专利名称：分离细胞的方法
分离细胞的方法本发明涉及用于从样品中分离细胞的方法和试剂盒。用包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液处理样品，这导致分离优选活细胞。
背景技术：
从复杂样品中分离细胞用于其鉴定或表征或简单地进一步用于处理变得越来越重要，尤其是鉴定样品中的病原体，所述样品如食品样品或临床样品，如血液、组织或粪便。 然而，为了明确鉴定并任选定量测定包含在样品中的细胞，必须提供用于分离细胞的方法。一般而言，实时PCR大大地提高了 PCR作为分子生物学中的定量工具和用于定量测定及鉴定微生物(尤其病原体)的实际应用范围。实时PCR使得每个PCR反应可可靠地检测和定量到一个单核苷酸靶标，但要求高度纯化的模板DNA。特别是当将其用于如食品等复杂环境中细菌的常规诊断和定量检测时，这些要求起到重要作用，因为这些环境成分引起的抑制作用可影响或甚至抑止PCR反应。此外，用于从如食品等复杂样品中分离目标生物体，使用可靠和有效回收方法是至关重要的。由于如食品等样品通常涉及大样品容量，因此通常用微生物学方法来分离和富集微生物。这些方法代表"金标准"方法，新备选技术必须与它们比较进行评估。为了建立用于从食品分离微生物(例如细菌)的满足实时PCR及用于微生物下游分析的其它分子方法的高要求的方法，已作出大量努力。亦尝试使用常用于分子生物学的DNA分离方法直接从食品中分离DNA。其它方法利用生物分子对微生物表面结构的亲和力，其中所述生物分子可以是例如任选与磁珠、硅烷化载玻片或直接集菌落印迹结合的抗体、来自噬菌体的细菌结合蛋白和抗菌肽(AMP)。例如，为了直接检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，可以使用水性两相分离系统(Lantz 等，Appl Environ Microbiol. (1994)60:3416-3418)。据报道浮力密度梯度离心为用于从食品基质中分离细菌的工具(Wolffs P.等， Appl Environ Microbiol. (2005)71:5759-5764)。其它方法基于物理分离，如简单的离心和过滤。亦阐述了以下方法使用蛋白酶K和链霉蛋白酶进行食品基质的酶消化方法，和/ 或使用硫氰酸胍/苯酚/氯仿、二乙基醚/氯仿和柠檬酸钠/聚乙二醇从食品中化学提取细菌的方法。目前用于从复杂样品中分离细胞尤其是微生物的方法阐述于例如乂6%118 KA 和 Jaykus L-A (Crit Rev Microbiol (2004) 30 7-24)中。这些方法中大多数有缺点，如处理的样品体积不够大、高检测限、低回收率、不能定量分离活细胞、程序耗时和高费用。另外，在大部分情况下这些方法的应用限制于仅仅一种或有限数量的不同食品基质。基于直接定量食品中细菌的以下要求必须提供用于分离细胞和微生物(如食品病原体单核细胞增生李斯特菌)的新方案(i)大样品体积；(ii)大范围靶标浓度内的可再现回收率；和(iii)除去抑制剂以助于用于下游分析的备选分子方法。WO 2008/017097揭示用于从复杂基质如食品分离细胞的方法。该方法使用包含与去污剂组合的离液剂的提取缓冲液。食品分析中的另一个关键问题是确定污染细菌的生存力。迄今为止，大部分方法
3不能区分活的和死的细菌细胞。另外，为裂解食品样品通常复杂的基质，需要对从所述样品中分离的生存力有负面影响的裂解条件。该问题减少了使用例如用于食品分析的常规监测的PCR方法的益处。一方面，某些细胞在提取过程中被杀死，另一方面，在提取前存在于样品中的代谢损伤的细胞或不能存活细胞也被提取和鉴定，但是它们对于样品质量没有任何其他影响。0. F. D' Urso 等，Food Microbiology 26 0009) 311-316 开发了基于过滤的分离活细胞的方法。该方法中使用的缓冲液包含大量离液剂硫氰酸胍，硫氰酸胍经常干扰下游处理，并因此不得不用复杂的洗涤程序除去。因此，明显需要用于从如食品和血液等复杂基质中分离细胞且可能是分离活细胞的定量和可重复的方法。发明简述业已发现可用包含至少氯化镁(MgCl2)和/或离子液体的缓冲液，容易地并极为有效地从复杂基质中分离如细菌等细胞污染物。另外，由于极为温和但有效的提取条件，该方法允许分离活细胞。