专利名称：重组微生物和利用其生产脂肪族聚酯的方法
技术领域：
本发明涉及已经通过将预定基因引入宿主微生物中而赋予期望功能的重组微生物和利用其生产脂肪族聚酯的方法。
背景技术：
作为能在自然界中容易地降解的生物可降解塑料或作为能从可再生碳资源(如糖或植物油)中合成的“绿色塑料”，脂肪族聚酯已获得日益增多的关注。目前，具有乳酸骨架(lactic acid skeleton)的脂肪族聚酯(例如聚乳酸酯，polylactate)已在实践中使用。在例如专利文献1 (WO 2006/U6796)中公开的技术已知是使用重组微生物生产脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)的技术。专利文献1公开了重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其是通过将编码使乳酸转化为乳酸CoA之酶的基因和编码利用乳酸CoA作为底物合成聚羟基烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)之酶的基因引入作为宿主的大肠埃希氏菌而获得的。在专利文献1中公开的技术中，源自丙酸梭菌(Clostridium propionic·)的pet 基因被用作编码将乳酸转化为乳酸CoA之酶的基因。此外，在这种情况下，源自假单胞菌属 61-3菌株的phaC2基因被用作编码利用乳酸CoA为底物合成聚羟基烷酸酯之酶的基因。然而，在专利文献1的情况中，不能说达到了足够水平的脂肪族聚酯(例如聚乳酸酯)生产力。此外，尚未针对提高该生产力进行充分讨论。例如，专利文献2(W0 2008/062999)公开了这样的尝试，即通过向源自假单胞菌属6_19菌株的phaCl基因中引入特定突变，来提高利用乳酸CoA为底物合成乳酸均聚物或聚乳酸酯共聚物的能力。同时，在例如专利文献3(US 7，186J41)中已经公开，源自埃氏巨球形菌 (Megasphaera elsdenii)的—因(T^llil: -CoA(propionyl-CoA transferase gene，pct基因))是编码将乳酸转化为乳酸CoA之酶的基因。然而，在专利文献3中，没有考查或比较各种丙酰-CoA转移酶基因的活性水平。此外，专利文献3没有像专利文献1中那样公开涉及使用上述基因生产脂肪族聚酯的技术。引文列表专利文献PTL 1 专利文献 1 :W0 2006/126796PTL 2 专利文献 2 :W0 2008/062999PTL 3 专利文献 3 =US 7，186，54
发明内容
技术问题如上文所述，使用重组微生物生产脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)的技术存在脂肪族聚酯生产力低的问题。此外，就生产力提高而言，不能说该技术已被充分地研究。因此，本发明的一个目的是提供表现出优秀脂肪族聚酯生产力的重组微生物和使用该重组微生物
3生产脂肪族聚酯的方法。问题的解决方案由于为实现上述目的而进行了深入研究，本发明人已发现，向其中引入了预定的微生物来源的丙酰-CoA转移酶基因和预定的微生物来源的聚羟基烷酸酯合酶基因的重组微生物具有极其优秀的脂肪族聚酯(如聚乳酸酯)生产力。这导致了本发明的完成。具体来说，本发明包括以下内容。本发明的重组微生物是通过将下文中所示选自基因(a)至(C)的基因和选自基因 (d)至(f)的基因引入宿主微生物中而获得的(a)编码具有SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的蛋白质的基因；(b)编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过替换、缺失或添加1或更多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有将乳酸转化为乳酸CoA的活性；(c)在严格条件下与具有与SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列互补之核苷酸序列的多核苷酸杂交的基因，并且所述基因编码具有将乳酸转化成乳酸CoA之活性的蛋白质；(d)编码具有SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的蛋白质的基因；(e)编码蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过替换、缺失或添加1或更多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯的活性；和(f)在严格条件下与具有与SEQ ID NO :5或7所示核苷酸序列互补之核苷酸序列的多核苷酸杂交的基因，并且所述基因编码具有用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白质。