探测多核苷酸重复的制作方法

专利名称：探测多核苷酸重复的制作方法
技术领域：
所描述的方法一般涉及用于测定靶核酸中多核苷酸重复区域程度(extent)的试验。在具体方面，所描述方法涉及用于测定靶核酸中多核苷酸重复程度的试验，其中扩增的靶核酸用不依赖于多核苷酸重复数量的第一标签和与多核苷酸重复数量成比例的第二标签标记，以测定从标签探测的信号之间的比率，其指示多核苷酸重复数量。
背景技术：
人的若干体质性疾病的特征为在个体基因组的特定基因座上三核苷酸重复的扩增区域。该类型的两种最熟知的疾病为脆性X染色体综合征和亨廷顿病。在个体基因组的基因座处存在的三核苷酸重复数量与疾病的严重性相关。因此，已经开发了多种方法用于测定某些疾病相关基因的三核苷酸重复区域的长度。在脆性X中，重复基序是CGG。为诊断脆性X已经建立的临床方法是DNA印迹，其中来自个体的基因组DNA被限制性内切核酸酶消化以从基因组DNA中切除三核苷酸重复区域。该三核苷酸重复区域接着在琼脂糖凝胶上通过电泳按大小分开，印迹在膜上，并且用标记的对脆性X基因座特异性的探针探测该膜。 该方法使用电泳的按大小分开的能力测量重复区域的大小，并且是高劳动强度的、费时的， 且需要片段大小的主观解释。其他公开的用于测定三核苷酸重复区域长度的方法包括通过PCR扩增靶区域，然后通过使用测序工具的毛细管电泳评估大小。使用横跨重复区域的引物进行靶区域的PCR。 利用这些方法中最好的方法，已经优化PCR以扩增上至1，000或更多的重复。解释在常规平面凝胶上的电泳结果可具有挑战性。大小的读取是有些主观的，并且包括比较标准品和样品之间的偏差距离(excursion distance)——假设整个凝胶上没有明显的变形。一种PCR凝胶方法使用重复引物，其中引物是标靶的重复基序的全部或部分互补体(complement)。用重复引物产生的PCR产物的电泳产生成片条带(smear)；产物是许多不同长度的不同产物的混合物。解释这些重复引物PCR电泳图像是主观的。另一种公开的方法使用重复引物作为横跨引物(straddle primer)的替代物，在毛细管测序工具上进行高分辨率评估。尽管与平面电泳相比，结果的分辨率和清楚性被改善，但是解释可具有挑战性，尤其是在PCR打滑(PCR stutter)的情况中。利用毛细管测序工具作为读取机构的所有方法受到那些工具的高成本限制，并且受到它们的操作(比如环境温度范围)和维护要求非常严格的事实限制
发明内容
本文提供了测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括扩增包含多核苷酸重复区域的靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签和第二标签标记扩增的靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中第一标签和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示靶核酸中多核苷酸重复区域的长度。根据所描述方法的实施方式，结合扩增的靶核酸包括特异性杂交扩增的靶核酸与互补核酸捕获探针。任选地，第一标签并入在扩增靶核酸中使用的横跨引物。在进一步选项中，第二标签存在于在扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸中使用的核苷酸中或存在于与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针中。例如，与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针是与扩增的靶核酸中多核苷酸重复互补的核酸探针。根据本文提供的方法的实施方式，靶核酸分离自生物样品。术语“分离”指将核酸与天然发现核酸的环境的至少一些成分分开。因此，例如，分离的核酸可与细胞碎片分开。本文描述了其中靶核酸是基因组DNA的方法。生物样品获自个体对象，如，但不限于在本文描述的方法中使用的人对象。例如，根据本文描述的实施方式使用的生物样品获自具有选自下列的三核苷酸重复序列扩张疾病或处在具有选自下列的三核苷酸重复序列扩张疾病的风险下的个体对象 齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(dentatorubropallidoluysian atrophy)、亨廷顿病、脊延髓肌萎缩症(spinobulbar muscular atrophy)、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2型、脊髓小脑性共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调 7型、脊髓小脑性共济失调17型、脆性X染色体综合征；脆性XE智力迟钝；弗里德希氏共济失调；肌强直性营养不良；脊髓小脑性共济失调8型和脊髓小脑性共济失调12型。根据一些实施方式，本文描述的方法包括扩增参考核酸多核苷酸重复区域以产生扩增的靶参考核酸。这样的方法进一步包括用第一标签和第二标签标记扩增的靶参考核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例， 其中第一和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶参考核酸；将扩增的靶参考核酸结合至对扩增的靶参考核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第三信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第四信号；测定第三信号和第四信号的比率，其中比率指示靶参考核酸中多核苷酸重复区域的长度；并且比较第一信号和第二信号的比率与第三信号和第四信号的比率。第一信号和第二信号的比率与第三信号和第四信号的比率的比较使得能够探测第一核酸多核苷酸重复区域与参考的不同，所述第一核酸多核苷酸重复区域如包含来自具有三核苷酸重复序列扩张疾病或处在具有三核苷酸重复序列扩张疾病的风险下的个体对象的多核苷酸重复区域的样品基因组DNA。任选地，进一步包括的是扩增包含第二多核苷酸重复区域的第二靶核酸以产生扩增的第二靶核酸；用第一标签和第二标签标记扩增的第二靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将扩增的第二靶核酸结合至对扩增的第二靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示第二靶核酸中多核苷酸重复的长度。任选地，第二编码的基底是多个编码的颗粒，产生第二颗粒组。根据一些实施方式，第一和第二颗粒组在将扩增的第一和第二靶核酸结合至第一和第二编码的基底期间一起在反应器中存在。测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签标记扩增的靶核酸，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的第一捕获探针；扩增靶核酸以产生多核苷酸重复区域核酸；用第二标签标记多核苷酸重复区域核酸，第二标签与多核苷酸重复的数量成比例； 将多核苷酸重复区域核酸结合至对多核苷酸重复区域核酸特异性的第二捕获探针；探测与第一捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与第二捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度。任选地，第一和第二捕获探针相同。在进一步实施方式中，第一和第二捕获探针不同。筛选遗传条件(genetic condition)的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法，其包括扩增获自个体的样品的靶核酸以产生扩增的靶核酸，其中扩增的靶核酸包含第一标签和第二标签，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸的多核苷酸重复特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号；测定第一信号和第二信号比率，其中比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度，并比较该测定的比率与来自参考样品的比率以确定在个体中存在改变的多核苷酸重复区域。根据本文描述的实施方式提供了试验组合物，其包括包含多核苷酸重复区域的扩增的靶核酸，该扩增的靶核酸包括第一标签和第二标签，第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中第一和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸，并且其中扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针。附图简述