因此，本发明涉及用于从复杂样品中分离细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)提供复杂样品；b)将所述样品与包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液一起孵育；c)优选通过离心、亲和结合和/或过滤从步骤b)的混合物分离所述细胞。本发明还涉及用于从复杂样品中分离细胞的试剂盒，所述试剂盒包括-包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液；和-至少一种生物降解酶。发明说明出乎意料的结果是，复杂样品与包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液一起孵育，导致样品溶解而不影响在所述样品中包含的含有细胞壁或细胞壁围绕的细胞。因此，本发明方法能够合适地用于分离所述细胞。根据本发明，可优选将所述方法用于分离细胞壁围绕的细胞，此处术语"细胞壁围绕的细胞"，指所有已知具有或包含细胞壁作为对环境的屏障的细胞。具有细胞壁的生物体或细胞的实例是细菌、古生菌、真菌、植物和藻类。与其相反，动物和大部分其它原生生物具有细胞膜而没有围绕的细胞壁。术语"复杂样品"指包含或多或少数目的不同主要有机来源的化合物的样品或样品基质，其中某些是液体，其它是固体。本发明的复杂样品可包括包含肽、多肽、蛋白质 (也包括酶)、碳水化合物(复杂的和简单的碳水化合物)、脂质、脂肪酸、脂肪、核酸等的基质。本发明样品优选包含少量纤维/淀粉。本文所用术语"含少量纤维/淀粉的样品“以广义使用，旨在包括含有或可能含有细胞的各种样品。优选样品包含少于20% (w/w)、更优选少于10%、更优选少于5%、特别优选少于 1%、尤其是没有(低于或在检测限周围)纤维/淀粉。本文所用"纤维"包含植物以及动物(如胶原纤维)来源的纤维。例示性样品包括但不限于食品，例如奶牛、母绵羊、雌山羊、母马、驴、骆驼、牦牛、CN 水牛和驯鹿等的奶，乳制品，牛肉、山羊、羔羊、成羊肉、猪肉、田鸡腿、小牛肉、啮齿动物、马、 袋鼠、禽类(包括鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽(pigeon or dove)、鸵鸟、鸸鹋)、海鲜包括长须鲸例如鲑鱼和罗非鱼以及贝类如软体动物和甲壳类动物和蜗牛的肉，肉产品，植物产品；种子； 禾本科谷物，包括玉米、小麦、大米、大麦、高粱和小米；非禾本科谷物，包括荞麦、苋菜和昆诺阿藜；豆类，包括扁豆、花生、豌豆和小扁豆；坚果，包括杏仁、核桃和松仁；含油种子，包括向日葵、油菜和芝麻；蔬菜如，根菜，包括马铃薯、木薯和芜菁；叶菜，包括苋菜、菠菜和羽衣甘蓝；海洋蔬菜，包括红皮藻、昆布和翅菜(dabberlocks)；茎菜，包括竹笋、胭脂仙人掌 (nopales)和芦笋；花序蔬菜，包括洋蓟、花椰菜和金针；以及果菜，包括南瓜、黄秋葵和茄子；水果；草本植物和香料；全血、尿、痰、唾液、羊水、血浆、血清、肺灌洗液；和组织，包括但不限于肝、脾、肾、肺、肠、脑、心脏、肌肉、胰腺等等。技术人员应明白，自上述任何例示性样品或所述例示性样品混合物获得的裂解物、提取物或(勻浆的)材料或包含一种或多种例示性样品的组合物，亦为本发明范围内的样品。本文所用术语"缓冲液"，指当将酸或碱加入到溶液或组合物中时抵抗PH变化的水溶液或组合物。这种对PH变化的抗性是由于这种溶液的缓冲性质。因此，表现缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般没有保持溶液或组合物PH的无限能力。相反，它们通常能够将PH值保持在一定范围内，例如保持在pH 7-pH 9之间。通常缓冲液能够保持PH在其pKa上下一个log范围内(参见例如，C. Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，GALBIOCHEM，1999)。 通常自缓冲盐或优选自非-离子缓冲组分如TRIS和HEPES制备缓冲液和缓冲溶液。加入到提取液中的缓冲液保证基质溶解过程中的PH值稳定。稳定的pH值有助于可重复结果、 有效裂解和分离细胞的保存。根据本发明的优选实施方案，分离细胞为活细胞。令人惊讶地发现，用本发明方法分离的细胞为活细胞(占分离的全部完整细胞的至少10 %、优选至少30 %、更优选至少50 %、甚至更优选至少70 %、最优选至少90 % )，并
