专利名称：具有高不饱和脂肪酸含量的甘油三酯的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂质的技术领域。其涉及通过使用脂肪酶制造甘油酯。更具体而言，本发明涉及用于从回收的级分产生不饱和甘油三酯的方法。
背景技术：
已知具有高水平饱和脂质的饮食会升高血液胆固醇，并增加心血管疾病的风险。 因此，期望在消费产品(consumer product)中减少饱和脂质的量,并增加不饱和脂质的量。已经发表了描述通过酶法催化制造甘油三酯以获得不饱和脂质的数篇报道。具体而言，在鱼油领域W0 95/24459 (Norsk Hydro A/S)描述了应用于鱼油的方法，其中将富含具有多不饱和脂肪酸如EPA、DHA和AA的甘油酯的级分与具有饱和脂肪酸和单不饱和甘油酯的级分分离。他们并未将级分重新组合以形成甘油三酯，而是继续进行醇解，直至基本上全部脂肪酸得到酯化。US 6，905，850 B2 (Nippon Suisan Kaisha, Ltd)也涉及鱼油。其描述了产生甘油三酯的方法，所述甘油三酯在2-位具有多不饱和脂肪酸，并在1-和3-位为具有8、10和12个碳原子的中等链饱和脂肪酸残基。从海洋n-3PUFA和甘油产生甘油三酯的方法由 Kosugi 和 Azuma 1994 (Synthesis of triacylclycerol from polyunsaturatedfatty acid by immobilized lipas. JAOCS Vol. 71 no. 12)提出,其中纯的游离脂肪酸或其乙酯与甘油在脂肪酶催化的缩合反应中反应。他们实现了高PUFA甘油三酯含量。多数制造方法基于修饰起初含有一定量的终产物所需脂肪酸残基的脂质。酶法修饰这些脂质以生成混合物，从该混合物可分离含有中间或终产物的所需级分。因此，终产物产率和生产成本受脂质原料的高度影响。此外，取决于脂质原料，可能残留多种量和/或级分未受利用。Hemandez-Martin 和 Otero (2009)，J. Agric. Food Chem. ,57, pp. 701-708 公开了
从构成大豆油的三酰基甘油选择性消除饱和脂肪酸残基，接着用从他处获得的共轭亚油酸(CLA)重新酯化由此获得的单酰基甘油和二酰基甘油。这导致基本上不含饱和脂肪酸并富含关键不饱和脂肪酸的脂质。然而，该反应设定依存于从其他来源供应的CLA，这显著增加了产生的脂质的成本。相应地，仍有对开发有效且更廉价的、通过减少饱和脂质含量修饰甘油三酯并由此获得具有增加量的不饱和脂质的消费品的方法的需求。
发明内容
本发明涉及用于产生甘油三酯产物的方法，包括下述步骤(a)对包含基于甘油三酯中酰基基团的总量为至少25摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基的甘油三酯原料用具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇进行醇解反应以获得反应混合物，其中转化率为至少65%; (b)从步骤(a)中产生的反应混合物分离包含下述的级分(i)不饱和C18脂肪酸烷基酯和(ii)甘油酯；和(C)在由脂肪酶催化的缩合反应中使用级分(i)和(ii)或其亚级分以产生包含至少80摩尔％不饱和脂肪酸的甘油三酯产物。
此种方法的一个优点是对甘油三酯原料非常有效的使用。从步骤(C)获得的甘油三酯产物可用于供人摄食的产物，并在此类产物中具有比甘油三酯原料更高的价值。且可使用作为副产物获得的饱和脂肪酸烷基酯，例如作为燃料。此外，该方法可无需进一步供应来自其他来源的不饱和脂肪酸而进行。
具体实施例方式如下定义的术语以大写字母显示，并以字母顺序列出。醇解(ALC0H0LYSIS)是指醇和甘油酯(如油或脂肪)之间的反应。如果该醇是乙醇，所述醇解也可称为乙醇解，如果使用的是甲醇，则所述醇解也可称为“甲醇解”，等等。缩合(C0NDESATI0N)定义为酯和甘油之间的反应，其中形成醇和甘油酯。
转化率(CONVERSION)定义为原材料的甘油酯结构中的脂肪酸的摩尔分数，所述原材料已通过酶催化反应而进行了反应。该值可用摩尔(mol)来量度。对于甘油酯与乙醇的转酯作用(transesterification):转化率=FAEE/FAIG,其中FAEE =反应后脂肪酸乙酯的摩尔数，而FAIG=反应前甘油酯中的脂肪酸摩尔数。对于甘油酯的水解转化率=(FFAg* -FFA ) /FAIG,其中FFA=反应后游离脂肪酸的摩尔数,FFA =反应前原材料中的游离脂肪酸摩尔数，而FAIG =反应前甘油酯中的脂肪酸摩尔数。酯化(ESTERIFICATION)是脂肪酸和醇之间的反应，得到酯和水。水解(HYDROLYSIS)是酯和水之间的反应，是酯化的逆反应。脂肪酸馏出物(FATTY ACID DISTILLATE)是在对甘油三酯油进行真空提馏(vacuum stripping)的过程中由蒸汽洗漆(vapour scrubbing)方法所得的冷凝物,其中真空提馏用于物理去除游离脂肪酸，以及对甘油三酯油的除臭。除了 FFA或FFA酯之外，所述脂肪酸懼出物含有不阜化物(unsaponifiable),例如但不仅限于生育酹(tocopherol)和甾醇。脂肪原料(FATTY FEED)是含有脂肪酸部分(moiety)的原材料的通名。其可为甘油酯，如单酰基甘油酯(也称作甘油一酯)、甘油二酯、甘油三酯和磷脂，但是，游离脂肪酸甚至皂(soap)也可以成为脂肪原料的一部分。FFA是游离脂肪酸的标准简称。油或脂肪产物的油精(OLEIN)是通过对该产物在其部分组分固化的温度进行固/液分离而得到的低熔点级分。转酯作用(TRANSESTERIFICATION)是具有Rl的甘油酯和具有R2的脂肪酸之间的反应，由此所述R基团相互交换，得到具有R2的甘油酯和具有Rl的脂肪酸。本发明的方法本发明的目的是提供用于产生高纯度级别的相对于甘油三酯原料富含不饱和脂肪酸的甘油三酯产物的高效方法。此外，其目标为生成其他高纯度级别产物如例如饱和脂肪酸烷基酯以供例如生物柴油，和/或不饱和脂肪酸烷基酯，特别是可在本发明方法中循环使用的单不饱和物(monounsaturated)。声明通过该方法获得的包括甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的甘油酯类，脂肪酸，脂肪酸烷基酯，甘油和醇类产物具有高纯度化学品级别或高纯度食品级别。此外，本发明的目的是提供用于产生包含至少80摩尔％不饱和脂肪酸的甘油三酯产物的方法。该方法基于在该方法中循环使用分离的级分以获得甘油三酯产物。