特别优选地，本发明的重组微生物是用大肠埃希氏菌作为宿主微生物而获得的。 此外，本发明的重组微生物可以是这样的微生物，其中不仅引入了上述两种基因，而且引入了编码参与脂肪族聚酯合成系统之酶的基因。其中已经引入上述两种基因的重组微生物能使用培养基中的碳源合成聚乳酸酯均聚物。其中不仅引入上述两种基因而且引入了编码参与脂肪族聚酯合成系统之酶的基因的重组微生物能使用培养基中的碳源合成乳酸共聚物。 在本文中，术语“乳酸共聚物，，是指具有如下聚合物骨架的聚合物，所述聚合物骨架包含乳酸骨架和非乳酸的羟基烷酸酯(hydroxyalkanoate)骨架。此外，根据本发明，可提供使用本发明的重组微生物生产脂肪族聚酯的上述方法。 具体地说，本发明的用于生产脂肪族聚酯的方法包括培养微生物和从培养基中收集脂肪族聚酯的步骤。发明的有益效果根据本发明，可提供具有优秀脂肪族聚酯生产能力的重组微生物。具体地说，与常规重组微生物相比，本发明的重组微生物具有极其优秀的脂肪族聚酯生产能力。通过使用本发明的重组微生物，可提供具有优秀生产力的用于生产脂肪族聚酯的方法。附图简述[
图1]图1是特征图，其显示对于源自丙酸梭菌的丙酰-CoA转移酶基因、源自埃氏巨球形菌的丙酰-CoA转移酶基因和源自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)的丙酰-CoA转移酶基因将乳酸转化成为乳酸CoA之活性的评价结果。
[图2]图2是特征图，其显示对于与源自埃氏巨球形菌的丙酰-CoA转移酶基因一起表达的多种聚羟基烷酸酯合酶基因之聚乳酸酯生产力的评价结果。
具体实施例方式下文中详细地描述了本发明的重组微生物和使用所述重组微生物生产脂肪族聚酯的方法。本发明的重组微生物是通过将预定的丙酰-CoA转移酶基因(pet基因)和预定的聚羟基烷酸酯合酶基因引入宿主微生物中而获得的。丙酰-CoA转移酶基因在本发明中，丙酰-CoA转移酶基因(下文中称为pet基因)的实例包括源自埃氏巨球形菌的基因和源自金黄色葡萄球菌的基因。SEQ ID NO :1显示源自埃氏巨球形菌的 pet基因之编码区的核苷酸序列。SEQ ID NO :2显示由所述pet基因编码的蛋白质的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO :3显示源自金黄色葡萄球菌的pet基因之编码区的核苷酸序列。 SEQ ID NO :4显示由所述pet基因编码的蛋白质的氨基酸序列。具有SEQ ID N0:2或4所示氨基酸序列的蛋白质具有丙酰-CoA转移酶活性，尤其是利用乳酸作为底物合成乳酸CoA 的活性。此外，本发明的pet基因的实例不限于具有编码SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因，并且可包括编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过缺失、替换或添加1或更多个氨基酸而衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列并且具有将乳酸转化为乳酸CoA的活性。在本文中，术语“1或更多个氨基酸”是指例如1至20，优选1至10，更优选1至7，更优选1至5，尤其优选1至3个氨基酸。此外，本发明的pet基因可以是编码具有如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有与 SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列有例如70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高以及最优选95%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并且具有将乳酸转化为乳酸CoA的活性。在本文中，所述序列相似性值是指按默认设置使用执行BLAST算法的计算机程序和含有基因序列信息的数据库所获得的值。此外，本发明的pet基因可以是具有以下多核苷酸的基因，所述多核苷酸在严格条件下与具有SEQ ID NO :1或3所示核苷酸序列之基因的至少一部分杂交，并且编码具有将乳酸转化为乳酸CoA之活性的蛋白质。在本文中，术语“在严格条件下”是指被称为引起特异性杂交体形成而不引起非特异性杂交体形成的条件。例如，在45°C下用6XSSC(氯化钠/柠檬酸钠)杂交并随后在50°C至65°C下用0. 2至IXSSC和0. 1 % SDS清洗的条件可称为这样的条件。或者，在65°C至70°C下用IXSSC杂交并随后在65°C至70°C 下用0.3XSSC清洗的条件可称为这样的条件。可通过常规的已知方法进行杂交，例如， J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory(1989)中描述的方法。此外，可通过本领域中已知的技术，如上文所述通过修饰编码转录因子的核苷酸序列来进行氨基酸的缺失、替换或添加。可通过已知的方法引起核苷酸序列中的诱变，例如 Kimkel法、缺口双链体法或与这类已知方法相似的方法。例如，可通过使用基于定点诱变方法的诱变试剂盒(例如，Mutant-K或Mutant-G (产品名称，TAKARA Bio)),LA PCR体外诱变系列试剂盒(产品名称，TAKARA Bio)等来引起诱变。或者，诱变方法可以是使用化学诱变
