条件培养基和来自低氧含量条件下培养的细胞的胞外基质组合物的制作方法

专利名称：条件培养基和来自低氧含量条件下培养的细胞的胞外基质组合物的制作方法
条件培养基和来自低氧含量条件下培养的细胞的胞外基质
组合物发明背景发明领域本发明一般涉及胞外基质组合物或条件培养基的生产和应用，更具体而言，涉及通过在低氧含量条件下在合适的生长培养基中培养细胞而获得的组合物和/或蛋白质。背景信息胞外基质(ECM)是在体内发现的哺乳动物组织中围绕并支持细胞的复杂结构实体。ECM常常被称为结缔组织。ECM主要由三大类生物分子组成，包括结构蛋白，如胶原蛋白和弹性蛋白；特化蛋白(specialized proteins)，如肌原纤蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白； 以及蛋白聚糖。本领域中已经描述了 ECM组合物在体外的生长及其在各种治疗和医疗应用中的用途。这样的ECM组合物的一个治疗应用包括治疗和修复软组织和皮肤缺陷，如皱纹和伤疤。由缺陷，如痤疮、手术疤痕或老化引起的软组织缺陷的修复或增强已经被证明非常困难。一些材料已被用于矫正软组织缺陷，取得了不同程度的成功，然而，没有一种材料是十分安全和有效的。例如，硅引起各种生理学和临床问题——包括长期的副作用，如小瘤、复发性蜂窝组织炎和皮肤溃疡。胶原蛋白组合物也被用作用于软组织增强的可注射材料。胶原蛋白是结缔组织的主要蛋白质，也是哺乳动物中最丰富的蛋白质，占总蛋白质含量的约25%。目前文献中描述了观种胶原蛋白(详细列举参见，例如以下表1和2)。然而，身体中90%以上的胶原蛋白是胶原蛋白I、II、III和IV。不同的胶原蛋白材料已被用于治疗软组织缺陷，如重构的可注射牛胶原蛋白、交联胶原蛋白或其它异源胶原蛋白。然而，这样的胶原蛋白存在若干问题。常见问题包括生产植入材料以去除可能的免疫源性物质，避免对象中的过敏反应的复杂性和高成本。另外， 利用这样的胶原蛋白治疗未被证明是持久的。也描述了可用于软组织修复或增强的其它材料，如含水凝胶中的生物相容性陶瓷颗粒(美国专利号5，204，382)、热塑性和/或热固性材料(美国专利号5，278，202)和乳酸基聚合掺合物(美国专利号4，235，312)。另外，还描述了天然分泌的ECM组合物的应用 (美国专利号6，284, 284)。然而，这样的材料均被证明具有局限性。因此，软组织修复和增强需要克服现有材料缺陷的新材料。对提供安全的、可注射的、持久的、生物可吸收的软组织修复和增强材料存在需求。在体外培养的ECM组合物可另外被用于治疗损伤组织，如损伤的心肌及相关组织。组合物作为可植入装置，如支架；促进器官，如心组织和相关组织中血管形成的人工血管；以及在疝修复、骨盆底修复、伤口修复和回旋套修复中有用的装置，如补片等等上的植入物或生物涂层是有用的。冠心病(CHD)，也称为冠状动脉疾病(CAD)、缺血性心脏病和动脉粥样硬化性心脏病，其特征是向心脏供应血液和氧的小血管变窄。冠心病通常由被称为动脉粥样硬化的病症引起，所述动脉粥样硬化在脂肪物质和斑点在动脉壁上沉积时发生，致使动脉变窄。因为冠状动脉狭窄，到达心脏的血流会减缓或中止，引起胸部疼痛(稳定型心绞痛)、气促、心脏病发作和其它症状。在美国，冠心病(CHD)是引起男性和女性死亡的主要原因。根据美国心脏学会， 1500万以上的人患有某种形式的该病症。虽然冠心病的症状和征兆在该疾病的晚期状态是明显的，但由于该疾病在突然发生心脏病发作之前发展，患有冠心病的大部分个体数十年都不显示疾病征兆。该疾病是突然死亡的最常见的原因，也是20岁以上的男人和女人死亡的最常见原因。根据美国现在的趋势，一半的40岁的健康男性以及三分之一的40岁的健康女人将会患CHD。改善患病或以其它方式受损的心脏中血流的当前方法涉及侵入性外科技术，如冠状动脉架桥外科、血管成形术和动脉内膜切除术。这样的程序自然涉及外科手术中和外科手术后高程度的固有风险，并常常仅为心脏缺血提供暂时的补救。因此，需要新的治疗选择，以增加用于治疗CHD和相关症状的、当前可利用的技术的成功。体外培养的ECM组合物可另外被用于修复和/或使受损细胞或组织再生，如软骨或骨软骨细胞。骨软骨组织是涉及或含有骨或软骨的任何组织。本发明的组合物对于治疗由于外伤而患有软骨缺损的患者中的骨软骨缺损，如变性结缔组织疾病，如类风湿和/或骨性关节炎以及缺损是有用的。当前对修复骨软骨缺损的尝试包括将人软骨细胞植入生物相容性和生物可降解的水凝胶移植物中，以试图提高恢复关节软骨损伤的可能性。另外，已经描述了在藻酸盐微球或含多硫酸化藻酸盐的基质中培养软骨细胞的技术来产生透明素样的软骨组织。然而， 通过植入人自体软骨细胞来修复关节软骨的软骨内损伤的尝试成效有限。