在一些实施方案中，本发明涉及用于产生甘油三酯产物的方法，包括下述步骤(a)对包含基于甘油三酯中酰基基团的总量为至少25摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基的甘油三酯原料用具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇进行醇解反应以获得反应混合物，其中转化率为至少65% ；(b)从步骤(a)中产生的反应混合物分离包含下述的级分(i)不饱和C18脂肪酸烷基酯和(ii)甘油酯；和(c)在由脂肪酶催化的缩合反应中使用级分(i)和(ii)或其亚级分以产生包含至少80摩尔％不饱和脂肪酸的甘油三酯产物。醇解反应(步骤a)是通过将起始材料即甘油三酯原料和醇以一摩尔甘油三酯对至少3*0. 65摩尔的醇合并(bring together)来进行的。该反应可在25-60°C、30-55°C、35-50°C或35-45°C的温度进行。该反应可通过化学催化剂或酶催化剂如脂肪酶来催化。适用于本发明方法的脂肪酶更加详细地讨论于“脂肪酶”部分。将可溶解或固定的催化剂以高至足以使转化在24至48小时内发生的浓度添加。该反应可在分批反应、填充床或流化床系统中进行。醇解反应的转化率为至少65% ;至少70% ;至少75% ;至少80% ;至少82% ;至 少84% ;至少86% ;至少88% ;至少90% ;至少92% ;至少94% ;至少96%或至少98%。甘油三酯原料、醇和酶不易混合，而在过去，该障碍是通过添加溶剂来克服的。然而本发明的方法无需任何溶剂。脂质原料可使用任何脂质即包含甘油三酯的植物或动物来源的油脂在本发明的方法中作为原料并作为产生甘油三酯产物的基础。甘油三酯原料可包含极性脂质如磷脂；和非极性脂质如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯；或其任意组合。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中甘油三酯原料为植物油的。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中甘油三酯原料可选自下组乳脂；可可脂；玉米；猪油；橄榄；棕榈；棕榈仁；花生；菜籽；米糠；椰子；棉籽；葡萄籽；芝麻；大豆；葵花；牛脂；鲸，包括其衍生的级分；或其任意组合。取决于甘油三酯原料，不饱和C18脂肪酸残基的含量可变化，并因此在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中起始的甘油三酯包含至少30摩尔％;至少35摩尔％;至少40摩尔％ ;至少45摩尔％ ;至少50摩尔％ ;至少55摩尔％ ;至少60摩尔％ ;至少65摩尔％ ；至少70摩尔％;至少75摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基。在另一个实施方案中，本发明涉及方法，其中起始的甘油三酯包含最多80摩尔％ ;最多75摩尔％ ;最多70摩尔％ ;最多65摩尔％ ;最多60摩尔％ ;最多55摩尔％ ;最多50摩尔％ ;最多45摩尔％ ;最多40摩尔％ ；最多35摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基。醇用于本发明方法的醇为具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇类，如例如甲醇；乙醇；丙醇；丁醇；戊醇；或己醇。优选其为一元醇。其可为伯醇如甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)U-丙醇(PrOH)、1- 丁醇(n-BuOH)和1-戊醇，1-己醇(OH);仲醇如2-丙醇(iPrOH);叔醇；或其任意组合。因此醇的结构可为线性/直链的或支化的。优选地，该醇为甲醇(MeOH)或乙醇(EtOH)。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇选自下组甲醇；乙醇；丙醇；丁醇；异丁醇；戊醇；戊二醇；异戊醇；己醇；及其任意组合。
