摇瓶内。培养结束后，通过离心分离回收菌体，用甲醇洗净后，冷冻干燥，测定干燥菌体重量。结果示于表1。表1
权利要求
1.一种微生物的培养方法，包括在包含下述组成物中任意一种的碳源的存在下培养微生物的工序，(1)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少两种脂肪酸的脂肪酸组成物，(2)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少一种脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率为10重量％以上的混合组成物。
2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、 肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少一种以及油酸，所述混合组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少一种、 油酸以及油脂。
3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含月桂酸和油酸，所述混合组成物包含月桂酸、油酸和油脂。
4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含棕榈酸和油酸，所述混合组成物包含棕榈酸、油酸和油脂。
5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少三种，所述混合组成物包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少三种以及油脂。
6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含从由月桂酸、 肉豆蔻酸、棕榈酸所构成的组中选择的至少两种以及油酸，所述混合组成物包括从由月桂酸、肉豆蔻酸和棕榈酸所构成的组中选择的至少两种、 油酸以及油脂。
7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含月桂酸、棕榈酸和油酸，所述混合组成物包含月桂酸、棕榈酸、油酸和油脂。
8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物包含月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸，所述混合组成物包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、油酸和油脂。
9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物中包含的长链脂肪酸中的长链饱和脂肪酸的含有率为20重量％以上。
10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物中包含的长链脂肪酸中的肉豆蔻酸和棕榈酸的合计含有率为5重量％以上。
11.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述脂肪酸组成物或者所述混合组成物的上升熔点为培养温度+10°C以下。
12.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述混合组成物中的脂肪酸的含有率为45重量％以上。
13.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述微生物为细菌。
14.根据权利要求13所述的培养方法，其特征在于，所述微生物为属于贪铜菌属或者埃希氏菌属的微生物。
15.根据权利要求14所述的培养方法，其特征在于，所述微生物为属于贪铜菌属的微生物。
16.根据权利要求15所述的培养方法，其特征在于，所述微生物为钩虫贪铜菌。
17.根据权利要求16所述的培养方法，其特征在于，所述微生物为嵌入了如下聚羟基烷酸酯合成酶基因的钩虫贪铜菌，所述聚羟基烷酸酯合成酶基因为编码序列编号1所表示的氨基酸序列的聚羟基烷酸酯合成酶基因，或者编码相对于所述氨基酸序列具有85%以上的序列一致性、而且具有聚羟基烷酸酯合成活性的多肽的聚羟基烷酸酯合成酶基因。
18.根据权利要求14所述的培养方法，其特征在于，所述微生物是属于埃希氏菌属的微生物。
19.根据权利要求18所述的培养方法，其特征在于，所述微生物是大肠埃希氏菌。
20.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述微生物是酵母。
21.—种微生物代谢产物的制造方法，所述制造方法包括在包含下列组成物中任意一种的碳源的存在下培养微生物的工序、以及回收所培养的所述微生物产生的代谢产物的工序，(1)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少两种脂肪酸的脂肪酸组成物，(2)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和油酸所构成的组中选择的至少一种脂肪酸以及油脂、所述脂肪酸的含有率为10重量％以上的混合组成物。
22.根据权利要求21所述的制造方法，其特征在于，所述微生物代谢产物为聚羟基烷 酸酯。
23.根据权利要求22所述的制造方法，其特征在于，所述聚羟基烷酸酯为3-羟基丁酸和3-羟基己酸的共聚体。
全文摘要
将迄今为止未必被有效产业利用的长链脂肪酸作为碳源来利用，在工业上高效进行微生物的培养以及利用微生物制造物质。在包含下列组成物中任意一种的碳源的存在下，培养微生物；(1)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸以及油酸所构成的组中选择的至少两种脂肪酸的脂肪酸组成物；(2)包含从由月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸以及油酸所构成的组中选择的至少一种脂肪酸和油脂、所述脂肪酸的含有率为10重量%以上的混合组成物。
文档编号C12P7/62GK102325883SQ20108000773
公开日2012年1月18日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者佐藤俊辅, 藤木哲也 申请人:株式会社钟化