图1A、1B和IC是示意性流程图，描绘了用于测定靶DNA分子中多核苷酸重复长度的示例性方法；图2是描绘了靶横跨引物对的示例性结构的示意图；图3是描绘了重复特异性引物对(r印eat-specific primer pair)的示例性结构的示意图，其中非重复引物在重复特异性引物的上游；图4是描绘了重复特异性引物对的示例性结构的示意图，其中非重复引物在重复特异性引物的下游；图5A是描绘了使用如图2中描绘的靶横跨引物对制备的扩增的靶DNA分子的示意图；图5B是描绘了使用如图3中描绘的引物对制备的扩增的重复特异性DNA分子的示意图；图5C是描绘了使用如图4中描绘的引物对制备的扩增的重复特异性DNA分子的示意图；图6是扩增的靶DNA分子的示意图，所述扩增的靶DNA分子特异性结合至固定在编码颗粒上的寡核苷酸捕获分子；图7是扩增的重复特异性DNA分子的示意图，所述扩增的重复特异性DNA分子特异性结合至固定在编码颗粒上的寡核苷酸捕获分子；图8是扩增的靶DNA分子的示意图，所述扩增的靶DNA分子与两个重复探测器探针杂交并特异性结合至固定在编码颗粒上的寡核苷酸捕获分子；图9是使用描绘在图IA中的示例性方法从具有已知重复长度的Coriell脆性X 细胞系参考样品产生的试验结果的数据图；图10是使用描绘在图IB中的示例性方法产生从具有已知重复长度的Coriell脆性X细胞系参考样品产生的试验结果的数据图；图11是描绘了用于测定在靶DNA分子中存在的多核苷酸重复区域长度的示例性方法的示意图；图12是使用描绘在图11中的示例性方法对男性参考样品(图12A)和对女性参考样品在第一组杂交条件下(图12B)和第二组杂交条件下(图12C)进行的试验结果的数据图；和图13是描绘了用于测定在靶DNA分子中存在的多核苷酸重复区域长度的示例性方法的示意图。这里提供的示意图不是按比例绘制的。发明详述本文描述了用于测定在靶核酸中存在的多核苷酸重复区域长度的方法。如本文所使用，术语“多核苷酸重复区域的长度”意思是重复出现在靶核酸片段中的多核苷酸基序——典型地包含3个或4个核苷酸——的数量。提供了测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸。提供了包括对扩增的靶核酸特异性的捕获探针的编码颗粒。扩增的靶核酸接着经由与捕获探针特异性结合而结合至编码的颗粒。用第一标签和第二标签标记扩增的靶核酸。第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且本文也称为“靶探测标签”。第二标签与多核苷酸重复的数量成比例并且本文也称为“重复探测标签”。探测第一标签以产生第一信号并且探测第二标签以产生第二信号。测定第一信号和第二信号的比率，并且该比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度。在具体实施方式
中，第一标签，即“靶探测标签”并入扩增靶核酸中使用的横跨引物。在一些实施方式中，第二标签，即“重复探测标签”存在于扩增靶核酸中使用的重复特异性引物中。在一些实施方式中，“重复探测标签”存在于在扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸中使用的核苷酸中。在一些实施方式中，“重复探测标签”存在于与扩增的靶核酸中的多核苷酸重复特异性结合的探针中。例如，根据本发明的实施方式，特异性结合扩增的靶核酸中多核苷酸重复的探针是具有互补核酸序列的核酸探针。如本文所使用的术语“核酸”指RNA或DNA分子，其具有包括单链、双链、寡核苷酸或多核苷酸的任何形式的多于一个的核苷酸。在具体实施方式
中，靶核酸是DNA，并且该DNA可以为任何形式，如染色体DNA、线粒体DNA、cDNA、显微切割染色体DNA、载体中的插入物，其示意性包括细菌人工染色体、酵母人工染色体、人类人工染色体、粘粒、质粒、噬菌粒、噬菌体DNA和F黏粒(fosmid)。靶核酸可获自任何来源，包括，但不限于人、非人哺乳动物、脊椎动物、无脊椎动物、微生物或植物。靶核酸可体外或体内从一种或多种细胞获得。例如，靶核酸可获自培养细胞，包括，但不限于细胞系、初级细胞或实验室操纵细胞如重组细胞。靶核酸典型地包含在生物样品中，所述生物样品可获自个体，如来自身体样品，例如，血液、颊粘膜拭子(buccal swab)、皮肤组织、尿、唾液、组织和类似物，和源自它们的细胞系。出生前样品可获自羊水、妊娠产物、胚泡和卵裂球、绒膜绒毛(corionic villi)、胎儿细胞和在母体血液中循环的胎儿DNA。在本文描述的方法中，可以使用提取自用福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)病理学样品的存档样品。样品也可获自体内来源，如细胞系。生物样品可获自任何来源，包括，但不限于人、非人哺乳动物、脊椎动物、无脊椎动物、微生物或植物。生物样品可体外或体内从一种或多种细胞获得。例如，生物样品可获自培养细胞，包括，但不限于细胞系、初级细胞或实验室操纵的细胞如重组细胞。靶核酸，如靶DNA，通过本领域已知的方法获得，例如，如在下面所描述的 J. Sambrook 禾口 D. ff. Russell，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001or F. M. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed. ,2002。革巴核酸,如靶 DNA,也可商业上获得和/或使用用于分离靶核酸如靶DNA的商业试剂盒获得。本文使用的科学和技术术语意图具有本领域技术人员通常理解的意思。可在示例性包括下列文献的多种标准参考文献的内容中发现这些术语的定义和使用J. Sambrook 禾口 D. W. Russel1, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ；F. Μ. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed. ,2002 ；B.Alberts 等，Molecular Biology of the Cell,4th Ed. , Garland, 2002 ;D.L. Nelson 禾口 Μ. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed. , W. H. Freeman & Company, 2004 ；以及 Herdewi jn, P. (Ed·), Oligonucleotide Synthesis :Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, Humana Press，2004。用于测定在靶核酸中存在的多核苷酸重复区域长度的方法是有用的，例如，当确定疾病基因座如脆性X基因座是否包含与疾病表型相关的三核苷酸重复数量时。目前所描述的方法采用可探测的标签，其产生与多核苷酸重复长度相关的信号，因此使得能够测定多核苷酸重复区域的长度，而不需要评估重复区域或其部分的分子量。与多核苷酸重复相关的疾病包括三核苷酸重复序列扩张疾病，例如但不限于齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩(DRPLA)、亨廷顿病、脊延髓肌萎缩症(SBMA)、脊髓小脑性共济失调1型(SCAl)、脊髓小脑性共济失调2型(SCA2)、脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)、脊髓小脑性共济失调6型(SCA6)、脊髓小脑性共济失调7型(SCA7)、脊髓小脑性共济失调17 型(SCA17)、脆性X染色体综合征；脆性XE智力迟钝；弗里德希氏共济失调；肌强直性营养不良；脊髓小脑性共济失调8型(SCA8)、脊髓小脑性共济失调12型(SCA12)。所有这些三核苷酸重复序列扩张疾病被良好地表征。在每种疾病中受三核苷酸重复序列扩张影响的基因是已知的并且在每个受影响的基因中三核苷酸重复序列扩张的位置是熟知的。参与DRPLA的基因在染色体12上并称做“DRPLA”。无症状个体在DRPLA三核苷酸重复基因座上具有约6至35个CAG拷贝。有症状个体具有约49至88或更多CAG重复拷贝。在亨廷顿病中受影响的基因称做“huntingtin”。无症状个体在huntingtin三核苷酸重复基因座具有约10至35个CAG拷贝。有症状个体具有约40或更多个CAG重复拷贝。在 SBMA中受影响的基因是位于X染色体上的雄激素受体基因。无症状个体在雄激素受体三核苷酸重复基因座上具有约9至36个CAG拷贝。有症状个体具有约38至62个拷贝。参与 SCAl的基因在染色体6上并称做“SCA1”。无症状个体在SCAl三核苷酸重复基因座上具有约6至44个CAG拷贝。有症状个体具有约39至81个CAG拷贝。参与SCA2的基因位于染色体12上并称做“SCA2”。无症状个体在SCA2三核苷酸重复基因座上具有约14至31个 CAG拷贝。有症状个体具有约36至64个拷贝。参与SCA3的基因位于染色体14上并称做 “SCA3”。无症状个体在SCA3三核苷酸重复基因座上具有约12至43个CAG拷贝。有症状个体具有约56至86个拷贝。参与SCA6的基因位于染色体19上并称作“SCA6”。无症状个体在SCA6三核苷酸重复基因座上具有约4至18个CAG拷贝。有症状个体具有约21至33 个拷贝。参与SCA7的基因位于染色体3上并称作“SCA7”。无症状个体在SCA7三核苷酸重复基因座上具有约4至19个CAG拷贝。