令人惊讶地发现可允许一定量的水含量。如实施例1和2可显而易见在本发明的方法中可使用无水(99%)以及96% EtOH(共沸物)。因此在醇解反应中未利用(未反应)的醇以及在本发明的缩合反应中生成的醇可循环使用。可将醇从反应混合物分离和/或从缩合反应混合物分离以供重新用于本发明方法的醇解反应。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇可获得自从醇解反应混合物分离的未反应的醇，和/或获得自从缩合反应混合物分离的生成的醇，并循环至步骤(a)。分离方法进行分离(步骤b)以获得为了满足甘油三酯产物和/或终产物的规格所需的C18:x烷基酯(此处0 < X < 3)级分。C18:x的摩尔数必须大于酯在缩合反应中可结合的甘油酯上的位置数。醇解反应混合物可包含而不限于不饱和以及饱和的C18脂肪酸烷基酯；甘油酯； 未反应的醇；甘油；和不饱和以及饱和的C16脂肪酸烷基酯。在一些实施方案中，进行该分离以获得包含为了满足甘油三酯产物即终产物的规格所需的不饱和C18脂肪酸烷基酯的级分。级分的分离可使用本领域已知的方法如结晶、除臭、蒸馏、离心、蒸发、膜过滤、膜分离、分子蒸懼、短程蒸懼(short path distillation)、通过重力的相分离、分子筛、提懼、热分级(thermal fractionation),尿素沉淀等进行。结晶(CRYSTALLISATION)用于本文时描述了基于熔点不同的固/液分离方法，即，在混合物中的一些化合物是固体而一些不是固体的温度下进行。结晶也称为热分级(thermal fractionation),且两个术语可互换使用。除臭(DE0D0RISATI0N)基本上是在真空下的蒸汽蒸懼(steam distillation)。蒸馏(DISTILLATION)是将液体加热至其沸点，再冷凝(condense)并以液体形式收集蒸汽的方法。短程蒸馏是确保装置中低压力降的蒸馏单元的特定构建。蒸发(EVAPORATION)是将至少一种组分转化为蒸汽形式的工艺步骤。蒸发包括特定的形式，如蒸馏和除臭。膜分离(MEMBRANE SEPARATION)指用半渗透性膜获得(secure)不同分子物质的液/液分离的方法。分子蒸馏(M0LE⑶LAR DISTILLATION)是在高度真空中进行的蒸馏，其目的在于尽可能使用低温以保护热不稳定化合物。提馏(STRIPPING)，当在低于大气压的压力下进行时，也称为真空提馏，是在气体吹过(blow through)混合物时,使得所述混合物中最具挥发性的组分蒸发的方法。热分级(THERMAL FRACTIONATION)是结晶的另一用语。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中级分的分离是用选自下组的方法进行的蒸馏，结晶，离心，尿素沉淀，膜过滤；分子筛；或其任意组合。分离可为蒸馏，然后可进行进一步的分离方法如从蒸馏物的分级(结晶)或尿素沉降轻级分以进一步增加C18:x的含量。因此，在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含C18脂肪酸烷基酯的级分的分离是通过蒸馏和/或结晶的方法进行的。在蒸馏之后，甘油和甘油酯包含于相同级分，且两个组分可通过离心分离至不同级分。或者，该包含甘油和甘油酯两者的合并级分可直接用于步骤(C)而无需进一步分离。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含甘油酯的级分的分离是通过蒸馏和离心的方法来进行的，且在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含甘油的级分的分离是通过蒸馏和离心的方法来进行的。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含醇的级分的分离是通过蒸馏然后任选地用分子筛吸收水来进行的。该级分可循环使用并用作起始材料。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含C16脂肪酸烷基酯的级分的分离是通过蒸馏和/或结晶的方法来进行的。若需要可进一步分离该级分以获得饱和的C16:0级分，其可用作单独的副产物如用于燃料(生物柴油)。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中将至少一种其他级分从反应混合物分 离，所述级分选自下组包含(iii)醇；(iv)甘油；和(V)C16脂肪酸烷基酯的级分。应理解的是，由此获得的醇可在步骤(a)中重新使用，且由此获得的甘油可在步骤(C)中使用。取决于甘油三酯原料，C18脂肪酸残基级分可包含饱和C18:0脂肪酸残基和不饱和C18: X脂肪酸残基如单不饱和C18:1脂肪酸残基和多不饱和C18: p脂肪酸残基如二不饱和C18:2脂肪酸残基；三不饱和C18:3脂肪酸残基等。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含不饱和C18脂肪酸烷基酯的级分通过去除饱和C18脂肪酸烧基酷进一步富集不饱和C18脂肪酸烧基酷。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中包含不饱和C18脂肪酸烷基酯的级分进一步富集特定不饱和C18脂肪酸烧基酷，此处所述特定不饱和C18脂肪酸烧基酷选自下组C18:1(单不饱和)脂肪酸烷基酯C18:2(二不饱和)脂肪酸烷基酯；C18:3(三不饱和)脂肪酸烧基酷；或其任意组合。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中进一步分离不饱和C18脂肪酸酰基酯级分以生成至少一种选自下组的级分C18:1(单不饱和)脂肪酸烷基酯C18:2( 二不饱和)脂肪酸烷基酯；或C18:3(三不饱和)脂肪酸烷基酯。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中脂肪酸残基具有低于24个碳原子(C24);低于22个碳原子(C22)或低于20个碳原子(C20)的链长度。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中在脂肪酸残基中存在少于10个；少于9个；少于8个；少于7个；少于6个；少于5个；少于4个；少于3个或少于2个双键。缩合反应缩合反应(步骤c)是通过在脂肪酶的存在下将(i)C18脂肪酸烷基酯和(ii)甘油酯的级分或亚级分合并由此生成甘油三酯产物来进行的。可直接使用甘油三酯产物或可将其进一步精炼以获得终产物。不饱和C18脂肪酸烷基酯的量须大于甘油酯包括甘油二酯和甘油一酯中在缩合反应过程中可供这些酯结合的位置数。这对于确保形成甘油三酯是重要的。所需的化学计量可通过计算并后续调整用于缩合反应的不饱和脂肪酸烷基酯和甘油酯的量来获得。可在缩合过程中持续蒸发醇，并任选地可将其循环使用并用于醇解反应。可任选地将未转化的脂肪酸烷基酯添加至下一批缩合反应(即循环使用)或将其分离出来以供其他目的或弃去。