可在适当的培养基中培育。本文所用"活细胞"包括具有活性新陈代谢的细胞，优选可增殖，特别是能够繁殖的细胞。用本发明方法分离的细胞是细菌细胞(优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞)、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞或植物细胞。特别优选选自以下的细胞李斯特氏菌属(Listeria spp.)、金黄色葡萄球菌(S. aureus)、P. paratuberculosis、沙门氏菌属 (Salmonella spp.)、空肠弯曲杆菌(C. jejuni)和娄地青霉(Penicillum roquefortii)。本发明方法允许分离具有或包含细胞壁的细胞。本发明特别允许分离一般的微生物细胞，优选食品和病原微生物，特别是与人相关的微生物，例如可能存在于人食品中的微生物或与临床相关的病原体。因此，本发明方法允许从高度复杂的样品(如食品)中分离细菌细胞、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞和植物细胞。根据本发明的优选实施方案，所述样品为食品样品、体液，尤其是血液、血浆或血清、水或组织样品。特别优选的样品是具有复杂基质(即尤其包含蛋白质、脂类、碳水化合物等)和/
5或高粘度的样品。食品样品优选为乳制品，优选奶，尤其鲜奶、奶粉、酸奶、干酪或冰淇淋；鱼产品， 优选生鱼；肉产品，优选生肉、肉酱(meat rinse)或香肠；沙拉酱(salad rinse)、巧克力； 蛋或蛋产品，如蛋黄酱。特别优选用于本发明方法的食品样品是通常已知包含可能的病原生物体(如单核细胞增生李斯特菌)的样品，以及由于复杂的基质用本领域已知方法从中几乎不能提取细胞的样品。尤其干酪是已知有复杂基质和高粘度的食品。根据本发明，作为基质溶解系统使用的提取液包含MgCl2和/或离子液体。如果存在，那么MgCl2通常以0. 5-3M、优选0. 5-2M、更优选1-2M的浓度存在。如果存在，那么离子液体通常以基于混合物重量的0. 5-20%重量、优选1-10%重量的浓度存在。离子液体可以是一种离子液体或两种以上离子液体的混合物。MgCl2*/或离子液体的最佳浓度主要视待溶解的样品和待分离的细胞种类而定。 这些参数易于由本领域技术人员测试。在优选实施方案中，提取液包含MgCl2或离子液体。本发明提取液为水溶液或缓冲溶液。其通常具有大于5和小于9的pH值，优选大于6和小于8，更优选6. 5-7. 5之间。提取液可另外包含可达20%的一种或多种水混溶性有机溶剂。可用于本发明方法的缓冲液优选选自以下磷酸缓冲液、磷酸缓冲盐缓冲液 (PBS)、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐缓冲液(TBS)和TRIS/ EDTA (TE)。与已知方法相反，本发明方法优选无去污剂，意即不将离子去污剂、两性离子去污剂或非离子去污剂(如十二烷基硫酸钠、CHAPS、Lutensol A0-7)加入到提取液中。当然将一种或多种添加物加入到提取液中是可能的，添加物如去稳定剂或有助于降解存在于特定样品中的物质的生物聚合物降解酶。如以下所论述，一个实施例是将淀粉降解酶加到包含大量胶原和/或淀粉的食品样品中。通常在18°C -50°C、优选25°C _45°C、更优选30°C -42°C的温度实施孵育。样品通常与提取液孵育10分钟-6小时、优选20分钟-1小时的时间。为了更加有效并以缩短时间溶解样品，在升高的温度下实施孵育有利。然而，应注意视需要，升高的温度不可以影响待分离细胞的生存力。样品与提取液孵育并由此溶解和裂解样品基质后，可通过任何已知方法分离细胞，所述方法例如离心、过滤、介电电泳和超声或亲和结合，亲和结合例如用优选固定在珠粒上的抗体、凝集素、病毒结合蛋白、适配体或抗菌肽(AMP)。优选通过过滤或离心来分离细胞，最优选通过离心。离心通常在500-10000g、更优选在1500_6000g、甚至更优选在2000_5000g进行。