有症状个体具有约37至306个拷贝。参与SCA17 的基因在染色体6上并称作“SCA17”。无症状个体在SCA17三核苷酸重复基因座上具有约 29至42个CAG拷贝。有症状个体具有约47-55或更多个CAG重复拷贝。在脆性X染色体综合征中受影响的基因称作“FMR1”，其在X染色体上。无症状个体在FMRl三核苷酸重复基因座上具有约6至53个CGG重复。有症状个体具有约230或更多个重复。在脆性XE智力迟钝中受影响的基因称作“FMR2”，其在X染色体上。无症状个体在FMR2三核苷酸重复基因座上具有约6至35个GCC拷贝。有症状个体具有约200或更多个拷贝。在弗里德希氏共济失调中受影响的基因称作“X25”。无症状个体在X25三核苷酸重复基因座上具有约7和 34个GAA重复。有症状个体具有约100或更多个重复。在肌强直性营养不良中受影响的基因称作“肌强直性营养不良蛋白激酶基因”(DMPK)。无症状个体在DMPK三核苷酸重复基因座上具有约5和37个CTG重复。有症状个体具有约50或更多个重复。在SCA8中受影响的基因称作“SCA8”。无症状个体在SCA8三核苷酸重复基因座上具有约16至37个CTG重复。有症状个体具有约110至250个重复。在SCA12中受影响的基因称作“SCA12”。无症状个体在SCA12三核苷酸重复基因座上具有约7至28个CAG重复。有症状个体具有约66 至78个重复。根据本文描述的实施方式，提供了筛选遗传条件的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法。术语“改变的多核苷酸重复区域”指这样的多核苷酸重复区域，其包含不同于在多核苷酸重复区域中多核苷酸重复的正常数量的多核苷酸重复数量。在本文所描述方法的实施方式中，可使用正常多核苷酸重复区域作为参考，探测改变的多核苷酸重复区域。因此，根据本文所描述方法的实施方式，包括为“参考”样品的靶核酸，即具有已知数量多核苷酸重复的靶核酸。通过比较使用本文所描述方法探测的多核苷酸重复的数量与已知的在正常多核苷酸重复区域中存在的多核苷酸重复数量，可探测改变的多核苷酸重复区域。术语“正常” 指在健康对象中发现的具体类似多核苷酸重复区域中存在的多核苷酸重复的主导数量。筛选遗传条件的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法包括扩增获自个体的样品的靶核酸以产生扩增的靶核酸，该扩增的靶核酸包括第一标签和第二标签，该第一标签不依赖于靶核酸中多核苷酸重复的数量，该第二标签与靶核酸中多核苷酸重复的数量成比例。扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸的多核苷酸重复特异性的捕获探针。探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号并探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号。测定第一信号和第二信号的比率，其中该比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度。将所测定的关于来自个体的样品的比率与参考比较。根据所描述方法的实施方式，参考是获自正常个体的核酸的对照样品。筛选遗传条件的特征为包含多核苷酸重复区域的靶基因组基因座中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法包括扩增获自个体的样品的包括多核苷酸重复区域的靶基因组基因座以产生扩增的靶基因组DNA，其包含第一标签——第一标签不依赖于靶基因组DNA 中多核苷酸重复的数量和第二标签——第二标签与靶基因组DNA中多核苷酸重复的数量成比例。扩增的靶基因组DNA结合至对扩增的靶基因组DNA的多核苷酸重复特异性的捕获探针。探测与捕获探针相关联的第一标签以产生第一信号并探测与捕获探针相关联的第二标签以产生第二信号。测定第一信号和第二信号的比率，其中比率指示靶基因组基因座中多核苷酸重复的长度。所测定的与来自个体的样品相关的比例与参考比较。根据所描述方法的实施方式，参考是获自正常个体的基因组DNA的对照样品。标签如本文所描述的，扩增的靶核酸用第一标签——“靶探测标签”和第二标签—— “重复探测标签”标记。靶探测标签不依赖于靶核酸的多核苷酸重复区域中多核苷酸重复的数量。任何数量的靶探测标签可并入扩增的靶核酸，只要并入的靶探测标签的数量在单个的扩增的核酸分子之间变化不明显。根据本文描述的实施方式，每个扩增的核酸分子包含并入在扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸中使用的引物对的至少一条引物的标签。因此，在具体实施方式
中，“靶探测标签”并入在扩增靶核酸中使用的横跨引物对的至少一条横跨引物中。任选地，对在扩增靶核酸中使用的横跨引物对的两条引物进行标记。“重复探测标签”与靶核酸的多核苷酸重复区域中的多核苷酸重复的数量成比例。在一些实施方式中，“重复探测标签”存在于在扩增靶核酸中使用的重复特异性引物中。在一些实施方式中，“重复探测标签”存在于在扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸中使用的核苷酸中。在一些实施方式中，“重复探测标签”存在于与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针中。例如，根据本发明的实施方式，与扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针是具有互补核酸序列的核酸探针。术语“标签”指这样的物质，其可视觉上或通过适当的直接或间接方法测量和/或观察，所述方法示例性包括但不限于光谱学、光学、光化学、生物化学、酶学、电学和/或免疫化学探测方法，以指示标签的存在。可结合本文描述的方法使用的标签的非限制性例子示例性包括荧光部分、化学发光部分、生物发光部分、磁性颗粒、酶、底物、放射性同位素和发色团。例如，核苷酸、核苷酸类似物和/或引物可用染料如荧光团、发色团、放射性部分或特异性结合对成员如生物素标记。术语“特异性结合对成员，，指这样的物质，其特异性识别第二种物质并与其相互作用，其实例为特异性结合对，如生物素_抗生物素蛋白、生物素_链霉抗生物素、抗体_抗原和靶_适配体。可使用的标签的非限制性例子包括荧光染料，如荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、罗丹明异硫氰酸酯、德克萨斯红、花菁染料，如花菁3和花菁5、和ALEXA染料；发色团，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和洋地黄毒苷；和放射性部分如32P、35S、3H、125I或14C ；和结合伴侣(binding partner)，如生物素和生物素衍生物。可探测地标记核苷酸、核苷酸类似物和/或引物的方法在本领域是熟知的。根据本文描述的方法，核苷酸——包括但不限于标记的或未标记的脱氧核苷三磷酸(dNTP)和其类似物，可包括在引物和/或扩增反应混合物中。该内容中术语“核苷酸类似物”指修饰的或非天然发生的核苷酸，尤其是可用天然发生的核苷酸或非天然发生的核苷酸、通过核酸聚合酶催化的模板指导的核酸扩增聚合的核苷酸类似物。核苷酸类似物在本领域是熟知的。特定的核苷酸类似物能够经氢键与互补核苷酸进行Watson-Crick 配对，并且示意性包括但不限于包含核苷酸碱基的类似物的那些，如取代的嘌呤或嘧啶、 脱氮嘌呤(deazapurine)、甲基嘌呤、甲基嘧啶、氨基嘌呤、氨基嘧啶、硫代嘌呤、硫代嘧啶、吲哚类、吡咯类、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤、假胞嘧啶、 假异胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、硝基吡咯、硝基吲哚、和4-甲基吲哚。核苷酸类似物包括包含脱氧核糖类似物的那些，如取代的脱氧核糖、取代的或未取代的阿拉伯糖、取代的或未取代的木糖，和取代的或未取代的吡喃糖。核苷酸类似物包括包含磷酸酯类似物的那些，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、 磷酰胺类(phosphoroamidates)、磷酸硒酸酯(phosphoroselenoates)、硫代磷酸苯胺类 (phosophoroanilothioates)、磷酸苯胺类(phosphoroanilidate)、磷酰胺类、磷酸硼、磷酸三酯、和烷基磷酸酯如甲基磷酸酯。捕获探针对扩增的核酸特异性的捕获探针存在于使扩增的核酸附着于基底的固体或半固体基底上。捕获探针可以为允许附着于基底并特异性捕获扩增的核酸的任何形式。根据一些实施方式，捕获探针是包括与扩增的靶核酸互补的核酸序列的核酸。附着于基底的捕获探针可以是单链的和/或双链核酸。在具体实施方式