作为备选方案，在添加脂肪酶以进行缩合反应之前，可耗尽醇解反应混合物中的级分(iv)甘油和/或(v)ci6脂肪酸烷基酯。应理解的是，还可以在进行缩合反应的混合物中保留至少部分甘油。在蒸馏时，醇会首先分离出来(例如在750mmHg具有79°C的沸点的EtOH)。C16脂肪酸烷基酯(例如棕榈酸乙酯，在750mmHg为303°C，在IOmmHg为192_193°C )具有比C18脂肪酸烷基酯(油酸乙酯，在750mmHg为205_208°C，在15mmHg为216_218°C;硬脂酸乙酯，在15mmHg为213_215°C ;亚油酸乙酯在15mmHg为224°C )低的沸点，并在蒸馏过程中会首先分离出来。通过分离出C16级分以及足量甘油以平衡化学计量，可对剩下的包含C18级分和甘油酯级分的组分进行缩合反应以生成甘油三酯产物。
脂肪酶脂肪酶为可用于醇解反应以及缩合反应的酶催化剂。脂肪酶用于本文意指具有脂肪酶活性，一般归类于EC 3.1.1. X，并催化反应如水解、相互酯化、转酯、酯化、醇解、酸解和氨解的酶。与本发明特别相关的脂肪酶为在醇存在下催化脂肪酸酯化或脂肪酸酯转酯以产生脂肪酸烷基酯的那些。磷脂酶，其为脂肪酶的亚组，用于本文意指具有磷脂酶活性的酶，所述酶可催化导致脂肪酸烷基酯形成的反应，并就本发明而言亦定义为脂肪酶。当甘油三酯原料包含磷脂时，将磷脂酶纳入醇解反应是特别适合的。酰基转移酶用于本文意指除了具有脂肪酶活性(通常归类为EC 3.1.1. x)之外还具有酰基转移酶活性的酶，通常归类为EC 2. 3.1. X，其中该酶能够从酰基供体将酰基基团转移至一个或多个选自下组的酰基受体底物任何包含羟基基团(-0H)的化合物，即醇类如留醇，stanol,甘油等；糖；蛋白质；蛋白亚基。脂质酸基转移酶催化反应如转酷和醇解，并因此该酶可催化导致脂肪酸烷基酯生成的反应，并就本发明的目的亦定义为脂肪酶。在本发明的某些实施方案中，在水存在下，反应可由酰基转移酶催化。适用于本发明的方法和/或包含于本发明的组合物中的脂肪酶可从微生物获得，如丝状真菌、酵母或细菌。在一些实施方案中，所述脂肪酶可配置为固定化的产物，如下文中进一步描述。就本发明而言，术语“获得自”用于本文中与特定微生物来源相联系，意指该酶和因此编码该酶的DNA序列是由该特定来源产生的。然后通过标准已知方法从所述特定来源获得该酶，所述方法使得本领域技术人员能够获得包含该酶的样品并能够用于本发明的方法。所述标准方法可为从所述特定来源直接纯化或克隆编码该酶的DNA序列，接着在相同来源(同源重组表达)或在不同的来源(异源重组表达)中进行重组表达。大多数在有机合成中用作催化剂的脂肪酶为微生物和真菌来源，且这些可通过发酵和基本的纯化容易地获得。已成功地将从多种来源提取的脂肪酶用于供生成生物柴油的方法。固定于丙烯酸树脂上的南极假丝酵母(Candida Antarctica) B脂肪酶是在用于产生生物柴油的实验中最常用的酶。然而，取决于实验变量如底物、醇、水、温度、pH、重新使用等，可利用不同的脂肪酶。在某些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述脂肪酶选自下组曲霉属(Aspergillus)脂肪酶；黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶；细毛嗜热霉(Thermomyceslanuginosa)脂肪酶；南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A;南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶B ;柱状假丝酵母(Candida cylindracae)脂肪酶；畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶；解脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶；痤疮棒杆菌(Corynebacterium acnes)脂肪酶；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp. )S_2脂肪酶；大刀镰孢(Fusarium cuImorum)脂肪酶；异孢镰孢(Fusarium heterosporum)脂肪酶；尖镰孢(Fusarium oxysporum)脂肪酶；爪睡毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Rhizomucor deIemar)脂肪酶；洋葱伯克霍尔德氏菌(假单胞菌)(Burkholderia(Pseudomonas) cepacia)脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌(Pseudomonas camembertii)脂肪酶；萤光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)脂肪酶；根霉属(Rhizopus)脂肪酶；少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)脂肪酶；白地霉(Geotrichium candidum)脂肪酶；Hyphozyma属物种脂肪酶；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)脂肪酶；和它们的野生型直向同源物(ortholog)和同源物；和它们的具有与任何这些野生型酶至少60%;至少70%，至少75%;至少80%，至少85% ;至少90%，至少92% ;至少94% ;至少95%，至少96% ;至少97% ； 至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的变体。