专利名称：制备2-酮羧酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用发酵步骤来制备2-酮羧酸，特别是2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法。
背景技术：
2-酮羧酸是用于制药的化合物，并且用于合成除草剂和杀真菌剂。已知2-酮羧酸降低血浆中的LDL胆固醇、甘油三酯和自由基水平。特别地，2-酮异戊酸用作肾衰竭患者的食物补充剂。本领域中已知通过化学合成来制备2-酮羧酸，例如2-酮异戊酸(盐)。例如，在以下两步骤中通过化学合成制备2-酮异戊酸盐使用CrO3将各自的2-羟基异戊酸乙酯氧化，随后将该酯皂化以获得2-酮异戊酸盐。该方法存在使用高温、有毒的CrO3和各种对环境有危险的溶剂的缺点。在生物合成中，2-酮羧酸是用于各自的氨基酸的直接前体例如2-酮异戊酸是氨基酸缬氨酸的直接前体。在微生物中，2-酮异戊酸盐在细胞中产生并分泌至培养基中。 在现有技术中描述了 2-酮酸用作前体通过发酵来制备各自的氨基酸(GB 2，161，159 ；GB 2，147，579)。尽管文献中已知微生物产生2-酮羧酸如2-酮异戊酸(盐)，但目前没有描述通过利用发酵以高纯度制备和分离2-酮羧酸的方法，而仅提及2-酮羧酸作为制备氨基酸的中间产物或离析物。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备2-酮羧酸，特别是2-酮异戊酸(盐)、2_酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的方法，所述方法避免了化学合成的缺点。这一问题通过制备2-酮羧酸或其盐的方法得到了解决，所述2-酮羧酸具有通式 (I)R1-CO-COOH,其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液(culture broth)；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行选自离子交换、提取过程和蒸馏过程的一个或多个步骤。在本发明的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换；c)优选地将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、提取或蒸馏的一个或多个进一步的纯化步骤；d)优选地将步骤C)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶步骤或者它们的组合并获得2-酮羧酸或其盐。在本发明的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)发酵培养液的初始pH变化(酸化至pH值为1)后，将步骤a)中获得的发酵培养液仅进行蒸馏过程(加入水进行蒸汽蒸馏直至蒸馏池完全蒸干(impoverishment))。该实施方案避免使用离子交换处理。令人惊讶地发现，利用这一步骤可以从发酵培养液中完全选择性地除去酮酸，而其它有机酸则保留在蒸馏池中。在优选的方法中，2-酮羧酸是具有通式R1-CO-COOH的化合物或其盐，其中R1是具有3、4或5个碳原子的支链烷基。进一步优选地，R1选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基。甚至更优选地，R1选自异丙基、异丁基、仲丁基。在特别优选的方法中，2-酮羧酸为2-酮异戊酸或其盐。在本发明另一优选实施方案中，步骤a)中获得的培养液包含至少10g/l、优选至少15g/l、和更优选至少20g/l、并且最优选至少40g/l的2-酮羧酸或其盐，所述2-酮羧酸优选2-酮异戊酸。进一步优选地，用于发酵步骤的微生物具有提高的产生通式(I)的化合物的能力，所述通式(I)的化合物优选为选自2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它们的混合物。优选地，用于发酵步骤的微生物为棒杆菌(Corynebacterium)，其具有提高的产生2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和/或2-酮-3-甲基戊酸的能力，所述棒杆菌特别优选为谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。使用一种或多种蛋白下调或缺陷的棒杆菌菌株是特别有用的，所述蛋白例如转氨酶B (E. C. 2. 6. 1. 42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E. C. 2.6. 1.66，由avtA-基因编码)或丙氨酸转氨酶 (E. C. 2. 6. 1. 2，由alaT-基因编码)。此外，使用一种或多种蛋白下调或缺陷的棒杆菌菌株是有用的，所述蛋白例如丙酮酸脱氢酶的El亚基(E. C. 1. 2. 4. 1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E. C. 1. 2. 2. 2，由pqo基因编码)、葡糖磷酸异构酶(E. C. 5. 3. 1. 9，由pgi 基因编码)。为了获得良好的产率，棒杆菌菌株在所提及的基因产物中的一些、所有或者所述基因产物的组合中是下调或缺陷的。aceE的基因产物催化丙酮酸向乙酰辅酶A的反应。 