专利名称：双链核糖核酸的聚离子复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及双链核糖核酸的聚离子复合物，具体涉及核糖核酸的体内递送，更具体地涉及用于核糖核酸药物的药物递送系统。
背景技术：
由于其强有力的基因沉默能力，利用双链短干扰RNA (siRNA)的RNA干扰不仅作为研究工具、而且作为治疗对策也是非常有前途的(非专利文献1至4)。然而，在体内应用siRNA 仍然局限于局部递送(非专利文献5至8)。该局限性可归因于由于体内的酶促降解造成的 siRNA的低稳定性，和/或细胞膜的低渗透性。虽然开发递送载体将可能使siRNA能够明确地通过全身性施用而导入靶组织内，但是关于利用siRNA对肾脏疾病的功效的递送系统仅可获得极少数报道。脂类接合的siRNA (非专利文献9)或脂质体封装的siRNA (非专利文献10)已表现出在肝脏中积累，并沉默靶基因；然而，siRNA的肾脏分布被认为不过是观察到肾小管细胞中的降解过程、或者向管腔中的排泄过程。以固有细胞(resident cell)响应血液动力学或免疫学紊乱而分泌多种病原性因子为特征的肾小球是用于分子治疗的合理靶标。然而， 单独的siRNA (若干纳米长的小分子)被快速排泄到尿液中，而上述脂类接合的siRNA或脂质体封装的siRNA由于其尺寸(数百纳米)和特征难以递送至作为肾小球中结缔组织的系膜细胞等。针对对于肾脏疾病的有效药物的低可得性这一背景，需要开发适于肾小球靶向的利用siRNA的基因沉默的递送系统。本发明人之前报道了与嵌段共聚物的聚离子复合物可用作带电蛋白质和DNA的递送系统(专利文献1)。本发明人还研究了嵌段共聚物的结构、和制备特别适合递送双链寡核酸的聚离子复合物的方法，并报道了携带形式为高分子胶束的双链寡核酸的嵌段共聚物 (专利文献2)。还报道了具有以梳状形式与聚阳离子化合物结合的亲水基作为侧链的载体 (接枝共聚物)和RNA的复合物改善RNA在血液中的稳定性和保留性(专利文献3)。专利文献1和2中描述的核酸递送系统预期确保在体内向各种组织稳定的递送，并且是具有数十至数百纳米的尺寸分布的高分子胶束。专利文献3中描述的复合物表现出强效地抑制肝脏中的基因表达，但未描述向肾脏区域的递送。现有技术文献专利文献
专利文献 1 JP-B-2690276 专利文献 2 :W02005/078084 专利文献 3 JP-A-2008-201673。非专利文献
非专利文献 1 :Gewirtz, A.M. 2007. J. Clin. Invest. 117:3612-3614 非专利文献2 :Akhtar, S·，和Benter, I. F. 2007. J Clin. Invest. 117:3623-3632 非专利文献 3:Blow, N. 2007. Nature. 450:1117-1120
非专利文献 4:Kim, D. H.，和 Rossi, J. J. 2007. Nat. Rev. Genet. 8:173-184非专利文献 5 Savaskan, N. E.，等人，2008. Nat. Med. 14:629-632 非专利文献 6 :Palliser, D·，等人，2006. Nature. 439:89-94 非专利文献 7 :Thakker, D. R.，等人，2004. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 101:17270-17275
非专利文献 8 =Bitko, V.，Musiyenko, Α.，Shulyayeva, 0.，和 Barik, S. 2005. Nat. Med. 11:50-55
非专利文献 9 :Soutschek, J.，等人 2004. Nature. 432:173-178 非专利文献 10 :Zimmermann, Τ. S.，等人 2006. Nature. 441:111-114。发明内容发明要解决的问题
本发明是考虑上述问题而开发的，并且意在提供用于向组织或细胞递送双链核糖核酸的递送系统等，所述核糖核酸在肾小球、特别是系膜细胞等中的基因沉默中发挥作用。解决向题的手段
本申请发明人进行了广泛的研究，以解决上述问题，并发现通过在规定条件下混合双链核糖核酸和具有特定聚阳离子结构的嵌段共聚物，在不形成高分子胶束的情况下产生平均粒径小于100 nm的更小尺寸的聚离子复合物，然后，使用此类聚离子复合物，第一次成功地将双链核糖核酸有效递送至肾小球细胞，从而开发了本发明。因此，本发明如下
(1)非高分子胶束形式的聚离子复合物，所述复合物由静电结合在一起的双链核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物组成，其中，如通过动态光散射测量方法测量的， 聚离子复合物具有小于100 nm的平均粒径
权利要求
1.非高分子胶束形式的聚离子复合物，所述复合物由静电结合在一起的双链核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物组成，其中，如通过动态光散射测量方法测量的， 所述聚离子复合物具有小于100 nm的平均粒径
2.根据权利要求1的聚离子复合物，其中所述双链核糖核酸是siRNA。
3.根据权利要求1或2的聚离子复合物，其具有小于50nm的平均粒径。
4.根据权利要求1至3的任一项的聚离子复合物，其具有10nm至小于20 nm的平均粒径。
5.药物组合物，其包含根据权利要求1至4的任一项的聚离子复合物和药学上可接受的载体。
6.根据权利要求5的药物组合物，其被递送至肾小球或系膜细胞。
7.根据权利要求5或6的药物组合物，其用于治疗或预防病理状况主要发生在系膜中的肾脏疾病。
8.用于制备聚离子复合物纳米载体的试剂盒，所述纳米载体用于递送双链核糖核酸， 所述试剂盒由容纳在分开容器中的下列通式(I)或(II)表示的嵌段共聚物、和用于溶解所述嵌段聚合物和/或双链核糖核酸的试剂组成
9.根据权利要求8的试剂盒，其进一步包括容纳双链核糖核酸的容器。
10.根据权利要求8或9的试剂盒，其进一步包括说明书，所述说明书陈述所述嵌段共聚物和所述双链核糖核酸按Ν/Ρ = 1. 2至1. 5的比例混合，N表示所述嵌段共聚物中的阳离子总数，P表示所述双链核糖核酸中的磷酸酯键或等价键的总数。
11.根据权利要求8至10的任一项的试剂盒，其用于递送至肾小球或系膜细胞。
12.用于治疗或预防肾脏疾病的方法，其包括将根据权利要求5至7的任一项的药物组合物施用至需要的对象的步骤。
13.根据权利要求12的方法，其中所述肾脏疾病是主要由系膜病理学表征的肾脏疾
全文摘要
本发明提供了用于递送双链核糖核酸到组织或细胞等中的递送系统，所述双链核糖核酸在肾小球、特别是在系膜细胞等中发挥基因沉默功能。非高分子胶束形式的聚离子复合物由静电结合在一起的双链核糖核酸和下列式(I)或(II)表示的嵌段共聚物组成，其中，如通过动态光散射测量方法测量的，所述聚离子复合物具有小于100nm的平均粒径，其中每个符号如说明书中所定义。
文档编号C12N15/09GK102449152SQ20108002394
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者堀雄一, 大庭诚, 宫田完二郎, 松本悟, 清水英树, 片冈一则, 藤田敏郎, 西山伸宏, 要伸也 申请人:国立大学法人东京大学