中，当双链核酸捕获探针结合至基底时，在固定至基底之后它们被变性并使它们成为单链，以准备用于试验方法的某些实施方式中。任选地，双链核酸探针被变性，之后固定并接着将单链核酸结合至基底。如本文所使用的术语“互补”指核苷酸之间的Watson-Crick碱基配对，并且尤其指彼此氢键合的核苷酸，其中胸腺嘧啶或尿嘧啶残基通过两个氢键连接至腺嘌呤残基并且胞嘧啶和鸟嘌呤残基通过三个氢键连接。一般而言，核酸包括描述为与特定的第二核苷酸序列具有“百分比互补性”的核苷酸序列。例如，核苷酸序列可与特定的第二核苷酸序列具有80%、90%或100%的互补性，表示序列的10个核苷酸中的8个、10个中的9个、10个中的10与特定的第二核苷酸序列互补。例如，核苷酸序列3' -TCGA-5' 与核苷酸序列5' -AGCT-3 ‘ 100%互补。进一步，核苷酸序列3' -TCGA-与核苷酸序列5' -TTAGCTGG-3'的区域100 %或完全互补。测定关于特定核酸的具体杂交条件是常规的并且在本领域中是熟知的，例如，如在下面所描述的J. Sambrook和D. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press ； 3rd Ed. ,2001 ；禾口 F. M. Ausubel, Ed. , Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002。高严格的杂交条件是只允许充分互补的核酸杂交的那些条件。 典型地，具有约85-100%互补性的核酸认为是高度互补的并且在高严格的条件下杂交。中等严格条件的例子是具有中等互补性——约50-84%互补性——的核酸以及具有高度互补性的那些核酸杂交的条件。相比之下，低严格杂交条件是其中具有低程度互补性核酸杂交的那些条件。术语“特定杂交”和“特异性杂交”指具体的核酸与互补核酸杂交，而基本上不与样品中互补核酸以外的核酸杂交。基底用于附着捕获探针的包括半固体基底在内的固体基底可以是各种材料的任何一种，如玻璃；塑料，如聚丙烯、聚苯乙烯、尼龙；纸；硅；硝化纤维；或可在试验中使用的可附着核酸的任何其他材料。基底可以为各种形式或形状的任何一种，包括平面的，如硅片和玻璃板；和三维的，如颗粒、微量滴定板、微孔滴定板(microtiter well)、针(pin)、纤维和类似物。根据本发明方法和组合物的实施方式，对附着捕获探针的基底进行编码 (encode)。基于特征，编码的基底可彼此区分开，所述特征示例性包括光学性质，如颜色、反射率和/或刻印(imprint)图案或以其他方式可光学探测的图案。例如，基底可使用光学、 化学、物理学或电子学标签编码。在具体方面，附着捕获探针的固体基底是颗粒。捕获探针附着的颗粒可以是任何固体或半固体颗粒，其在使用中，如在杂交和标签探测条件下是稳定的并且不溶的。颗粒可以是任何形状，如圆柱形、球形等等；任何大小， 如微粒和纳米颗粒；任何组成；并且具有各种物理化学特性。可选择颗粒大小或组成，以便颗粒可与液体分开，例如，在具有特定孔大小的过滤器上或通过一些其他物理性质如磁性质分开。使用的微粒如微珠可具有小于1毫米的直径，例如，直径大小的范围为约0. 1至约 1，000微米，并包括0. 1和1，000微米，如直径约3-25微米，并包括3和25微米，或直径约 5-10微米，并包括5和10微米。使用的纳米颗粒如纳米珠的直径可从直径约1纳米(nm)至约100，OOOnm并包括1和100，OOOnm,例如，大小范围约10_1，OOOnm,并包括10和1，OOOnm, 或例如，大小范围为200-500nm，并包括200和500nm。在某些实施方式中，使用的颗粒为珠， 尤其是微珠和纳米珠。示例性地，颗粒为有机或无机颗粒，如玻璃或金属，并且可以是合成的或天然发生的聚合物颗粒，如聚苯乙烯、聚碳酸酯、硅、尼龙、纤维素、琼脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺的颗粒。在具体实施方式
中，颗粒是乳胶珠。在具体实施方式
中使用的颗粒包括用于附着核酸捕获探针的官能团。例如，颗粒可包括羧基、胺、氨基、羧酸酯、卤根、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、氧化氮、环氧和/或甲苯磺酰基的官能团。颗粒的官能团、其修饰和化学部分如核酸与其的结合是本领域已知的， 例如在下面所描述的:Fitch, R. Μ. , Polymer Colloids :A Comprehensive Introduction, Academic Press，1997。美国专利号6，048，695描述了用于将核酸捕获探针附着于基底如颗粒的示例性方法。在进一步的具体实例中，盐酸1-乙基-3_[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺——EDC或EDAC化学法——可用于将核酸捕获探针附着于颗粒。根据本发明方法和组合物的实施方式，捕获探针附着的颗粒是编码的颗粒。编码的颗粒是这样的颗粒，基于特征，其可与其他颗粒区分开，所述特征示例性包括光学性质， 如颜色、反射率和/或刻印图案或以其他方式可光学探测的图案。例如，可使用光学、化学、 物理学或电子学标签编码颗粒。编码的颗粒可包括或附着于一种或多种荧光团，所述荧光团例如通过激发和/或发射波长、发射强度、激发态寿命或这些或其他光学性质的组合是可区分开的。光学条码可用于编码颗粒。在具体实施方式
中，例如，将编码嵌入颗粒的内部，或以在杂交和分析的过程中稳定的方式另外地附着于颗粒。可以通过任何可探测的手段提供编码，如通过全息编码，通过荧光性质、颜色、形状、大小、光发射、量子点发射和类似的手段，以识别颗粒并因此识别固定于其上的捕获探针。在一些实施方式中，编码不是通过核酸提供的类型。一种示例性平台使用浸入聚合物颗粒的荧光染料的混合物作为识别已经固定特异性捕获探针的颗粒组的每个成员的手段。另一种示例性平台使用全息条码识别圆柱形玻璃颗粒。例如，Chandler等(美国专利号5，981，180)描述了基于颗粒的系统，其中不同的颗粒类型被浸入聚合物颗粒的两种或多种荧光染料的各种比例的混合物编码。Soini (美国专利号5，028，545)描述了基于颗粒的多元试验系统，其采用时间分辨荧光进行颗粒识另ij。Fulwyler (美国专利号4，499，052)描述了使用通过颜色和/或大小区分的颗粒的示例性方法。美国专利申请公开 20040179267、20040132205、20040130786、20040130761、 20040126875,20040125424和20040075907描述了通过全息条码编码的示例性颗粒。美国专利号6，916，661描述了聚合微粒，其与具有为颗粒提供编码的染料的纳米颗粒相关联。尽管本文详细描述的实施方式使用Luminex编码珠平台，但是其他类型的编码颗粒试验平台可被使用，如VeraCode珠和BeadXpress系统(Illumina Inc. , San Diego CA)、xMAP 3D (Luminex)和类似平台。可使用磁性Luminex珠，其允许漂洗步骤使用板磁体 (plate magnet)和移液管而不是使用滤板和真空歧管进行。这些平台的每一个通常被提供为羧基珠，但也可配置为包括不同的偶联化学，如氨基_硅烷。颗粒通常被单个评估以探测编码。例如，颗粒可经过流式细胞仪。示例性流式细胞仪包括Coulter Elite-ESP流式细胞仪或获自 Beckman Coulter, Inc. (Fullerton Calif.) 的 FACScan. TM.流式细胞仪和获自 Cytomation，Inc.，Fort Collins，Colo 的 M0FL0. TM.流式细胞仪。除了流式细胞术之外，离心机也可用作分开和归类颗粒的工具。合适的系统描述在美国专利号5，926，387中。除了流式细胞术和离心之外，自由流动电泳装置也可用作分开和归类颗粒的工具。合适的系统描述在美国专利号4，310，408中。颗粒也可放置在表面并扫描或成像。
提供了根据本发明使用多于一种类型编码颗粒的实施方式的试验。在具体实施方式
中，提供“颗粒组”，其中颗粒组的每个颗粒用相同的代码编码，以便颗粒组中的每个颗粒与另一“颗粒组”中的每个颗粒可区分。在进一步的实施方式中，两个或多个代码可用于单个颗粒组。例如，每个颗粒可包括独特的代码。在某些实施方式中，编码颗粒包括不是颗粒和对靶核酸特异性的核酸捕获探针的结合的代码，或编码颗粒包括颗粒和对靶核酸特异性的核酸捕获探针的结合之外另外的代码。包括两个或多个颗粒组的方法可在多元或单独的试验形式中使用。捕获探针与基底的结合通过有效将核酸结合至固体或半固体基底的多种方法的任一种，实现将核酸捕获探针结合至基底，所述方法示例性包括吸附和化学键合。核酸可直接结合至编码的颗粒的材料或间接结合至编码的颗粒，例如，经由结合至布置在颗粒上的涂层或连接体。核酸可被合成，和/或在合成后被修饰，以包括用于将核酸结合至颗粒的官能团。例如，用作探针的核酸序列可包括羧基、胺、氨基、羧酸酯、卤根、酯、醇、脲、氯甲基、氧化硫、氧化氮、环氧和/ 或甲苯磺酰基的官能团。在本文描述试验的具体实施方式