在某些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述脂肪酶选自以下述登录号保藏于NCBI 的 Genebank 数据库中的组YP_890535 (GID : 118468600，亦描述于 W005/056782 ;耻垢分枝杆菌(M. smegmatis)) ；NP_436338.1 (GID :16263545 ;首猜中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)) ；ZP_01549788.1(GID:118592396 ；Stappia aggregate) ；NP_066659.1(GID 10954724 ;发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)) ；YP_368715.1 (GID :78065946 ;伯克霍尔德氏菌属菌种(Burkholderia sp)) ；YP_674187.1 (GID :110633979 ；Mesorhizobiumsp.) ；NP_532123.1(GID :17935333 ;根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens))；发根土壤杆菌(Q9KWA6);发根土壤杆菌(Q9KWB1);根癌土壤杆菌(Q8UFG4);根癌土壤杆菌(Q8UAC0);根癌土壤杆菌(Q9ZI09);根癌土壤杆菌(ACA) ；Prosthecobacterdejongeii (RVM04532);百脉根瘤菌(Rhizobium. loti) (Q98MY5);苜猜根瘤菌(R. meliloti) (Q92XZ1);苜猜根瘤菌(Q9EV56),发根根瘤菌(R. rhizogenes) (NF006),发根根瘤菌(NF00602875), R. solanacerarum(Q8XQI0);苜蓿中华根瘤菌(RSM02162);苜猜中华根瘤菌(RSM05666) ；Mesorhizobium loti (RML000301);发根土壤杆菌(Q9KWA6)；发根土壤杆菌(Q9KWB1);根癌土壤杆菌(AAD02335) ；Mesorhizobium loti (Q98MY5)；Mesorhizobium loti(ZP00 197751) ；Ralstonia solanacearum(Q8XQI0) ；Ralstoniaeutropha(ZPOO 166901);牛莫拉氏菌(Moraxella bovis) (AAK53448);洋葱伯克霍尔德氏菌(ZP00216984);紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) (Q7NRP5);小小梨形菌属菌种(Pirellula sp.) (NP_865746);创伤弧菌(Vibrio vulnificus) (AA007232);鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium) (AAC38796);苜猜中华根瘤菌(SMal993);苜猜中华根瘤菌(Q92XZ1);苜蓿中华根瘤菌(Q9EV56);和它们的直向同源物和同源物；和它们具有与任何这些野生型酶至少60% ;至少70% ;至少75% ;至少80% ;至少85% ;至少90% ;至少92% ;至少94% ;至少95% ;至少96% ;至少97% ;至少98% ;或至少99%相同的氨基酸序列的变体。同一性可基于氨基酸序列或核苷酸序列计算。
两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的关系可通过参数“同一性”来描述。就本发明而言，使用 EMBOSS 包(EMBOSS :The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277)(优选 3. 0. 0 或更晚版本)的 Needle 程序中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol.Biol. 48 =443-453)来确定两种氨基酸序列之间的同一性程度。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0. 5，和EBL0SUM62 (EMBOSS版本的BL0SUM62)取代矩阵。使用Needle标示“最长同一性”(使用-nobrief选项获得)的输出作为百分比同一性且如下计算(相同的残基X100)/(比对的长度-比对中缺口的总数)