离心步骤后，可在沉淀中发现细胞，并可弃掉上清液。如果过滤样品/提取液混合物，那么在过滤器的孔径与待分离的细胞大小相适应时，细胞留在所述过滤器表面。当然，也可以使用有不同孔径的不同过滤器进行不止一次过滤步骤。过滤步骤后，可从过滤器表面洗涤细胞(参见例如Mevens KA和Jaykus L-A, Crit Rev Microbiol Q004) 30 :7_24)。当复杂样品包含几乎不能或不能用本发明方法裂解的材料时，尤其需要过滤裂解的样品。通常这些材料包含淀粉和/或纤维。然而，用于从裂解混合物分离细胞的优选方法是离心。当然，也可能从在离心步骤后形成的溶解的沉淀分离细胞，其通过用涉及抗体的免疫学方法，尤其是固定在珠粒(优选磁珠)上的抗体，所述抗体针对待分离细胞上存在的表位。因为使用分离细胞的抗体珠粒在某些情况下造成回收率降低，所以所述方法可优选主要用于定性分离。为有助于溶解样品，所述样品可在例如与提取液孵育前用stomacher勻浆。当在孵育过程中搅动样品/提取液混合物时，进一步支持和/或加速溶解。视样品基质而定，孵育步骤可以重复一次或几次，例如两次、三次、四次、五次或十次。在这些孵育步骤之间，细胞和残余样品基质可通过例如离心与上清液分离。可将用本发明方法分离的细胞用于定量或定性测定样品中的细胞。这可通过例如以下方法来实现细胞计数；PCR方法，尤其是实时PCR ；用凝集素；或用涉及针对所述细胞表面结构的抗体、病毒结合蛋白、适配体或抗菌肽(AMP)的方法(如细胞特异性ELISA或 RIA)。分离步骤后优选用水、缓冲溶液和/或包含去污剂的溶液洗涤细胞。然而，在洗涤缓冲液中加入一种或多种添加物当然是可能的。洗涤步骤可以重复若干次(例如2、3、4、5 或10次)或仅仅一次。在洗涤步骤过程中，通常将细胞重新悬浮在缓冲液中并随后过滤或离心。如果在溶解样品中存在不溶颗粒(例如干酪中的磷酸钙颗粒)，那么可通过低转速离心或通过颗粒随时间沉降来去掉所述颗粒(在两种情况下细胞都保留在上清液中)。也可用包含去污剂的溶液洗涤细胞。这将允许进一步除去可能包含在细胞悬液中的脂肪残余物。在该方法步骤中使用的优选去污剂是那些常规用于脂肪除去的去污剂。本发明方法的一个优势是提取液只包含中等浓度的MgCl2和/或离子液体而不包含去污剂。结果，相比于提取缓冲液通常包含去污剂和大量离液剂的已知方法，如果样品基质允许，意即如果所述基质不包含例如需要用包含去污剂的洗涤缓冲液除去的脂肪残余物，则可省去或显著减少洗涤步骤。本方法的这一特征使可能缩短提取时间，并使可能在仅仅一次或两次洗洗涤步骤后就可直接或至少近乎直接用在其它情况下会受离液物质或去污剂的存在干扰的方法(如ELISA)来分析细胞。由于优选提取液中不存在去污剂的事实，直接用与优选固相支持体(如珠粒，尤其磁珠)结合的抗体分离细胞也是可能的。细胞与抗体的结合允许特异性分离特定类型的细胞。当样品包含多于一个细胞种类时，这尤其令人关注。根据本发明优选实施方案，测定样品中的细胞数量。可通过本领域已知的任何方法来测定样品中的细胞数量，尤其是通过微生物学方法(如系列稀释)、细胞计数、FACS分析、实时PCR等。根据本发明另一优选实施方案，分离细胞DNA或RNA。视细胞而定，可采取各种方法用于提取DNA(如基因组DNA、质粒)或RNA(如 mRNA)。本领域已知所有这些方法，单个方案主要取决于待裂解的细胞。分离可能进一步要求加入例如溶菌酶等酶。为了增加样品的裂解，尤其高粘度样品(如干酪)，在与提取液孵育前用 stomacher或混合器处理所述样品。
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为了测定或监测分离程序的效率，样品可掺入规定量的对照细胞。对照细胞通常为细菌细胞(优选革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌细胞)、真菌细胞、古生菌细胞、藻类细胞或植物细胞。优选其与假设存在于样品中的细胞相似，但优选其与假设存在于样品中的细胞不相同。回收的掺入的对照细胞的数量使得可测定本发明方法的效率，并还可以表明初始样品中存在的待分离及待测定的细胞数量。亦可将样品与对细胞表现渗透胁迫保护特性的化合物预孵育。为了提高细胞对渗透胁迫的抗性，包含(可能的)待分离细胞的样品可以与至少一种能够在所述细胞中诱导渗透保护反应的化合物一起孵育。表现所述特性并优选用于本发明方法的化合物是甜菜碱和/或β -赖氨酸。