中，扩增的靶核酸被通过杂交附着于编码的颗粒的捕获探针所捕获。术语“杂交”指互补核酸的配对和结合。取决于多种因素，如核酸的互补性程度、 核酸的解链温度Tm和杂交条件的严格性，在两条核酸之间以不同的程度发生杂交，如本领域所熟知的。术语“杂交条件的严格性”就具体的普通添加剂如甲酰胺和Denhardt溶液而言，指温度、离子强度和杂交培养基组成的条件。扩增使用体外扩增方法实现靶核酸的扩增。术语“扩增方法”指用于复制模板靶核酸从而产生包含所有或部分模板靶核酸拷贝的核酸的方法。包括在本发明实施方式中的扩增方法是包括使用在靶核酸侧翼的引物对、通过核酸聚合酶催化的模板指导的引物延伸的方法，其示例性包括但不限于聚合酶链式反应 (PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、连接介导PCR(LM-PCR)、Φ-29 PCR、和其他核酸扩增方法， 例如，如在下面所描述的CW. Dieffenbach 等，PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003 ；禾口 V. Demidov 等，DNAAmplification :Current Technologies and Applications, Taylor & Francis,2004。术语“扩增的核酸”和“扩增的DNA”以及它们的复数，指复制靶核酸模板的方法的产物。引物术语“引物”指能够在适当的反应条件下作为模板指导的引物延伸产物的合成起始位点的寡核苷酸核酸。寡核苷酸引物一般的长度为约10-30个连续核苷酸并且可以更长或更短。寡核苷酸引物完全或基本上与模板核酸的区域互补，以便在杂交条件下，寡核苷酸引物与模板核酸的互补区域退火。用于合成引物延伸产物的适当反应条件包括存在适当的反应成分，其包括但不限于聚合酶和核苷三磷酸。设计适合用在扩增反应中的寡核苷酸引物在本领域中是熟知的，例如在下面所描述的A. Yuryev等，PCR Primer Design, Humana Press,2007ο
用于扩增靶核酸的引物设计对于本领域技术人员是熟知的。根据熟知的方法和标准，设计用于靶核酸扩增的引物。例如，引物的退火温度应当是大约相同的，在几度之内，引物不应当相互形成二聚体，并且引物不应当形成二级结构如发卡。引物设计和扩增过程的方法和考虑事项详细描述在下面Yuryev，Α.，PCR Primer Design, Methods in Molecular Biology, vol.42, Human Press,2007 ;CW. Dieffenbach 等，PCR Primer :A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2003 ；禾口 V. Demidov 等，DNA Amplification Current Technologies and Applications, Taylor & Francis,2004。扩增的核酸任选地包含另外的材料，例如但不限于核酸序列、化学反应的官能团和可探测标签，它们存在于引物中但不存在于起始DNA模板中。这种源于引物的材料增加了官能度，如另外扩增反应的引物结合位点和/或用于化学键合至基底的官能团。在本发明的实施方式中，扩增中使用的引物对包括在多核苷酸重复区域侧翼的引物，即引物之一具有与多核苷酸重复区域上游的靶核酸区域互补的核苷酸序列，并且引物对的第二引物具有与多核苷酸重复区域下游的靶核酸区域互补的核苷酸序列。这种引物本文称为“横跨引物”。设计来扩增包含多核苷酸重复的靶核酸并且在多核苷酸重复区域侧翼的许多横跨引物对在本领域中是已知的，其中任一个可以结合本发明的方法和组合物使用。可选地，横跨引物可只使用常规实验进行设计和应用。示例性横跨引物和它们扩增包括多核苷酸重复区域的靶核酸的应用详细描述在本文的实施例中。扩增包括在FMRl基因中存在的多核苷酸重复区域的靶核酸的横跨引物在下面描述Wilson，JA 等，J. Molec. Diagnostics，10(1) :2_12，2008，并包括1)正向引物 5' -GG AACAGCGTTGATCACGTGACGTGGTTTC-3‘ (SEQ ID No. 1)；反向引物 5' -GGGGCCTGCCCTAGAGCC AAGTACCTTGT-3 ‘ (SEQ ID No. 2) (Chong, SS.等，Am. J. Med. Genet.，1994,51 -.522-526.)； 2)正向引物 5' -GACGGAGGCGCCCGTGCCAGG-3‘ (SEQ ID No. 3)；反向引物 5' -TCCTCCATC TTCTCTTCAGCCCT-3‘ (SEQ ID No. 4)(Pergolizzi,RG.等，Lancet，1992，339 :271_272) ；3) 正向引物 5' -TGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGCGTGC-3' (SEQ ID No. 5)；反向引物 5' -GAG AGGTGGGCTGCGGGCGCTCGAGGCCCA-3 ‘ (SEQ ID No. 6) (Wang Q.，等，J. Med Genet.，1995,32 170-173.) ;4)正向引物 5' -AGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTC-3' (SEQ ID No. 7)；反向引物 5' -GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3 ‘ (SEQ ID No. 8) (Tarlton, J. , Neurogenetics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology, v.217, Potter, N. , Ed., Humana Press Inc.，Totowa, NJ, 2003), pp 29-39.) ；5)正向引物 5' -GCTCAGCTCCGTTT CGGTTTCACTTCCGGT-3' (SEQ ID No. 9)；反向引物 5' -AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCC A-3' (SEQ ID No. 10) (Verkerk, AJ.等，Cell, 1991,65 :905_914 ；Fu, YH 等，Cell, 1991, 67 :1047-1058.) ;6)正向引物 5' -GACGGAGGCGCCGCTGCCAGG-3 ' (SEQ ID No. 11);反向引物 5' -GTGGGCTGCGGGCGCTCGAGG-3' (SEQ ID No. 12) (Verkerk, AJ.等，Cell, 1991,65 905-914.)；和 7)正向引物 5' -GTGACGGAGGCGCCGCTGCCA-3' (SEQ ID No. 13)；反向引物 5' -AGCTCCTCCATCTTCTCTTCAGCCCTGCTA-3' (SEQ ID No. 14)(Fu，YH 等，Cell,1991，67 : 1047-1058.)。在本发明的实施方式中，扩增中使用的引物对包括横跨引物和重复特异性引物。 横跨引物具有与多核苷酸重复区域上游的靶核酸区域互补或与多核苷酸重复区域下游的靶核酸区域互补的核苷酸序列。重复特异性引物具有与靶核酸的部分多核苷酸重复区域互补的核苷酸序列。本文描述了包括横跨引物和重复特异性引物的示例性引物对。可选地， 这种引物可只使用常规实验进行设计和应用。在一种实施方式中，方法包括使用靶横跨引物对扩增靶核酸分子，其中一条引物包含靶探测标签；使扩增的靶DNA分子与编码的颗粒组杂交，所述颗粒包括对扩增的靶核酸分子选择性的捕获分子；探测由靶探测标签产生的信号；使用重复特异性引物对扩增多核苷酸重复区域片段，其中重复特异性引物对的一条引物是对多核苷酸重复基序特异性的，并且重复特异性引物对的另外一条引物是对多核苷酸重复区域之外的靶核酸分子序列特异性的，并且包含重复探测标签，以产生扩增的重复特异性核酸分子；并且使扩增的重复特异性核酸分子与编码颗粒组杂交，所述颗粒包括对扩增的重复特异性核酸分子选择性的捕获分子；探测由重复探测标签产生的信号；测定由靶探测标签和重复探测标签产生的信号的比率；基于测定的比率，确定多核苷酸重复区域的长度。如本文下面所描述的，也与扩增的靶DNA分子杂交的是包含重复探测标签的一个或多个重复探测器探针。重复探测器探针分子与重复区域(即多核苷酸重复基序)互补， 并且因此多个重复探测器探针可与该重复区域杂交。重复探测器探针可与扩增的靶DNA分子一起或在扩增的靶DNA分子已经被颗粒捕获之后杂交。在另一种实施方式中，测定在靶核酸分子中存在的多核苷酸重复区域长度的方法包括使用靶横跨引物对扩增靶核酸分子，其中一条引物包含靶探测标签；使扩增靶核酸分子的第一部分与第一编码颗粒组杂交，所述颗粒包括对扩增的靶核酸分子选择性的捕获分子；探测由靶探测标签产生的信号；使扩增靶核酸分子的第二部分与对多核苷酸重复基序特异性的可探测探针和第二编码颗粒组杂交，所述颗粒包括对扩增的靶DNA分子选择性的捕获分子；探测由探针(即，包含重复探测标签的重复探测探针)产生的信号；测定由靶探测标签和探针产生的信号比率；并基于所测定的比率，确定多核苷酸重复区域的长度。在进一步的实施方式中，用于测定在靶核酸分子中存在的多核苷酸重复区域长度的方法包括在至少一种类型的包含重复探测标签的脱氧核苷酸存在的情况下，使用靶横跨引物对扩增靶核酸分子，其中一条引物包含靶探测标签；使扩增的靶核酸分子与编码的颗粒组杂交，所述颗粒包括对扩增的靶核酸分子选择性的捕获分子，并探测由靶探测标签产生的信号。该方法可进一步包括探测由重复探测标签产生的信号；测定由靶探测标签和重复探测标签产生的信号比率；并基于所测定的比率，确定多核苷酸重复区域的长度。