ilvE的基因产物催化2-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转氨反应，其将1摩尔的谷氨酸转化成α -酮戊二酸)。avtA的基因产物催化2-酮异戊酸转氨成氨基酸缬氨酸(每个转氨反应，其将1摩尔的丙氨酸转化成丙酮酸)。alaT基因的基因产物催化从丙酮酸向丙氨酸的反应。pqo的基因产物催化从丙酮酸向乙酸的反应。Pgi的基因产物催化从葡糖-6-磷酸向果糖-6-磷酸的反应。此外，棒杆菌菌株可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因 ilvBN(编码乙酰羟酸合酶的基因，E. C. 4. 1. 3. 18)、ilvC(编码乙酰羟酸还原异构酶的基因，E. C. 1. 1. 1.86)和 ilvD(编码二羟基酸脱水酶的基因，E. C. 4. 2. 1.9)。ilvBN、ilvC 和 ilvD基因编码代表从丙酮酸向2-酮异戊酸的代谢途径的酶。对于酮甲基戊酸盐的产生， 棒杆菌菌株还可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因ilvA(编码苏氨酸
5脱水酶的基因，Ε. C. 4. 2. 1. 16)、hom (编码高丝氨酸脱氢酶的基因，Ε. C. 1. 1. 1.3)、thrB (编码高丝氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 1. 39)、thrC(编码苏氨酸合酶的基因，E. C. 4. 2. 3. 1)、 lysC(编码天冬氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 2. 4)、天冬氨酸转氨酶(aat，Ε. C. 2. 6. 1. 1)、 天冬氨酸半酸脱S酶(aspartate semialdehyse dehydrogenase) (asd, Ε. C. 1. 2. 1. 11)、 丙酮酸羧化酶(pyc，Ε. C. 6. 4. 1. 1)。对于酮异己酸盐的产生，棒杆菌菌株还可以过表达任意一种或多种或者所有下述优选内源基因=IeuA(编码2-异丙基苹果酸合酶的基因 (E. C. 2. 3. 3. 13)、IeuB (3-异丙基苹果酸脱氢酶，E. C. 1. 1. 1. 85)、IeuCD (3-异丙基苹果酸脱水酶，E. C. 4. 2. 1. 33)。在特别优选的实施方案中，棒杆菌菌株的基因型为Δ-aceE、Δ-ilvE，并过表达基因ilvBN、ilvC和ilvD，并且用于制备2-酮异戊酸。除棒杆菌之外，其它细菌菌株、酵母和真菌微生物能够用于本发明的发酵过程，所述微生物例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、短杆菌 (Brevibacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)。在进一步优选的实施方案中，在将培养液进行离子交换步骤(b)之前，进行从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片的额外步骤，其中所述除去步骤优选通过过滤、离心或沉降、或者所述方法的组合来进行。重组技术是本领域技术人员已知的。下表包含所用基因的登录号。
权利要求
1.一种制备2-酮羧酸或其盐的方法，所述2-酮羧酸具有通式(I) R1-CO-COOH,其中R1 为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行选自离子交换、提取过程和蒸馏过程的一个或多个步骤；c)将步骤b)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶或者它们的组合并获得2-酮羧酸或其盐。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行蒸馏过程，其伴有所述发酵培养液的PH值变化。
3.如权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、 提取或蒸馏的一个或多个进一步纯化步骤。
5.如权利要求1、3和4所述的方法，所述方法包括以下步骤a)发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液；b)将步骤a)中获得的发酵培养液进行离子交换；和c)将步骤b)中获得的流出物进行选自离子交换、提取或蒸馏的一个或多个进一步纯化步骤；以及d)将步骤c)中获得的产物进行进一步浓缩、沉淀或结晶步骤或者它们的组合并获得 2-酮羧酸或其盐。
6.如权利要求1-5所述的方法，其中R1为具有3、4或5个碳原子的支链烷基，优选地， R1选自异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、2-甲基-丁基、3-甲基丁基，优选异丙基、异丁基、 仲丁基。