5剂(以EMS(甲磺酸乙酯，ethyl methanesulfonate)、5_溴尿嘧啶、2_氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍或不同的致癌化合物为代表)的方法、包括使用放射线(X-射线、α-射线、β-射线、Y-射线或离子束)进行放射处理的方法或包括紫外处理的方法。聚羟基烷酸酯合酶基因如专利文献1 (W0 2006/126796)中所公开，已知聚羟基烷酸酯合酶基因(也称为 PHA合酶基因)存在于很多微生物中。尤其是在本发明中，特定的聚羟基烷酸酯合酶基因与上述pet基因一起在宿主微生物中表达。具体地说，可使用源自假单胞菌属61-3菌株的聚羟基烷酸酯合酶基因(phaC2基因)和/或源自泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis) SK2菌株的聚羟基烷酸酯合酶基因作为本发明所用的聚羟基烷酸酯合酶基因。SEQ ID NO 5显示源自假单胞菌属61-3菌株的聚羟基烷酸酯合酶基因(phaC2基因)之编码区的核苷酸序列。SEQ ID NO :6显示由所述phaC2基因编码的蛋白质的氨基酸序列。此外，SEQ ID NO 7显示源自泊库岛食烷菌SK2菌株的聚羟基烷酸酯合酶基因之编码区的核苷酸序列。 SEQID NO :8显示由所述聚羟基烷酸酯合酶基因编码的蛋白质的氨基酸序列。具有SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的蛋白质具有合成聚羟基烷酸酯的活性，尤其是用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯的活性或利用乳酸CoA和不同的羟基烷酸酯为底物合成基于聚乳酸酯的共聚物的活性。此外，本发明的PHA合酶基因的实例不限于具有编码SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的核苷酸序列的基因，还可包括编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过缺失、替换或添加1或更多个氨基酸而衍生自所述氨基酸序列的氨基酸序列，并且具有用乳酸CoA 为底物合成聚乳酸酯的活性。在本文中，术语“1或更多个氨基酸”是指例如1至20，优选 1至10，更优选1至7，更优选1至5，尤其优选1至3个氨基酸。此外，本发明的PHA合酶基因可以是编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列具有例如70%或更高、优选80%或更高、更优选90%或更高以及最优选95%或更高的序列相似性的氨基酸序列，并且具有利用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯的活性。在本文中，所述序列相似性值是指按默认设置使用执行BLAST算法的计算机程序和含有基因序列信息的数据库所获得的值。此外，本发明的PHA合酶基因可以是具有以下多核苷酸的基因，所述多核苷酸在严格条件下与具有SEQ ID NO :5或7所示核苷酸序列之基因的至少一部分杂交，并且编码具有用乳酸CoA作为底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白质。此外，术语“严格条件”是指与描述“丙酰-CoA转移酶基因”的段落中相同的定义。此外，在描述“丙酰-CoA转移酶基因”的段落中举例说明的技术可用于氨基酸的缺失、替换或添加。宿主微生物本发明的宿主微生物的实例包括属于假单孢菌属(I^eudomonas)的细菌，如假单孢菌属61-3菌株；属于雷氏菌属(Ralstonia)的细菌，如真养雷氏菌(R. eutropha)； 属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌，如大肠埃希氏菌(Escherichia coll)；属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的细菌；属于酵母属(Saccharomyces)的酵母，如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)；和属于假丝酵母属(genus Candida)的酵母，如麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)。尤其优选使用大肠埃希氏菌作为宿主微生物。