在对多核苷酸重复基序特异性的可探测探针上有重复探测标签。在一种实施方式中，方法包括在存在包括重复探测标签的脱氧核苷酸的情况下， 使用靶横跨引物对扩增靶核酸分子，其中引物对的一条引物包含靶探测标签，将扩增的靶 DNA分子结合至编码的颗粒组，每个颗粒包括对扩增的靶核酸分子的多核苷酸重复选择性的结合元件；探测相应于在颗粒结合的扩增的靶核酸分子中存在的靶探测标签数量的信号；探测相应于在结合至颗粒的扩增的靶核酸分子中存在的重复探测标签数量的信号；测定来自靶探测标签和重复探测标签的信号的比率；并基于所测定的比率，确定多核苷酸重复区域的长度。在另一种实施方式中，方法包括在存在包括重复探测标签的脱氧核苷酸的情况下，使用靶横跨引物对扩增靶核酸分子，其中引物对的一条引物包含靶探测标签，将扩增的靶DNA分子结合至编码的颗粒组，每个颗粒包括对扩增的靶核酸分子选择性的结合元件； 使颗粒结合的扩增靶核酸的一部分与使靶探测标签可探测的报道分子接触；探测相应于在颗粒结合的扩增的靶核酸分子中存在的靶探测标签数量的信号；使颗粒结合的扩增靶核酸分子的另一部分与使重复探测标签可探测的报道分子接触；探测相应于在结合至颗粒的扩增的靶核酸分子中存在的重复探测标签数量的信号；测定来自靶探测标签和重复探测标签的信号的比率；并基于所测定的比率，确定多核苷酸重复区域的长度。该方法的示例性实施图解在图11中。在该具体实施例中，对扩增的靶核酸分子选择性的结合元件存在于多核苷酸重复区域中。也可使用扩增靶核酸分子的其他部分。本文描述的方法包括使用编码的颗粒测定在靶核酸分子中存在的多核苷酸重复区域的长度。在一种实施方式中，该测定基于扩增的靶核酸分子的数量或相对量和扩增的核酸分子中多核苷酸重复的数量或相对量二者。扩增的靶核酸分子的数量或相对量和多核苷酸重复的数量可使用扩增的核酸的单独库测定，如在图IA中所图解的，或可从扩增的靶核酸的共同库中测定，如在图IB和11中所图解的。可使用各种策略进行该方法，所述策略可由使用者基于例如试验形式和可探测标签偏好(preference)或可得到的仪器附加的要求进行选择。图13图解了本文描述的方法的实施方式，其中使用横跨引物对扩增包含多核苷酸重复区域(标记的“CGG重复”)的靶核酸，其中所述对的一条引物具有靶探测标签。在该情况下，靶探测标签是荧光素标签。扩增之后，靶探测标签并入扩增的核酸，如所图解的。扩增的核酸通过与互补核酸捕获探针杂交结合至编码的颗粒，并且所得的颗粒组被分成两部分。第一部分结合至重复探测探针，在该情况下，通过和具有与部分多核苷酸重复区域互补的序列的标记寡核苷酸特异性杂交进行。在该情况下，生物素标记的寡核苷酸是重复探测标签。链霉抗生物素报道分子用于探测标签并产生第一信号。第二部分结合至对靶探测标签荧光素特异性的报道分子——在该情况下为抗-荧光素抗体，并产生第二信号。比较来自重复探测标签的信号与从靶探测标签探测的信号，以确定多核苷酸重复区域的长度。本文描述的方法包括扩增DNA分子。可使用任何合适的多核苷酸扩增技术进行扩增。本文描述了聚合酶链式反应，并且其他公开的扩增方法可适合用于本文描述的方法。本文描述的方法包括标签的探测。当实施所描述方法时，可以使用各种标签和它们互补探测模式的任何一种。下面的实施例描述了结合Luminex 200工具的荧光读取器使用荧光标签藻红蛋白，虽然其他试验读取平台如Illuumina BeadExpress、微平板、微阵列等可与它们适当的标签使用。使用两种或多种标签的平台可完成该试验，而不需要在读取之前将中间试验产物分开进入两个容器，如并入本文的单标签Luminex实施例要求的。任何适当的方法——示例性包括光谱学、光学、光化学、生物化学、酶学、电学和/ 或免疫化学——可用于在本文描述的试验中探测标签。第一信号与第二信号的比率可通过手动、机器或自动方法测定，并且所得的比率指示靶核酸中多核苷酸重复的长度。提供了分析样品核酸的方法，其包括两个或多个编码的颗粒组，其被编码以便每个编码的颗粒组的每个颗粒与每个另外编码颗粒组的每个颗粒可探测地区分开。第一颗粒组的编码颗粒包括附着的捕获探针，其特异性捕获相应于包含多核苷酸重复区域的第一靶核酸的扩增的靶核酸。第二颗粒组的编码的颗粒包括附着的捕获探针，其特异性捕获相应于包含多核苷酸重复区域的第二靶核酸的扩增的靶核酸。所描述的方法可在任何合适的容器中进行。在具体实施方式
中，例如，在打算测定多个样品时，可使用多室容器。多室容器示例性包括多凹陷(depression)基底，如载玻片、 硅片或盘。在一些实施方式中，每个样品放置在多孔板的不同孔中。例如，多孔板可以是96 孔、384孔、864孔或1536孔试验板。提供了用于测定靶核酸中多核苷酸重复长度的试剂盒。在具体实施方式
中，提供了包括编码的颗粒组和/或两个或多个编码的颗粒组混合物的试剂盒，其中每个颗粒组包括附着的对靶核酸特异性的捕获探针。使用编码的颗粒组和/或包括两个或多个编码的颗粒组的多元试剂的说明性材料任选地包括在试剂盒中。也任选地包括辅助性试剂，如缓冲液、酶、洗液、杂交溶液、可探测标签、探测试剂和类似物。根据本文描述的实施方式，提供了试验组合物，其包括包含多核苷酸重复区域的扩增的靶核酸，所述扩增的靶核酸包括第一标签和第二标签，该第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中第一和第二标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸，并且其中扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针。本文描述的组合物和试剂盒例如在进行基本上如本文所描述的用于测定多核苷酸重复区域长度的方法中是有用的。发明组合物和方法的实施方式在下面的实施例中阐述。这些实施例为了阐明的目的提供，而不认为限制了发明组合物和方法的范围。实施例1在示例性方法中，将样品DNA 1分成两个等分试样，其每个在试验过程中被独立地处理，直到来自每个路径的荧光数据被处理以产生一个或多个比率。样品1的一个等分试样的第一处理开始于重复特异性引物PCR扩增3。重复特异性引物对2包括与多核苷酸重复区域之外靶DNA杂交的一条引物和与重复区域内多个区域杂交的第二引物。在该实施例中非重复引物被末端标记，以方便随后探测PCR产物分子。在这种情况下，末端标记是生物素。在该方案中，反应产物是包含不同数量的多核苷酸重复基序的末端标记核酸的异质群体。该过程后面，生物素将被结合至标记有可探测标签的链霉抗生物素。可以使用的可选的末端标记，其包括像生物素一样当结合至伴侣(partner)时变得可探测的分子以及固有可探测的分子。PCR试剂盒7包括聚合酶、核苷酸和缓冲液。扩增的重复特异性产物DNA 4接着被特异性捕获并经历编码颗粒的杂交试验5。 特异性捕获可以例如基于互补核苷酸序列，或其他结合伴侣相互作用。杂交试剂8包括杂交缓冲液、漂洗缓冲液和荧光报道分子。在该具体实施例中，荧光报道分子是链霉抗生物素_藻红蛋白——Luminex试验的标准报道分子。扩增的重复特异性DNA分子被特异性捕获到具有固定的寡核苷酸捕获分子16的编码的颗粒组上。杂交试验5导致产生扩增的重复特异性DNA荧光信号数据6。使用相同的过程但是不同的PCR引物平行处理样品1的第二等分试样。使用靶横跨PCR引物对9进行靶扩增10。在图IA中，显示靶扩增和重复特异性扩增为同时处理。应该理解，在实践中，根据使用者偏好，可同时、连续地、以重叠方式进行扩增。这产生与捕获分子杂交的扩增的靶DNA 11。例如，当两个扩增的DNA样品的捕获区域相同时，编码的颗粒组17可与16中的相同。杂交12产生扩增的靶DNA荧光信号数据13。扩增的重复特异性DNA荧光信号数据接着与靶DNA荧光信号数据相比。通过使用两个信号的比率，抵消(compensate) 了两个PCR过程产率的变化。图9显示荧光信号的比率基本上与从25至约500个重复的男性脆性X样品的重复量成比例。因此，本文描述的方法可用于测定在约25和约500个重复之间的多核苷酸重复区域的长度。例如，多核苷酸重复区域的长度可在约200和约500个重复之间，以及约300和约500重复之间。图2描绘了靶横跨引物对和靶DNA的示例性PCR结构。靶序列21包括多核苷酸重复序列24，取决于个体的基因座，其可具有可变长度。重复区域分别在5'和3'末端非重复序列22和23的侧翼。靶横跨引物25和26与在重复区域侧翼的非重复序列互补。在该实施例中，5'引物用生物素27末端标记，以方便随后用荧光链霉抗生物素-藻红蛋白报道分子探测PCR产物(也称为扩增的靶DNA分子)。同时在该实施例中，在5'端上引物定位，以便在引物的末端和重复区域的开始之间具有捕获28序列。该序列用于随后的PCR产物的杂交捕获。图3描绘了重复特异性引物对和重复特异性DNA的示例性PCR结构。靶序列31 包括多核苷酸重复序列34，取决于个体的基因座，其可具有可变长度。重复区域分别在5' 和3'末端非重复序列32和33的侧翼。5'非重复引物36位于重复区域34的5'，并且在该实施例中，引物用生物素37末端标记，以方便探测所得PCR产物DNA(也称为扩增的重复特异性DNA分子)。限定非重复引物，以便在非重复引物和重复区域之间有非重复区域DNA 38，其中该非重复区域可用于随后捕获或探测所得的PCR产物。该非重复引物可以与上面描述的5'靶横跨引物相同。第二引物35是重复特异性引物，即它与重复区域杂交。