因此，需要新的治疗选择，以增加当前可利用的治疗骨软骨缺损的技术的成功。体外培养的ECM组合物在产生改造的组织植入物的组织培养体系中也是有用的。 组织工程领域涉及使用细胞培养技术产生新的生物组织或修复损伤组织。部分受干细胞革命的促进，组织工程技术提供组织再生并取代随后的外伤或治疗变性疾病的希望。它也可用于整容手术的背景中。组织工程技术可用于利用各种细胞类型和培养技术产生自体和异源组织或细胞。 在产生自体植入物期间，可以收获供体组织并将其解离成单个细胞，随后附着并在待被植入到功能性组织期望部位的底物上培养。可利用细胞培养技术使许多分离的细胞类型在体外增殖，然而，依赖贴壁细胞要求特定的环境，该环境常常包括三维支架的存在，以充当生长的模板。当前的组织工程技术通常提供人工植入物。成功的细胞移植治疗取决于同时用于体外和体内组织培养的合适底物的发展。因此，仅含天然物质并适于植入的ECM的发展会具有更多内源组织的特征。因此，天然ECM物质的产生是组织工程领域正面临的挑战
发明内容
本发明部分基于这样一个开创性发现即在刺激早期胚胎环境的条件(例如，低氧和减小的重力)下培养(例如，按照二维或三维)的细胞产生具有胎性质的ECM组合物。 通过在低氧含量条件下培养细胞而产生的含有一种或多种胚蛋白质的ECM组合物具有多种有益应用。在一个实施方式中，本发明提供制备含有一种或多种胚蛋白质的ECM组合物的方法。该方法包括在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞，产生可溶和不可溶部分。在各个方面，组合物包括独立的可溶和不可溶部分以及可溶和不可溶部分的组合。在各个方面，产生的组合物包括上调层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达和产生。在其它方面，产生的组合物包括下调层粘连蛋白、胶原蛋白和Wnt因子的基因表达。在其它方面，组合物是物种特异性的，并包括来自单个动物物种的细胞和/ 或生物学物质。虽然体外培养的ECM组合物在治疗人中是有用的，但这样的组合物也可应用于其它动物物种中。因此，这样的组合物非常适于兽医应用。在另一个实施方式中，本发明提供产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法。该方法包括在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞，从而产生Wnt蛋白质和VEGF。在各个方面，生长培养基不含血清，低氧含量条件为 1-5%的氧。在相关方面，与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质(media)相比，Wnt物质被上调。在一个示例性方面，Wnt物质为wnt 7a和wnt 11。在其它实施方式中，条件培养基作为含有本文所述的各种蛋白质的组合物被分离。在另一个实施方式中，本发明包括通过使待修复或再生的细胞与本文所述的ECM 组合物接触而修复和/或再生细胞的方法。在一个方面，细胞是骨软骨细胞。因此，该方法考虑骨软骨缺损的修复。在另一个实施方式中，ECM组合物作为可植入装置上的植入物或生物涂层是有用的。在各个方面，本发明的组合物包含在植入物中或被用作可植入装置，如支架和人工血管上的生物涂层，以促进器官，如心和相关组织中的血管形成。在相关方面，组合物包含在组织再生补片(patch)或植入物中，在疝修复、骨盆底修复、伤口修复、回旋套(rotator cuff)修复等等中是有用的。在再一个实施方式中，本发明包括改善对象中皮肤表面的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物或条件培养基。在再一个实施方式中，本发明包括在对象中软组织修复或增强的方法，包括在皱纹部位给对象施用本文所述的ECM组合物。在另一个实施方式中，本发明包括组织培养体系。在各个方面，该培养体系由本文所述的ECM组合物或培养基，如包含在二维或三维支撑物材料中的那些组成。在另一个方面，本文所述的ECM组合物充当各种细胞类型生长的支撑物或二维或三维支撑物。例如，培养体系可用于支撑干细胞的生长。在一个方面，干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于提供联合在对象中植入装置应用的表面涂层，以促进内皮化和血管形成。在另一个实施方式中，本发明包括通过培养细胞(例如，成纤维细胞，在低氧含量条件下)而产生干细胞，从而产生以比在含氧量正常的条件下生长时高至少3倍的水平表达干细胞基因特征的细胞。这样的基因可以包括，例如0ct4、Sox2、KLF4、NAN0G和cMyc。