用于将上述基因引入宿主细胞的载体可以是能够在宿主中自主复制的载体，其优选为质粒DNA或噬菌体DNA的形式。要引入大肠埃希氏菌的载体的实例包括质粒DNA，如 pBR322、pUC18 和 pBLuescript II ；和噬菌体 DNA，如 EMBL3、M13 和 λ-gtll。要引入酵母的载体的实例包括YEp 13和YCp50。可使用本领域技术人员已知的基因重组技术来将上述两个基因或其中之一插入载体。此外，重组时，优选将所述基因连接至能够调节转录的启动子的下游。可使用任何启动子，只要其可在宿主中调节基因转录即可。例如，在使用大肠埃希氏菌作为宿主的情况下，可使用trp启动子、Iac启动子、PL启动子、I3R启动子、T7启动子等。在使用酵母作为宿主的情况下，可使用gall启动子、gal 10启动子等。此外，可在微生物中用于基因引入的终止子序列、增强子序列、剪接信号序列、 poly-Α添加信号序列、核糖体结合序列(SD序列)、选择标记基因等可根据需要连接至载体。除了药物抗性基因(例如，氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、新霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和氯霉素抗性基因)之外，选择标记基因的实例包括参与营养物(如氨基酸或核酸)的细胞内生物合成的基因和编码荧光蛋白(如萤光素酶)的基因。可通过本领域中已知的方法将上述载体引入微生物。用于将载体引入微生物的方法的实例包括磷酸钙法、电穿孔法、原生质球法、醋酸锂法、接合转移法和使用钙离子的方法。脂肪族聚酯的生产可如下生产目标脂肪族聚酯在含有碳源的培养基中培养重组微生物(所述微生物是通过如上文所述将pet基因和PHA合酶基因引入宿主微生物中而获得的)，以在培养的细菌细胞或培养物中引起脂肪族聚酯的产生和积累，之后从所述培养的细菌细胞或所述培养物中收集脂肪族聚酯。上述重组微生物在糖代谢途径中由糖合成乳酸，pet基因编码的丙酰-CoA转移酶随后将乳酸转化为乳酸CoA。此外，在所述重组微生物中，由PHA合酶基因编码的PHA合酶利用乳酸CoA为底物合成脂肪族聚酯，所述脂肪族聚酯包含乳酸作为构建块(building block)。在本文中，脂肪族聚酯可以是聚乳酸酯(均聚物)(其包含由乳酸组成的构建块)或者是基于乳酸的共聚物(其包含由乳酸和非乳酸的羟基烷酸组成的构建块)。当合成聚乳酸酯(均聚物)时，不将非乳酸的羟基烷酸添加至培养基，或者使得宿主微生物缺乏非乳酸羟基烷酸生物合成途径。相对而言，当合成基于乳酸的共聚物(其包含由乳酸和非乳酸羟基烷酸组成的构建块)时，可将非乳酸羟基烷酸添加至培养基，或者使得宿主微生物具有非乳酸羟基烷酸生物合成途径。碳源的实例包括碳水化合物，例如葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖。此外，可使用具有4或更高碳数的油脂相关物质(fat-and-oil-related substance)作为碳源。具有4或更高碳数的油脂相关物质的实例包括天然油脂，例如玉米油、大豆油、红花油、葵花籽油、 橄榄油、椰子油、棕榈油、菜籽油、鱼油、全油(whole oil)、猪油或牛油；脂肪酸，例如丁酸、 戊酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚麻酸、亚油酸、肉豆蔻酸，或其脂肪酸酯；和醇，例如辛醇、月桂醇、油醇、棕榈醇，或其酯。除了铵盐(例如，氨、氯化铵、硫酸铵和磷酸铵)之外，氮源的实例包括蛋白胨、肉提取物、酵母提取物和玉米浆。无机物质的实例包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸
7镁和氯化钠。一般来说，优选在有氧条件下进行培养，在pet基因和PHA合酶基因的表达开始之后，在25°C至37°C下振摇培养或类似地培养至少M小时。在培养过程中可以向培养基中添加抗生素(例如，卡那霉素、氨苄青霉素或四环素)。对于在诱导启动子控制下已引入pet 基因和PHA合酶基因中一种或两种的情况，优选在将诱导从启动子转录的因子添加至培养基之后进行至少M小时的培养。尤其优选培养已经弓I入上述pet基因和PHA合酶基因的重组大肠埃希氏菌来生产聚乳酸酯。在该方法中，可生产聚乳酸酯，而无需将构成目标聚合物的单体组分(如乳酸) 添加至培养基，这在生产成本方面是有利的。此外，可通过本领域中已知的方法来收集脂肪族聚酯(如乳酸)。例如，通过进行离心和清洗，继之以干燥，而从培养溶液中收获。随后，将干燥的细菌细胞悬浮于氯仿中并加热。从而用氯仿级分提取目标聚酯。进而，向所述氯仿溶液中添加甲醇以沉淀所述聚酯， 随后通过过滤或离心去除上清液，随后干燥。由此可获得纯化的聚酯。可通过一般方法如气相色谱法或核磁共振法来证实所收集的聚酯为聚乳酸酯。实施例下文中参照以下实施例更详细地描述了本发明，但本发明的技术范围并不限于此。