7.如权利要求1-5所述的方法，其中所述2-酮羧酸为2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸、2-酮-3-甲基戊酸或它们的盐。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在步骤a)中获得的培养液包含至少 10g/l、优选至少15g/l、更优选至少20g/l、并且最优选至少40g/l的2-酮羧酸或其盐。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述用于发酵步骤的微生物具有提高的产生通式(I)的化合物的能力，所述通式(I)的化合物优选为选自2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸和2-酮-3-甲基戊酸的化合物或它们的混合物。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述用于发酵步骤的微生物为棒杆菌 (Corynebacterium)，优选谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述棒杆菌菌株在选自以下组中的任何一种或多种或者所有蛋白中是缺陷或下调的转氨酶B(E. C. 2. 6. 1. 42，由ilvE-基因编码)、缬氨酸-丙酮酸转氨酶AvtA(E. C. 2. 6. 1.66，由avtA-基因编码)、丙氨酸转氨酶AlaT(E. C. 2.6. 1.2，由alaT-基因编码)、丙酮酸脱氢酶的El亚基(E. C. 1.2.4. 1，由aceE基因编码)、丙酮酸醌氧化还原酶(E.C. 1.2. 2.2，由pqo基因编码)和葡糖磷酸异构酶(Ε. C. 5. 3. 1. 9，由 pgi 基因编码)。
12.如权利要求10和11所述的方法，其中在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自以下组的基因是过表达的乙酰羟酸合酶，Ε. C. 4. 1.3. 18)、ilvC(编码乙酰羟酸还原异构酶的基因，E. C. 1. 1. 1.86)和ilvD (编码二羟基酸脱水酶的基因，E. C. 4. 2. 1.9) 2-酮异戊酸，并产生2-酮异戊酸。
13.如权利要求10和11所述的方法，其中在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自以下组的基因是过表达的ilvA(编码苏氨酸脱水酶的基因，E. C. 4. 2. 1. 16)、hom(编码高丝氨酸脱氢酶的基因，E. C. 1. 1. 1.3)、thrB(编码高丝氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 1.39)、thrC (编码苏氨酸合酶的基因，E. C. 4. 2. 3. 1)、IysC (编码天冬氨酸激酶的基因，E. C. 2. 7. 2. 4)、天冬氨酸转氨酶(aat，E. C. 2. 6. 1. 1)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd，E. C. 1. 2. 1. 11)和丙酮酸羧化酶(pyc, E. C. 6. 4. 1. 1)，并产生酮甲基戊酸盐。
14.如权利要求10和11所述的方法，其中在所述棒杆菌菌株中，一种或多种选自包括以下基因的组的基因是过表达的leuA(编码2-异丙基苹果酸合酶的基因 (E. C. 2. 3. 3. 13)、IeuB (3-异丙基苹果酸脱氢酶，E. C. 1. 1. 1. 85)和IeuCD (3-异丙基苹果酸脱水酶，E. C. 4. 2. 1. 33)，并产生酮异己酸盐。
15.如权利要求1和3-14中任一项所述的方法，其中在将所述培养液进行离子交换步骤(b)之前，进行从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片的额外步骤，其中所述除去步骤优选通过过滤、离心或沉降、或者所述方法的组合来进行。
16.如权利要求15所述的方法，其中在从所述培养液除去细胞和/或细胞碎片之后和在步骤b)之前，使用离子交换树脂或活性炭进行预纯化。
17.如权利要求1和3-16中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，使用阳离子树脂进行离子交换。
18.如权利要求1和3-17所述的方法，其中在步骤c)中，将阴离子树脂用于离子交换。
19.如权利要求1和3-17中任一项所述的方法，其中步骤c)的蒸馏为蒸汽蒸馏。
20.如权利要求18所述的方法，其中在10-100°C、优选20-75°C、更优选25-70°C、并且甚至更优选35-65°C的温度下进行所述蒸馏。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中在10-100mbar、优选20_80mbar、更优选 20-65mbar、并且特别优选20-25mbar的压力下进行所述蒸馏。
22.如权利要求1和5-20中任一项所述的方法，其中在步骤d)的沉淀和结晶步骤中， 以选自Ca2+、Mg2+、Na+、K+的盐的形式或者与氨基酸的盐的形式获得所述2_酮羧酸。
23.通过权利要求1至21中任一项所述的方法获得的权利要求1-7中任一项所定义的2-酮羧酸或其盐，优选2-酮异戊酸、2-酮-4-甲基戊酸或2-酮-3-甲基戊酸或它们的盐，其纯度大于60重量％，优选大于85重量％，特别优选大于90重量％。
全文摘要
本发明涉及一种制备2-酮羧酸或其盐的方法，所述2-酮羧酸具有通式R1-CO-COOH，其中R1为具有3-7个碳原子的支链烷基，所述方法包括发酵步骤，其中使微生物在培养基中生长以提供包含2-酮羧酸或其盐的培养液。
文档编号C12P7/50GK102459621SQ201080024741
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月10日 优先权日2009年6月5日
发明者A·卡劳, N·莫兰, R·格斯特迈尔 申请人:赢创德固赛有限公司