通过本发明方法产生的干细胞优选为多能细胞。任何基质干细胞或非干细胞均可被用作起始细胞类型。在另一个实施方式中，本发明的组合物可用于提供治疗损伤组织的方法。该方法包括在允许治疗损伤组织的条件下使损伤组织与组合物接触，所述组合物通过在含有一种或多种胚蛋白质的二维或三维支撑物上在低氧含量条件下培养细胞而产生。在另一个实施方式中，本发明包括生物学载体，用于细胞递送或维持在递送部位， 所述生物学载体包括本文所述的ECM组合物。该载体可用于这样的应用，如将细胞，如干细胞注射到受损的心肌，或者用于腱和韧带修复。在另一个实施方式中，本发明提供刺激或促进毛发生长的方法。该方法包括使细胞与本文所述的ECM组合物或条件培养基接触。在一个示例性方面，细胞是毛囊细胞。在各个方面，细胞可以在体内或体外被接触。附图简述

图1显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网后2周FBGC形成的图示。图IA显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后2周每条纤维的FBGC 数目。图IB显示在植入未涂覆的纤维(柱1-3)和ECM涂覆的纤维(柱4-6)之后2周每条纤维的FBGC数目。*表示ρ < 0. 05。图2显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周FBGC形成的图示。图2A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后5周每条纤维的FBGC 数目。图2B显示在植入未涂覆的纤维(柱1和幻和hECM涂覆的纤维(柱2和4)之后5 周每条纤维的FBGC数目。图3显示人毛囊细胞的图示。图3A是在hECM存在的情况下细胞培养四周并随后移植到小鼠中再生长4周之后人毛囊细胞的图，而图;3B是对照滤泡细胞的图。图4显示如MTT分析所示的成纤维细胞对胞外基质组合物(小鼠ECM和人ECM) 的代谢反应的图示。图5是如Pico Green分析所测量的响应人成纤维细胞暴露于hECM的细胞数目的图示。图6是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的红斑评估的图示。以 0(无)到4(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0. IXhECM、IXhECM、10XhECM 和对照，从左到右)的每一组表示在第3 (左)、7 (中)和14 (右)天的评估。图7是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的水肿评估的图示。以 0(无)到2. 5(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0. IXhECMU XhECMUO X hECM 和对照，从左到右)的每一组表示在第3 (左)、7 (中)和14 (右)天的评估。图8是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的结痂(crusting)评估的图示。以0(无)到3.5(严重)的范围评估红斑的严重性。4个数据组(0. lXhECM、 IXhECM、10XhECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3 (左)、7 (中)和14(右)天的评估。图9是在激光治疗后第3、7和14天获取的41个人对象的经表皮失水(TTOL)值的图示。以0(无)到4(严重)的范围评估TWEL的严重性。4个数据组(0.1 XhECMU XhECM、 10 X hECM和对照，从左到右)的每一组表示在第3(左)、7(中)和14(右)天的评估。
图10是来自眼周区域的硅复制物的三维轮廓(profilometry)图像分析的图示。 在激光治疗之前，治疗后4周和治疗后10周采取22个对象的数据点。数据系列A表示hECM 施用的值；数据系列B表示对照。图11是激光手术后矿脂应用的分析的图示。图12是用在激光手术后第0、3、5、7、10和14天获取的数据点分析皮肤红斑的图示。