(实施例1)多种pet基因的评价在本实施例中，评价了源自丙酸梭菌的pet基因、源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黄色葡萄球菌的pet基因将乳酸转化为乳酸CoA的活性。制备了 pTV118N-C.P PCT 载体、pTV118N-M.E PCT载体和pTV118N-S.A PCT载体，分别用于引入源自丙酸梭菌的pet 基因、源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黄色葡萄球菌的pet基因。首先，通过一般方法获得埃氏巨球形菌(ATCC17753)、金黄色葡萄球菌 (ATCC10832)和丙酸梭菌(ATCC25522)的基因组。通过PCR法获得每个pet基因。使用以下引物用于扩增含有源自埃氏巨球形菌的Pct基因的DNA片段=MePCTN 5' -atgagaaaag tagaaatcattac-3‘ (SEQ ID NO 9)；和MePCTC -ttattttttcagtcccatgggaccgtcctg-3 ‘(SEQ ID NO 10)。使用以下引物用于扩增含有源自金黄色葡萄球菌(ATCC10832)的pet 基因的 DNA 片段SpctN :5' -gtgccatggaacaaatcacatggcacgac-3' (SEQ ID NO :11);禾口 SpctC 5' -cacgaattcatactttatgaattgattg-3' (SEQ ID NO : 12)。使用以下引物用于扩增含有源自丙酸梭菌(ATCC25522)的pet基因的DNA片段=CpPCTN 5' -gggggccatgggaaa ggttcccattattaccgcagatgag-3‘ (SEQ ID NO 13)；禾口CpPCTC :5' -ggggggctcgagtcaggac ttcatttccttcagacccat-3‘ (SEQ ID NO: 14)。此外，将在NCBI注册的信息作为引物核苷酸序列的参照。但对于埃氏巨球形菌， 参照W002/4M18中描述的序列。在以下条件下从相关的基因组中扩增每种基因PCR(酶KOD plus) (94°C 1分钟)X 1，(940C 0. 5分钟，50°C 0. 5分钟，72°C 2分钟)X 30，(94°C 2分钟)。将所扩增的片段分别引入TOPO BlimtII载体，随后测序。结果发现源自丙酸梭菌的pet和源自金黄色葡萄球菌的pet分别与AJ276553和MW0211(其为NCBI数据库中注册的序列)完全相同。源
8自埃氏巨球形菌的pet的核苷酸序列与以前报道的序列具有97. 8%的同源性。然而，在其氨基酸序列中发现了单位点差异。通过PCR获得的来自丙酸梭菌、埃氏巨球形菌和金黄色葡萄球菌的上述pet基因被分别插入 PTV118N 载体(Takara Bio Inc.)的 NcoI-BamHI、EcoRl-PstI 和 NcoI-EcoRI 位点。从而产生表达质粒(pTV118N-C. P PCT、pTV118N-M. E PCT 和 pTV118N_S. A PCT)。随后，将这些表达质粒分别弓I入大肠埃希氏菌W3110。预培养所获得的已转化大肠埃希氏菌，随后以2%接种于200_mlLB/2L烧瓶中，并在37°C和180rpm下培养3小时。在大约OD6tltl = 0. 5时，使用IOmM IPTG进行表达诱导，随后在30°C和80rpm下培养6小时。随后，通过离心收集细菌细胞，并在37°C下用M9 (+1. 5% 葡萄糖，IOmM MgSO4, IOmM泛酸钙)(0D = 20,3ml)培养。以适当的方式进行取样。测定所合成的乳酸CoA的量，用于比较源自丙酸梭菌、埃氏巨球形菌和金黄色葡萄球菌的pet基因将乳酸转化为乳酸CoA的活性。首先，收集细菌细胞(IX IO5细胞)用于制备样品(η = 3)。将样品应用于吸滤器系统(suction filter system)，并用Milli Q 水清洗两次。将滤器(颠倒)置于含有MeOH溶液Qml)的培养皿中，并使其在室温下静置10分钟。将一部分MeOH溶液(1. 6ml)转移进离心管，并与氯仿(1. 6ml)和MilliQ水 (640ul)混合，随后混悬。以4600g和4°C离心5分钟以后，将水+MeOH层(1. 5ml)用5k超滤膜(Millopore)离心过滤大约2小时。收集滤液并冷冻干燥。将产物浓缩200倍并用含有二级内标物质(a secondary internal standard substance)的 Milli Q 7jC溶角军，随后用 CE-MS 分析。CE-MS 分析条件参照〃 Pressure-Assisted Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry for Analysis of Multivalent Anions“ (Anal. Chem 2002，74，6224-6229)。结果见图1。