这种重复引物可以在沿着重复区域的大量位置的任一个处杂交。图4描绘了与图3相似的示例性可选PCR结构，除了非重复和重复引物的相对位置颠倒。靶序列41包括重复序列44，其可具有可变的长度。重复区域分别在5'和3'末端非重复序列42和43的侧翼。3'非重复引物46位于重复区域44的3'，并且在该实施例中，引物用生物素47末端标记，以方便探测所得PCR产物DNA(也称为扩增的重复特异性 DNA分子)。限定非重复引物，以便在非重复引物和重复区域之间有非重复区域DNA 48，其中该非重复区域可用于随后捕获或探测所得PCR产物。该非重复引物可以与上面描述的 5'靶横跨引物相同。第二引物46是重复特异性引物，即它与重复区域杂交。这种重复特异性引物可以在沿着重复区域的大量位置的任一个处杂交。图5A描绘了通过图2的PCR结构产生的扩增的DNA分子52。该扩增的靶DNA分子包含在5'端的生物素标签50、5'非重复序列53、可变长度的重复区域51和3'非重复区域54。图5B描绘了通过图3的PCR结构产生的扩增的DNA分子58。该扩增的重复特异性DNA分子包含在5'端的生物素标签55、5'非重复序列56和可变长度的重复序列57。 图5C描绘了通过图4的PCR结构产生的扩增的DNA分子。该扩增的重复特异性DNA分子包含在3'端的生物素标签61、3'非重复序列59和可变的重复序列60。图6示意性描绘了固定在编码颗粒上的单个寡核苷酸捕获分子，其中结合的扩增靶DNA分子来自如在图5A中所显示的PCR结构。在该实施例中，编码的颗粒77，如Luminex xMAP珠，具有许多与它的表面连接的寡核苷酸捕获分子74 (在该图中只显示了一个分子)。 设计捕获寡核苷酸74与由上述方法产生的靶DNA分子76的非重复区域72互补。捕获的扩增的靶DNA分子包含在一个末端上的可探测标签71——在该实施例中为生物素，并包含重复区域75和非重复区域73。图7示意性描绘了固定在编码颗粒上的单个寡核苷酸捕获分子，和结合的扩增的重复特异性DNA分子。在该实施例中，编码的颗粒86，如Luminex xMAP珠，具有许多与它的表面连接的寡核苷酸捕获分子83 (在该图中只显示了一个分子)。设计捕获寡核苷酸83 与图5B或5C描述的那些重复特异性引物产生的重复特异性DNA分子的非重复区域82互补。捕获的重复特异性DNA分子具有在一个末端上的可探测标签81——在该实施例中为生物素，和重复区域84。图8示意性描绘了固定在编码颗粒上的单个寡核苷酸捕获分子，并且单个扩增的靶DNA分子来自如在图5中所显示的那些PCR构造之一。在该实施例中，编码的颗粒97， 如Luminex xMAP珠，具有许多与它的表面连接的寡核苷酸捕获分子94(在该图中只显示了一个分子)。设计捕获寡核苷酸94与通过在图5A中所描述的靶横跨引物对产生的扩增靶 DNA分子的非重复区域92互补。捕获的扩增靶DNA分子具有在一个末端上的可探测标签 91——该实施例中为生物素，并具有重复区域98。也与扩增的靶DNA分子96杂交的是一个或多个重复探测器探针99。一个或多个可探测标签100—在该实施例中为生物素一并入每个重复探测器探针。重复探测器探针分子与重复区域98互补，并且多个重复探测器探针可与重复区域杂交。重复探测器探针可以和扩增的靶DNA分子一起或在扩增的靶DNA分子已经被珠捕获之后杂交。注意，捕获的扩增的靶DNA分子中重复区域越长，越多的标记重复探测器探针将与它杂交，并且将产生并探测的信号越大。因此，本方法产生与在扩增的靶DNA分子中包含的多核苷酸重复区域的长度成比例的荧光信号。图9是来自根据在图1中概括的方法的第一个实施例试验的实施例数据。沿着水平轴的值是根据细胞系DNA样品供应商(Coriell Institute for Medical Research, Trenton NJ)的CGG重复的数量。样品表示具有25、83、110和477的脆性X重复长度的男性。沿着图垂直轴的值是如根据第一实施例计算的比率——重复特异性DNA产生的荧光信号除以相同样品的扩增靶DNA的荧光信号的比率。在该范围内，比率数据单调增加，并且近似地与重复区域长度成线性。实施例2图IB是示例性方法流程图，其显示了用于测定靶DNA分子中多核苷酸重复区域长度的另一种示例性方法。详细参考图1B，使用靶横跨引物111和PCR试剂盒101，PCR扩增102样品DNA 114。产生扩增的靶DNA分子103，并且该产物的两个等分试样接着被引导通过两个试验路径。第一等分试样经历重复探测探针试验106，如在图8中所示的。将重复探测探针105、具有固定的捕获寡核苷酸的编码的颗粒组115和杂交试剂106结合并杂交。杂交试剂包括杂交缓冲液、漂洗缓冲液和链霉抗生物素_藻红蛋白荧光报道分子，其特异性结合之前并入的生物素标签。可选地，具有固定探针的编码的颗粒组和重复探测器探针可以以任何次序顺序杂交。重复探测探针以与重复区域长度近似成比例地与扩增的靶DNA分子杂交，从扩
增的靶DNA分子上末端标签加上一个额外的标签。当该试验的产物以合适的探测工具——
在该实施例中为Luminex 200——读取时，产生重复探测探针荧光信号数据107。 靶DNA的第二等分试样用类似的试验处理，其省略重复探测探针。编码颗粒横跨
引物试验112具有扩增的靶DNA分子103、相同的具有固定探针的编码的颗粒组115和杂交
试剂110的输入。使用相同的试验方案，该版本产生来自每个PCR产物分子上的一个生物
素标签的扩增靶DNA分子荧光信号数据113，而不管重复区域长度如何。 对于每个样品，计算扩增的重复特异性DNA分子荧光信号数据107与扩增的靶DNA
分子荧光信号数据113的比率。通过扩增的靶DNA分子荧光信号数据在分母中计算比率，
产生样品重复数据——多核苷酸重复区域长度的近似描绘，如在下面实施例数据中所显示的。图10是来自根据在图IB中概括的方法的第二实施例试验的实施例数据。沿着水平轴的值是根据细胞系DNA样品供应商(Coriell Institute for Medical Research, Trenton NJ)的CGG重复的数量。样品表示具有25、83、110、477和1，200脆性X重复长度的男性。沿着图垂直轴的值是如根据第二实施例计算的比率——杂交的重复探测器探针产生的荧光信号除以相同样品的扩增靶DNA的荧光信号的比率。在该范围内，比率数据单调增加，并且近似地与重复长度成线性。实施例3该实施例显示用于测定脆性X基因靶DNA分子的多核苷酸重复区域长度的方案。PCR 材料PCR 试剂盒Fast Start TAQ 聚合酶(Cat # 12 032 902 001 或 12032937001， Roche Molecular, Indianapolis,IN)5M 甜菜碱(Sigma-Aldrich，St Louis, M0)正常男性DNA (Promega，Madison，WI)正常女性 DNA (Promega)横跨引物(Euro fins MWG Operon，Huntsville，AL)(在本公开中所有寡核苷酸的来源)5'引物[生物素-5]GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT(SEQ ID No. 16)3'引物AGCCCCGCACTTCCACCACCAGCTCCTCCA(SEQ ID No. 17)CCG重复引物5'引物[生物素-5]GCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT(SEQ ID No. 16)(与上面5'横跨引物相同)3' CCG 引物-CTCGAGGCCCAGCCGCCGCCGCCG(SEQ ID No. 18)样品DNA 的 PCR使用Roche Fast Start 制备 PCR 混合物在冰上如下制备PCR预混合物1个反应的预混合物，25 μ L体积9μ L dH20IOyL 5M 甜菜碱2. 5 μ L 10 X PCR 反应缓冲液(具有 20mM MgCl2)
1. 25 μ L IOmM dNTP 混合物0.75 μ L 10 μ M 引物 10· 75 μ L 10 μ M 引物 20· 25 μ L 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶0· 5 μ L 模板(样品 DNA)，100_300ng/ μ L或，10个反应的预混合物，50 μ L体积180 μ L dH20200 μ L 5M 甜菜碱5 μ L 10 X PCR 反应缓冲液(具有 20mM MgCl2)2. 5 μ L IOmM dNTP 混合物15 μ L 10 μ M 引物 115 μ L 10 μ M 引物 25 μ L 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶分配49 μ L预混合物+样品DNA进入在冰上的薄壁PCR管或板以100-300ngs/ μ L添加1 μ 1的男性和女性参考至每个具有横跨引物和CGG重复引物的孔。给管或板适当地加盖。将管放在循环仪上并运行FMRl PCR模式(估计时间6小时)。从循环仪中移出管。保存在-20°C或继续凝胶分析。PCR 循环(PTC100, MJ Research, ffatertown, ΜΑ)98 °C，10 分钟10个循环97°C，35 秒，64°C，35 秒，68 °C，4 分钟。25个循环97°C，35 秒，64°C，35 秒，68°C，4分钟，为每个循环加20秒增加延伸。68 °C，10 分钟4°C 保持Luminex 珠杂交固定的捕获分子 5' CTGGCAGCGGCGCCTCCGTCAC(SEQ ID No. 19)珠编码 27 和 / 或 28每个标准Luminex EDC方案，寡核苷酸与珠连接杂交试剂