图13是用在激光手术后第0、3、5、7、10和14天获取的数据点的黑色素和血红素测量仪(mexameter)分析的图示。图14显示植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周FBGC形成的图示。图14A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后2周每条纤维的 FBGC数目。图14B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后2周每条纤维的FBGC数目。图15显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后5周FBGC形成的图示。图15A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后5周每条纤维的 FBGC数目。图15B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后5周每条纤维的FBGC数目。图16显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后2周测定的平均纤维囊厚度的图示。图16A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后 2周平均纤维囊厚度。图16B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后2周平均纤
维囊厚度。图17显示在植入涂有hECM的聚丙烯筛网之后5周测定的平均纤维囊厚度的图示。图17A显示在植入未涂覆的纤维(第一个柱)和hECM涂覆的纤维(第二个柱)之后 5周平均纤维囊厚度。图17B显示在植入未涂覆的纤维和ECM涂覆的纤维之后5周平均纤
维囊厚度。图18显示表现在施用包含wnt 7a的hECM之后毛发生长特性的柱状图的图示。图19显示表现在开始测试包含wnt 7a的hECM的施用功效的研究之后12周2个测试对象的毛发生长特性的表格表示。图20显示表现在开始测试包含wnt 7a的hECM的施用功效的研究之后22周2个测试对象的毛发生长特性的表格表示。图21显示与处理对象相比对照对象的综合结果(aggregate result)的图示，两者均不包括微扰。图21A显示3月时的结果。图21B显示5月时的结果。图22显示与hECM处理对象相比对照对象的综合结果的图示，两者均不包括微扰。 图22A显示3月时的结果。图22B显示显示5月时的结果。图23显示如通过终毛密度所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。
图M显示如通过毫毛密度所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。
图25显示如通过毛发厚度密度(thickness hair density)所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。
图沈显示如通过平均毛发厚度(thickness hair mean)所测量的对象在3月时对hECM治疗的响应的分布图示。图27显示毛发生长测量结果的图示。图28显示傅里叶变换红外(FTIR)光谱学的图示。发明祥述本发明涉及制备包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物或条件培养基的方法。尤其地，该组合物通过在合适的生长培养基中在低氧含量条件(例如，二维或三维生长)下培养细胞而产生。培养方法同时产生可溶和不可溶部分，可被单独或组合使用，以获得具有多种应用的生理学上可接受的组合物。干细胞和多能祖细胞的分裂、分化和功能受微环境——包括氧利用率——中的复杂信号影响。严重缺氧(低氧)区域出现在肿瘤中，例如由于快速细胞分裂和异常血管形成。低氧诱导因子(HIF)介导对正常组织和癌中的局部化低氧的转录反应，并可通过改变细胞代谢和刺激血管生成(angiogenesis)来促进肿瘤发展。最近，已经显示HIF激活特异性信号传导途径，如Notch和控制干细胞自我更新和多潜能的转录因子，如0ct4的表达。因为许多癌症被认为由少量被转化的、自我更新的和多能“癌干细胞”所发展，这些结果表明 HIF在肿瘤发展中的新角色。本实施例中显示的数据表明，在低氧含量条件下培养的细胞表达通常与多能细胞有关的基因，例如，如0ct4、NANOG, Sox2、KLF4和cMyc。本发明的组合物具有多种应用，包括但不限于促进修复和/或再生受损细胞或组织、应用于补片和植入物中以促进组织再生(例如，疝修复、骨盆底修复、回旋套修复和伤口修复)、应用于培养细胞，如干细胞的组织培养体系中、应用于联合可植入装置(例如， 起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口或导管、疝和骨盆底修复补片)使用的表面涂层中、促进软组织修复、增强和/或改善皮肤表面，如皱纹、创伤后皮肤应用(例如，激光后)、毛发生长、用作生物学抗粘连剂或用作生物学载体，用于细胞递送或维持在递送部位。