就本发明而言，使用EMBOSS 包(EMBOSS :The European Molecular Biology OpenSoftware Suite, Rice等,2000,见上文)(优选3. 0. 0或更晚的版本)的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch, 1970,见上文)来确定两种脱氧核糖核苷酸序列之间的同一性程度。所使用的任选参数是缺口打开罚分10，缺口延伸罚分0. 5，和EDNAFULL(EMBOSS版本的NCBI NUC4. 4)取代矩阵。使用Needle标示“最长同一性”(使用-nobrief选择获得)的输出作为百分比同一性且如下计算(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对的长度-比对中的缺口的总数)固定化的脂肪酶在油和脂肪加工中对固定化的脂肪酶的使用正经历显著的增长，这是由于使得合算的方法成为可能的新的技术发展。固定化的脂肪酶的根本优点在于可通过单纯过滤将其从分批方法回收并重新使用。此外，将固定化的脂肪酶填充于柱中允许连续方法的简单执行。固定化的酶一般还对催化剂的操作稳定性具有正面作用(与游离的酶相比)，其使操作更容易(与游离的酶粉相比)，并允许在低水(low-water)条件下的操作(与液体配制的酶相比)。多种固定化脂肪酶的方法在本领域是公知的。对脂肪酶固定化的综述见于 〃 Immobilized lipase reactors for modification of fats and oils-areview”Malcata, FX.等(1990) Journal of American Oil Chemist 1 s SocietyVol. 67p. 890-910，其中列举了代表性脂肪固定化载体的实例，包括无机载体如硅藻土、氧化硅、多孔玻璃等；多种合成树脂和合成树脂离子交换剂；和天然多糖载体如纤维素和交联的糊精。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述脂肪酶是固定化的。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述脂肪酶共价地或非共价地；或者通过包埋于天然或合成基质如溶胶-凝胶、藻酸盐和角叉藻聚糖中；通过交联方法如在交联的酶晶体(cross-linked enzyme crystals, CLEC)和交联的酶聚集物(cross-linkedenzyme aggregates,CLEA);或通过沉淀于盐晶体上如蛋白质包被的微晶(protein-coatedmicro-crystal, PCMC)而固定化于载体上。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中该载体为选自下组的亲水载体多孔的无机颗粒，包括氧化铝、氧化硅和硅酸盐如多孔玻璃、沸石、硅藻土、膨润土、蛭石、铝碳酸镁；和多孔的有机颗粒，包括糖类聚合物如琼脂糖或纤维素。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述载体为选自下组的疏水载体合成聚合物如聚丙烯酸盐、聚甲基丙烯酸盐、尼龙、聚乙烯、聚丙烯或聚苯乙烯；和活性炭。多种合成疏水聚合物载体为包含几种不同单体组分的(交联的)共聚物。固体形式的脂肪酶，如固定化的脂肪酶，可用于本发明的一些实施方案，且商业上可获得的固定化的脂肪酶的实例包括以商品名LIP0ZYME TL頂、LIPOZYME RM頂和Novozym 435 (Novozymes A/S)出售的那些。在反应是用脂肪酶的液体制剂(与固定化的脂肪酶相对)进行的情况下，可通过分离包含该酶的水/甘油相或通过使用膜反应器来回收该酶以供多次使用。在膜反应器中，通过使用膜过滤系统将终产物与脂肪酶分离。甘油三酯产物在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中获得了至少88%;至少90%;至少92%; 至少94% ;至少95% ;至少96% ;至少97% ;至少98% ;或至少99%的甘油三酯产物。此种百分比应理解为在终产物中掺入甘油三酯的总脂肪酸的百分比(摩尔％ )。已知具有高水平饱和脂质的膳食升高血胆固醇并增加心血管疾病的风险。因此需要在消费品中减少饱和脂质的量并增加不饱和脂质的量。甘油三酯产物中不饱和脂肪酸的量基于甘油三酯中酰基基团的总量为至少80摩尔％，优选至少82. 5摩尔％ ;至少85摩尔％ ;至少87. 5摩尔％ ;至少90摩尔％ ;至少92. 5摩尔％ ;至少95摩尔％或至少97. 2摩尔％。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中甘油三酯产物中饱和脂肪酸的量基于甘油三酯中酰基基团的总量为低于20摩尔％;低于17. 5摩尔％;低于15摩尔％;低于12. 5摩尔％ ;低于10摩尔％ ;低于7. 5摩尔％ ;或低于5摩尔％。已知多不饱和脂肪酸残基的减少增加一些消费品如例如油煎介质(fryingmedium)的稳定性，并因此需要获得单不饱和脂肪酸高且饱和和/或多不饱和脂肪酸低的产物。为了终产物的稳定性，脂肪酸中双键数应尽可能的低，并优选限于一或二。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中在甘油三酯产物中C18:l(单不饱和)脂肪酸残基的量高于C18:p(多不饱和)脂肪酸残基的量。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中甘油三酯产物中C18:p (多不饱和)脂肪酸残基的量基于甘油三酯中不饱和酰基基团的总量为低于50摩尔低于40摩尔低于30摩尔％ ;低于20摩尔％ ;低于15摩尔％ ;低于10摩尔％ ;低于7. 5摩尔％ ;低于5摩尔％ ;低于2. 5摩尔％ ;或低于I摩尔％。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中甘油三酯产物中(多不饱和)脂肪酸残基含有少于6 ;少于5 ;少于4 ;少于3或少于2个双键。食品级别品质的产物为可被食品级别品质机构批准供人类摄食的产物。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中所述甘油三酯产物为食品级别品质。在一些实施方案中，本发明涉及可由所述方法获得的甘油三酯产物。在一些实施方案中，本发明涉及甘油三酯产物用于产生消费品和/或油炸食品，优选可食用的油(edible oil)、食用油(consumer oil)、人造奶油(margarine)、起酥油(shortening)、煎炸油(frying oil)、挂糊并油炸的产品(battered fried product)、烘烤产品(像面包、蛋糕、小甜饼、饼干或零食(snack food)，例如薯片和薯条)的用途。其他产物