如图1所示，其揭示源自埃氏巨球形菌的pet基因和源自金黄色葡萄球菌的Pct基因具有将乳酸转化为乳酸CoA的活性，其活性水平显著高于源自丙酸梭菌的 pet基因。该结果揭示，使用源自埃氏巨球形菌的pet基因和/或源自金黄色葡萄球菌的 pet基因，可充足地供应用于合成具有基本骨架的脂肪族聚酯的反应的底物，所述骨架部分地包含乳酸或由其构成。(实施例2)评价多种PHA合酶基因在本实施例中，评价了多种PHA合酶基因的聚乳酸酯生产力，这在允许与源自埃氏巨球形菌的pet基因一起表达所述基因的情况下进行，所述源自埃氏巨球形菌的pet基因已在实施例1中被评价为具有显著高的将乳酸转化为乳酸CoA的活性。表1列出了在本实施例中检测的PHA合酶基因。在表1中，对于类球红细菌(Iihodobacter sphaeroides) (No. 1)和深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum) (No. 4)，由于已经发现了以不同登录号注册的多个基因，因此检测了这些多个基因。[表 1]
权利要求
1.一种重组微生物，其是通过将如下所示选自基因(a)至(c)的基因和选自基因(d) 至(f)的基因引入宿主微生物中而获得的(a)编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有SEQID NO :2或4所示氨基酸序列；(b)编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过替换、缺失或添加1或更多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO :2或4所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有将乳酸转化为乳酸CoA的活性；(c)在严格条件下与如下多核苷酸杂交的基因，所述多核苷酸具有与SEQIDNO :1或3 所示核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述基因编码具有将乳酸转化为乳酸CoA之活性的蛋白质；(d)编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有SEQID NO :6或8所示氨基酸序列；(e)编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有通过替换、缺失或添加1或更多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO :6或8所示氨基酸序列的氨基酸序列并具有用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯的活性；和(f)在严格条件下与如下多核苷酸杂交的基因，所述多核苷酸具有与SEQIDN0:5或7 所示核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且所述基因编码具有用乳酸CoA为底物合成聚乳酸酯之活性的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中所述宿主微生物为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)0
3.一种用于生产脂肪族聚酯的方法，其包括在培养基中培养根据权利要求1或2的重组微生物，和收集脂肪族聚酯。
4.根据权利要求3所述的用于生产脂肪族聚酯的方法，其中要收集的所述脂肪族聚酯是具有乳酸骨架的脂肪族聚酯。
5.根据权利要求3所述的用于生产脂肪族聚酯的方法，其中要收集的所述脂肪族聚酯是聚乳酸酯。
6.根据权利要求3所述的用于生产脂肪族聚酯的方法，其中在培养所述重组微生物时不向培养基中添加乳酸。
全文摘要
本发明提供表现出优秀脂肪族聚酯生产力的重组微生物和利用所述重组微生物生产脂肪族聚酯的方法。在本发明中，源自埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)的pct基因(和/或源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的pct基因)和源自假单胞菌属(Pseudomonas sp.)61-3菌株的PHA合酶基因(phaC2基因)(和/或源自泊库岛食烷菌(Alcanivorax borkumensis)SK2菌株的PHA合酶基因)被引入宿主微生物。
文档编号C12P7/62GK102482651SQ201080040029
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月27日 优先权日2009年7月27日
发明者伊藤正和, 小畑充生, 嶋村隆, 幸田胜典, 村松正善, 神户浩美 申请人:丰田自动车株式会社