根据本发明的一个实施方案，样品进一步与至少一种生物聚合物降解酶一起孵育。从其中分离出细胞的某些样品包含生物聚合物结构，通过加入提取液不可或仅以低效率方式裂解生物聚合物。如果样品尤其食品样品，例如包含例如超过10%的胶原和/ 或淀粉的量，则所述样品在与本发明的基质裂解系统孵育前可用能够至少部分降解胶原和淀粉成分的物质处理。因此，样品优选进一步与至少一种生物聚合物降解酶一起孵育。优选与生物聚合物降解酶孵育的样品为例如肉、鱼等。冰淇淋、蛋、血、奶、乳制品等通常不需要加入生物聚合物降解酶。令人惊讶的结果是，单独使用酶不能使得分离细胞。本文所用术语"生物聚合物"，指蛋白质、多肽、核酸、诸如纤维素、淀粉和糖原等多糖。因此，"生物聚合物降解酶"是能将可能不溶于水性缓冲液的生物聚合物(如淀粉、 纤维素)降解为低分子物质或甚至单体的酶。因为生物聚合物降解酶可在特定PH和温度条件下有活性(使用特定缓冲液也可以起作用)，所以在任选条件下与所述酶孵育是有利的。这些条件视所用的酶而定，且在本领域为已知。孵育时间也视外在因素如PH和温度而定。因此孵育时间可以在10秒-6小时之间变化，优选30秒-2小时。生物聚合物降解酶优选选自蛋白酶、纤维酶和淀粉酶。这些酶的实例是Mvinase 24 GTT (枯草菌素)、CarenZyme 900T, Stainzyme GT0淀粉降解酶为例如环糊精葡聚糖转移酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶和异淀粉酶，特别是α-淀粉酶。在使用包含离液剂和去污剂的缓冲液的已知方法中，不能在基质裂解步骤期间加入生物聚合物降解酶，因为离液剂和去污剂可以负面影响酶活性，使得生物聚合物不能有效降解为片段或单体。与此相反，在本发明方法中，可在步骤b)之前和/或步骤b)期间和/或步骤C) 之后将生物聚合物降解酶与样品一起孵育(步骤b)为其中样品与提取液一起孵育的裂解步骤，而步骤C)为分离步骤)。可在几个小时内通常是1-6小时内实施本发明方法。本发明中所用的离子液体或液体盐是由有机阳离子和通常无机阴离子构成的离子物类。它们不含有任何中性分子，并通常具有低于373K的熔点。离子液体领域目前正加紧研究，因为其可能的应用是多方面的。关于离子液体的综述论文为例如R. Sheldon" Catalytic reactions in ionic liquids(离子液体中的催化反应)〃，Chem. Commun.，2001，2399-2407 ；M. J. Earle, K. R. Seddon “ Ionicliquids. Green solvent for the future (离子液体，未来的绿色溶齐[J )“,
Pure Appl.Chem. ,72 (2000),1391-1398 ；P.ffasserscheid, W.Keim “ Ionische
〃
Flussigkeiten-neue Losungen fur die Ubergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids-NovelSolutions for Transition-Metal Catalysis ( 1 ^ ^ - fflTilyJS^M 催化的新型溶液)]，Angew. Chem.，112 (2000), 3926-3945 ；Τ. Welton “ Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis (室温离子液体，用于合成及催化的溶剂)“，Chem. Rev.，92 (1999)，2071-2083 ；或 R. Hagiwara, Ya. Ito “ Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions ( 唑阳离子及氟代阴离子的室温离子液体)“，J. Fluorine Chem.，105 (2000)，221-227)。一般情况下，本领域技术人员已知的所有通式K+A_离子液体，尤其是与水混溶的离子液体，适于本发明方法。离子液体的阴离子A—优选选自卤化物、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、氰胺、硫氰酸盐或通式[N(Rf)2F或通式[N(XRf)2F的酰亚胺，其中&代表具有1至8个C原子的部分地或完全被氟-取代的烷基，X代表或C0。