作为来自甲醇解反应的结果的饱和脂肪酸的脂肪酸烷基酯称作脂肪酸甲酯(FAME)或生物柴油。生物柴油定义为来源于可再生的原料的长链脂肪酸和C1-C3 —元醇的酯。此类可再生原料的实例为植物油和动物脂肪。在本发明的上下文中，长链脂肪酸可定义为具有10至22个碳原子长度的脂肪酸链。在一些实施方案中，本发明涉及方法，其中将饱和脂肪酸烷基酯的级分从反应混合物分离。在一些实施方案中，本发明涉及饱和脂肪酸烷基酯的级分作为燃料或燃料添加剂的用途。可如描述就生成高纯度级别的甘油副产物的目的而分离甘油。可将未转化的C18从缩合反应混合物分离以供在新的轮次的缩合中重新使用的目的。本发明进一步通过下述实施例描述，其不应视作对本发明范围的限制。材料和方法用作缓冲液和底物的化学品为至少试剂级别的商品。所有化学品，除非另行指明，从Sigma-Aldrich或类似的商业来源获得,并不经进一步纯化而使用。实施例1-脂肪酸烷基酯的产生作为24析因筛选试验(两个级别和四个因子)进行转酯实验。使用来自SASInstitute Inc. SAS Campus Drive, Building S, Cary, NC, 27513, USA (参见 www. jmp. com)的统计软件SAS JMP 版本8. 0的实验设计功能以根据表I中列出的参数设定实验。使用相同的软件，忽略3-因子和更高的相互作用，来分析表3中的数据。表1:实验设定
权利要求
1.一种用于产生甘油三酯产物的方法，包括下述步骤a)对包含基于甘油三酯中酰基基团的总量为至少25摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基的甘油三酯原料用具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇进行醇解反应以获得反应混合物，其中转化率为至少65% ；b)从步骤(a)中产生的反应混合物分离包含下述的级分(i)不饱和C18脂肪酸烷基酷和( )甘油酷；和c)在由脂肪酶催化的缩合反应中使用级分(i)和(ii)或其亚级分以产生包含至少80 摩尔％不饱和脂肪酸的甘油三酯产物。
2.权利要求1的方法，其中步骤(a)由脂肪酶催化。
3.权利要求1-2任一项的方法，其中所述甘油三酯原料为植物油。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇选自下组 甲醇；乙醇；丙醇；丁醇；异丁醇；戊醇；戊二醇；异戊醇；己醇；及其任意组合。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中至少50%的所述具有I至6个碳原子(C1-C6)的醇获得自从醇解反应混合物分离的未反应的醇，和/或获得自从缩合反应混合物分离的生成的醇，并再循环至步骤(a)。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中通过去除饱和C18脂肪酸烷基酯进一步富集包含不饱和C18脂肪酸烷基酯的级分中的不饱和C18脂肪酸烷基酯。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中进一步富集包含不饱和C18脂肪酸烷基酯的级分中的选自下组的特定不饱和C18脂肪酸烷基酯C18:1 (单不饱和)脂肪酸烷基酯； C18:2( 二不饱和)脂肪酸烷基酯；C18:3(三不饱和)脂肪酸烷基酯；及其任意组合。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中将至少一种另外的级分从所述反应混合物分离， 其中所述至少一种另外的级分选自下组醇；(iv)甘油；和(V)Cie脂肪酸烷基酯。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中级分的分离是用选自下组的方法进行的蒸馏、结晶、离心、尿素沉淀、膜过滤、分子筛，及其任意组合。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中步骤(C)中使用的脂肪酶选自下组曲霉属 (Aspergillus)脂肪酶；黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶；细毛嗜热霉(Thermomyces Ianugmosa)脂肪酶；南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A ;南极假丝酵母 (Candida Antarctica)脂肪酶B;柱状假丝酵母(Candida cylindracae)脂肪酶；畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶；解脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶； 痤疮棒杆菌(Corynebacterium