权利要求
1.测定靶核酸中多核苷酸重复区域的长度的方法，包括扩增包括多核苷酸重复区域的靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签和第二标签标记所述扩增的靶核酸，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中所述第一标签和第二标签在所述扩增期间或扩增之后各自独立地并入所述扩增的靶核酸；将所述扩增的靶核酸结合至对所述扩增的靶核酸特异性的捕获探针；探测与所述捕获探针相关联的所述第一标签以产生第一信号；探测与所述捕获探针相关联的所述第二标签以产生第二信号；并且测定所述第一信号和所述第二信号的比率，其中所述比率指示所述靶核酸中所述多核苷酸重复区域的长度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中结合所述扩增的靶核酸包括特异性杂交所述扩增的靶核酸与互补核酸捕获探针。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标签并入在扩增所述靶核酸中使用的横跨引物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标签存在于在扩增所述靶核酸以产生所述扩增的靶核酸中使用的的核苷酸中。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二标签存在于与所述扩增的靶核酸中多核苷酸重复特异性结合的探针中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述探针是核酸探针。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针是对所述扩增的靶核酸的所述多核苷酸重复区域特异性的。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获探针包括编码的基底。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸分离自生物样品。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是基因组DNA。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述生物样品获自个体对象。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体对象是人。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述个体对象具有选自下列的三核苷酸重复序列扩张疾病或处在具有三核苷酸重复序列扩张疾病的风险下齿状核红核苍白球丘脑下核萎缩、亨廷顿病、脊延髓肌萎缩症、脊髓小脑性共济失调1型、脊髓小脑性共济失调2型、脊髓小脑性共济失调3型、脊髓小脑性共济失调6型、脊髓小脑性共济失调7型、脊髓小脑性共济失调17型、脆性X染色体综合征；脆性XE智力迟钝；弗里德希氏共济失调；肌强直性营养不良；脊髓小脑性共济失调8型和脊髓小脑性共济失调12型。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述编码的基底是多个编码的颗粒，产生第一颗粒组。
15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括扩增参考核酸多核苷酸重复区域以产生扩增的靶参考核酸；用第一标签和第二标签标记所述扩增的靶参考核酸，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中所述第一标签和第二标签在所述扩增期间或扩增之后各自独立地并入所述扩增的靶参考核酸；将所述扩增的靶参考核酸结合至对所述扩增的靶参考核酸特异性的捕获探针； 探测与所述捕获探针相关联的所述第一标签以产生第三信号； 探测与所述捕获探针相关联的所述第二标签以产生第四信号； 测定所述第三信号和所述第四信号的比率，其中该比率指示所述靶参考核酸中所述多核苷酸重复区域的长度；并且比较所述第一信号和所述第二信号的比率与所述第三信号和所述第四信号的比率。
16.根据权利要求1所述的方法，进一步包括 扩增第二靶核酸以产生扩增的第二靶核酸；用第一标签和第二标签标记所述扩增的第二靶核酸，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将所述扩增的第二靶核酸结合至对所述扩增的第二靶核酸特异性的捕获探针； 探测与所述捕获探针相关联的所述第一标签以产生第一信号； 探测与所述捕获探针相关联的所述第二标签以产生第二信号；并且测定所述第一信号和所述第二信号的比率，其中该比率指示所述第二靶核酸中所述多核苷酸重复的长度。
17.根据权利要求16所述的方法，其中第二编码的基底是多个编码的颗粒，产生第二颗粒组。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述第一颗粒组和第二颗粒组在将所述扩增的第一靶核酸和第二靶核酸结合至所述第一编码的基底和第二编码的基底期间一起在反应器中存在。
19.测定靶核酸中多核苷酸重复区域的长度的方法，包括 扩增靶核酸以产生扩增的靶核酸；用第一标签标记所述扩增的靶核酸，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量； 将所述扩增的靶核酸结合至对所述扩增的靶核酸特异性的第一捕获探针； 扩增所述靶核酸以产生多核苷酸重复区域核酸；用第二标签标记所述多核苷酸重复区域核酸，所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将所述多核苷酸重复区域核酸结合至对所述多核苷酸重复区域核酸特异性的第二捕获探针；探测与所述第一捕获探针相关联的所述第一标签以产生第一信号； 探测与所述第二捕获探针相关联的所述第二标签以产生第二信号；并且测定所述第一信号和所述第二信号的比率，其中所述比率指示所述靶核酸中所述多核苷酸重复的长度。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一捕获探针和第二捕获探针相同。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述第一捕获探针和第二捕获探针不同。
22.筛选遗传条件的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法，包括 扩增获自所述个体的样品的靶核酸以产生扩增的靶核酸，其中所述扩增的靶核酸包含第一标签和第二标签，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例；将所述扩增的靶核酸结合至对所述扩增的靶核酸的所述多核苷酸重复特异性的捕获探针；探测与所述捕获探针相关联的所述第一标签以产生第一信号；探测与所述捕获探针相关联的所述第二标签以产生第二信号；测定所述第一信号和所述第二信号的比率，其中所述比率指示所述靶核酸中所述多核苷酸重复区域的长度，并且比较该测定的比率与来自对照样品的比率，以确定在所述个体中存在改变的多核苷酸重复区域。
23.一种组合物，其包括包括多核苷酸重复区域的扩增的靶核酸，所述扩增的靶核酸包括第一标签和第二标签，所述第一标签不依赖于多核苷酸重复的数量并且所述第二标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中所述第一标签和第二标签在所述扩增期间或扩增之后各自独立地并入所述扩增的靶核酸，其中所述扩增的靶核酸结合至对所述扩增的靶核酸特异性的捕获探针。
24.基本上如本文所描述的测定多核苷酸重复区域的长度的方法。
25.基本上如本文所描述的筛选遗传条件的特征为靶核酸中改变的多核苷酸重复区域的个体的方法。
26.基本上如本文所描述的用于测定多核苷酸重复区域的长度的组合物。
全文摘要
本文提供了测定靶核酸中多核苷酸重复区域长度的方法，其包括用靶探测标签和重复探测标签标记扩增的靶核酸，靶探测标签不依赖于多核苷酸重复的数量，重复探测标签与多核苷酸重复的数量成比例，其中两种类型的标签在扩增期间或扩增之后各自独立地并入扩增的靶核酸；将扩增的靶核酸结合至对扩增的靶核酸特异性的捕获探针；探测与捕获探针相关联的靶探测标签以产生第一信号；探测与捕获探针相关联的重复探测标签以产生第二信号；并测定第一信号和第二信号的比率，其中该比率指示靶核酸中多核苷酸重复区域的长度。
文档编号C12N15/11GK102482718SQ201080040195
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月12日 优先权日2009年7月10日
发明者K·E·小阿德勒 申请人:珀金埃尔默健康科学股份有限公司