本文卤化物阴离子可选自氯化物、溴化物和碘化物阴离子，优选氯化物和溴化物阴离子。离子液体的阴离子Α—优选为卤化物阴离子，尤其溴化物和碘化物阴离子，或四氟硼酸盐或氰胺或硫氰酸盐。有关离子液体的阳离子K+的选择本身没有限制。然而，优选有机阳离子，尤其优选的是铵、鳞、IItg、硫脲输、胍揭 1或杂环阳离子。铵阳离子可例如通过式(1)来描述[NR4]+ (1)，其中在所有情况下R都彼此独立，其代表H，其中不能所有取代基R同时为H ；OR' ,NR' 2，前提为式(1)中至多一个取代基R为OR' ,NR' 2 ；具有1-20个C原子的直链或支链烷基；具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C 原子的烷基取代，其中一个或多个R可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) 0H、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，且R中不是在α-位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换-O-、-S-、-S(O)-、-SO2-、-SO2O-、-C(O)-、-C(O)O-、-N+R' -P (O)R' O-,-C(O) NR' -SO2NR' -、-OP (O)R' 0_、-P(O) (NR' 2) NR' -、-PR' 2 = N-或-P (O)R'-，其中 R'可=H、未氟化、部分氟化或全氟化的C1-至C6-烷基、C3-至C7-环烷基、未取代或取代的苯基，且X可=卤素。鳞阳离子可例如通过式O)阐述[PR24]+ (2)，其中在所有情况下R2彼此独立，其表示
H、OR，或 NR' 2 ；具有1-20个C原子的直链或支链烷基；具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个C 原子的烷基取代，其中一个或多个R2可部分或完全被卤素取代，尤其-F和/或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2 取代，且R2中不在α -位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换-0_、-S-、-S(0)-、-SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C(0)0-、-N+R' 2_、-P(O)R' 0_、-C(O) NR' -SO2NR' -、-OP (O)R' 0_、-P(O) (NR' 2) NR' -、-PR' 2 = N-或-P (O)R'-，其中 R'为H、未氟化、部分氟化或全氟化的C1-至C6-烷基、C3-至C7-环烷基、未取代或取代的苯基，且X =卤素。然而，排除其中所有四个或三个取代基R和R2完全被卤素取代的式(1)和O)中的阳离子，所述情况例如三(三氟甲基)甲基铵阳离子、四(三氟甲基)铵阳离子或四(九氟丁基)铵阳离子。脲餘祁日离子可例如通过式(3)阐述[ (R3R4N) -C ( = OR5) (NR6R7) ] + (3)，而硫脲锅t阳离子通过式⑷阐述[ (R3R4N) -C ( = SR5) (NR6R7) ] + (4),其中R3至R7各自彼此独立地表示氢，其中对于R5排除氢；具有1-20个C原子的直链或支链烷基；具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个 C原子的烷基取代，其中取代基R3至R7中的一个或多个可部分或完全被卤素取代，尤其-F 和 / 或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2取代，且R3至R7中不在α -位置的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换-o-、-S-、-S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C(O) 0-、-N+R ‘ 2_、-P(O)R ‘ 0-、-C(O)NR ‘ -、-SO2NR ‘ -、-OP(O)R ‘ 0_、-P(O) (NR ‘ 2) NR' -,-PR' 2 = Ν-或-P(O)R' _，其中R' = H、未氟化、部分氟化或全氟化的C「至C6-烷基、C3-至C7-环烷基、未取代或取代的苯基，且X =卤素。