acnes)脂肪酶；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)S_2脂肪酶；大刀镰孢(Fusarium cuImorum)脂肪酶；异孢镰孢(Fusarium heterosporum)脂肪酶；尖镰孢(Fusarium oxysporum)脂肪酶；爪睡毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Rhizomucor deIemar)脂肪酶；洋葱伯克霍尔德氏菌(假单胞菌)(Burkholderia(Pseudomonas) cepacia)脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌(Pseudomonas camembertii)脂肪酶；萤光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)脂肪酶；根霉属(Rhizopus)脂肪酶；少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶；金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)脂肪酶；白地霉(Geotrichium candidum)脂肪酶；Hyphozyma属菌种脂肪酶；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)脂肪酶；和它们的野生型直向同源物和同源物；和它们的具有与任何这些野生型酶至少60% ;至少70%，至少75% ;至少80%， 至少85% ;至少90%，至少92% ;至少94% ;至少95%，至少96% ;至少97% ;至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的变体。
11.权利要求2-10任一项的方法，其中用于步骤(a)中的脂肪酶选自下组曲霉属 (Aspergillus)脂肪酶；黑曲霉(Aspergillus niger)脂肪酶；细毛嗜热霉(Thermomyces Ianugmosa)脂肪酶；南极假丝酵母(Candida Antarctica)脂肪酶A ;南极假丝酵母 (Candida Antarctica)脂肪酶B;柱状假丝酵母(Candida cylindracae)脂肪酶；畸形假丝酵母(Candida deformans)脂肪酶；解脂假丝酵母(Candida lipolytica)脂肪酶；近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)脂肪酶；皱落假丝酵母(Candida rugosa)脂肪酶； 痤疮棒杆菌(Corynebacterium acnes)脂肪酶；隐球菌属菌种(Cryptococcus spp.)S_2脂肪酶；大刀镰孢(Fusarium culmorum)脂肪酶；异孢镰孢(Fusarium heterosporum)脂肪酶；尖镰孢(Fusarium oxysporum)脂肪酶；爪睡毛霉(Mucor javanicus)脂肪酶；曼赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶；德氏根毛霉(Rhizomucor delemar)脂肪酶；洋葱伯克霍尔德氏菌(假单胞菌)(Burkholderia(Pseudomonas) cepacia)脂肪酶；沙门柏干酪假单胞菌(Pseudomonas camembertii)脂肪酶；萤光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)脂肪酶；根霉属(Rhizopus)脂肪酶；少根根霉(Rhizopus arrhizus)脂肪酶；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)脂肪酶；白地霉(Geotrichium candidum)脂肪酶；Hyphozyma 属菌种脂肪酶；产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)脂肪酶；和它们的野生型直向同源物和同源物；和它们具有与任何这些野生型酶至少60% ;至少70%，至少75% ;至少80%， 至少85% ;至少90%，至少92% ;至少94% ;至少95%，至少96% ;至少97% ;至少98%或至少99%相同的氨基酸序列的变体。
12.权利要求10-11任一项的方法，其中所述脂肪酶是固定化的。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中在甘油三酯产物中C18:1(单不饱和)脂肪酸残基的量高于C18:p(多不饱和)脂肪酸残基的量。
14.权利要求1-13任一项的方法，其中将饱和脂肪酸烷基酯的级分从所述反应混合物分离。
15.根据权利要求14产生的饱和脂肪酸烷基酯级分作为燃料或燃料添加剂的用途。
全文摘要
本发明涉及用于产生甘油三酯产物的方法，包括下述步骤(a)对包含基于甘油三酯中酰基基团的总量为至少25摩尔％的不饱和C18脂肪酸残基的甘油三酯原料用具有1至6个碳原子(C1-C6)的醇进行醇解反应以获得反应混合物，其中转化率为至少65％；(b)从步骤(a)中产生的反应混合物分离包含下述的级分(i)不饱和C18脂肪酸烷基酯和(ii)甘油酯；和(c)在由脂肪酶催化的缩合反应中使用级分(i)和(ii)或其亚级分以产生包含至少80摩尔％不饱和脂肪酸的甘油三酯产物。
文档编号C12P7/64GK103025880SQ201080024881
公开日2013年4月3日 申请日期2010年3月29日 优先权日2009年4月6日
发明者P.M.尼尔森, J.布拉斯克, S.厄恩斯特 申请人:诺维信公司