胍麵t阳离子可例如通过式(5)来阐述[C (NR8R9) (NR10Rn) (NR12R13) ] + (5)，其中R8至R13各自彼此独立地表示氢、-CN、NR'2、-0R'；具有1-20个C原子的直链或支链烷基；
具有2-20个C原子和一个或多个双键的直链或支链烯基；具有2-20个C原子和一个或多个三键的直链或支链炔基；具有3-7个C原子的饱和、部分或完全不饱和的环烷基，其可以被具有1-6个 C原子的烷基取代，其中取代基R8至R13中的一个或多个可部分或完全被卤素取代，尤其-F 和 / 或-Cl，或部分被-OH、-OR ‘、-CN、-C (0) OH、-C (0) NR' 2、-SO2NR ‘ 2、-C (0) X、-SO2OH, -SO2X, -NO2取代，且R8至R13中不在α -位置的的一个或两个非相邻碳原子可被选自以下的原子和/或原子基团置换-o-、-S-、-S(O)-, -SO2-, -SO2O-, -C(O)-, C (0) 0-、-N+R ‘ 2_、-P (0) R ‘ 0-、-C (0) NR ‘ -、-SO2NR ‘ -、-OP (0) R ‘ 0_、-P (0) (NR ‘ 2) NR' -,-PR' 2 = Ν-或-P(O)R' _，其中R' = H、未氟化、部分氟化或全氟化的C「至C6-烷基、C3-至C7-环烷基、未取代或取代的苯基，且X =卤素。此外，可利用通式(6)的阳离子[HetN]+ (6)，其中HetN+表示选自以下基团的杂环阳离子
权利要求
1.用于从复杂样品中分离细胞的方法，所述方法包括以下步骤a)提供复杂样品；b)将所述样品与包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液孵育；c)从步骤b)的混合物中分离所述细胞。
2.权利要求1的方法，其特征在于，步骤c)中分离的所述细胞至少30%是活细胞。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于，所述复杂样品为食品或临床样品。
4.权利要求1-3中一项或多项的方法，其特征在于，所述提取液包含浓度为0.5-3M的 MgCl2。
5.权利要求1-4中一项或多项的方法，其特征在于，所述细胞为细菌细胞。
6.权利要求1-5中一项或多项的方法，其特征在于，所述提取液不包含去污剂。
7.权利要求1-6中一项或多项的方法，其特征在于，在步骤b)之前向所述样品中掺入规定量的对照细胞。
8.权利要求1-7中一项或多项的方法，其特征在于，将所述样品与表现出对细胞的渗透胁迫保护特性的化合物预孵育。
9.权利要求1-8中一项或多项的方法，其特征在于，将所述样品进一步与至少一种生物聚合物降解酶孵育。
10.权利要求1-9中一项或多项的方法，其特征在于，在另外的步骤d)中，通过细胞计数、PCR方法、通过使用凝集素或通过涉及针对所述细胞表面结构的抗体、抗菌肽(AMP)、适配体或病毒结合结构域的方法，来分析细胞。
11.用于从复杂样品中分离细胞的试剂盒，所述试剂盒包括 -包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液，和-至少一种生物降解酶。
12.权利要求11的试剂盒，其特征在于，所述生物降解酶选自蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶。
全文摘要
本发明涉及用于从样品中分离细胞的方法和试剂盒。用包含至少MgCl2和/或离子液体的提取液处理样品，这导致分离优选活细胞。
文档编号C12N1/02GK102459567SQ201080027681
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月31日 优先权日2009年6月18日
发明者M·瓦格纳, P·J·梅斯特, P·罗斯马尼特 申请人:默克专利股份公司