本发明部分基于这样的发现即，在血管生成前在刺激早期胚胎环境(低氧和减小的重力)的条件下在微球(微载体)或三维支架上培养的细胞产生具有胎性质的ECM组合物，包括产生胚蛋白质。细胞在低氧含量条件下生长表明具有胎性质的独特ECM和条件培养基以及生长因子表达。不同于在传统培养条件下培养ECM，超过5000个基因在低氧含量条件下培养的ECM中被差异表达。这产生具有不同特性和不同生物学组成的培养的ECM。 例如，在低氧含量条件下产生的ECM与胎间充质组织相似，因为它相对富含胶原蛋白III 型、IV型和V型以及糖蛋白，如纤连蛋白、SPARC、血小板反应蛋白和透明质酸。低氧也增强调节伤口愈合和器官发生的因子的表达，所述因子如VEGF、FGF-7和 TGF-β以及多种Wnt因子——包括wnt 2b、4、7a、10a和11。如通过提高的酶活性所测量的，培养的人胚ECM也体外刺激人成纤维细胞代谢活性的增加。另外，细胞数目响应于培养的胚ECM而增加。在描述本发明组合物和方法之前，应该理解该发明并不限于所描述的具体组合物、方法和试验条件，因为这样的组合物、方法和条件可以变化。同样应该理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方式
的目的，而并不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
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如本说明书和权利要求书中所使用的，单数形式“一 (a,an)和“该(the) ”包括复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，“该方法”的指代包括一个或多个本文所述类型的方法和/或步骤，所述方法和/或步骤对于本领域技术人员来说在阅读本公开内容之后将变得显而易见，等等。在各个实施方式中，本发明涉及制备包含一种或多种胚蛋白质的ECM组合物的方法及其应用。尤其地，该组合物通过在低氧含量条件下在合适的生长培养基中培养细胞而产生。本发明考虑作为单细胞层或在微球/微载体上的生长。此外，可以通过使细胞在产生多层细胞培养体系的三维构架上生长而衍生该组合物。根据本发明，在三维构架支撑物上生长的细胞在多个层中生长，形成细胞基质。对比在ECM和条件培养基中的传统培养，在低氧含量条件下使培养的细胞生长由于缺氧培养条件而导致差别基因表达。ECM是蛋白质和生物聚合物的组合物，所述生物聚合物基本上包含通过培养细胞而产生的组织。基质细胞，如成纤维细胞是不依赖贴壁细胞类型，其需要生长同时附着于适于细胞培养的材料和表面。通过培养的细胞而产生的ECM材料沉积在为组织样结构的形成提供空间的三维装置(arrangement)中。提供三维构造的培养材料被称为支架。当期望时，沉积ECM的空间的形式为孔，例如织造(编制的)筛网中的孔或者在球形微球——被称为微载体——的紧密构型中产生的间隙空间。如本文所使用的，“胞外基质组合物”同时包括可溶和不可溶部分或其任何部分。 不可溶部分包括沉积在支撑物或支架上的那些分泌的ECM蛋白质和生物学成分。可溶部分指培养基或条件培养基，并包括没有沉积在支架上的那些蛋白质和生物学成分，在所述培养基或条件培养基中细胞已经被培养并且细胞已经向其中分泌活性剂(一种或多种)。两部分均可被收集，而且任选地，被进一步加工以及在本文所述的多种应用中单独或组合使用。用于培养基质细胞的三维支撑物或支架可以是的任何材料和/或形状，其允许细胞附着其上(或者可被修饰为允许细胞附着其上)；并允许细胞在一个以上的层中生长 (即，形成与体内组织生长相似的三维组织)。在其它实施方式中，基本上二维的片或膜可用于培养形式足够三维的细胞。使生物相容性材料形成三维结构或支架，其中该结构具有用于细胞附着并生长成三维组织的间隙空间。一些实施方式中的构架的孔和/或间隙空间具有适当的尺寸，以允许细胞跨过孔或空间伸展。维持跨过构架伸展的活跃生长的细胞似乎提高与本文所述活性有关的生长因子的所有组成成分的产量。如果孔太小，则细胞可以迅速实现汇合但不能容易地从筛网出来。这些捕获的细胞可显示接触抑制并中断支持增殖和维持长期培养所必需的适当因子的产生。如果孔太大，则细胞可能不能伸展跨过孔，这会导致支持增殖并维持长期培养所必需的适当因子的基质细胞产量降低。通常，间隙空间为至少约lOOum、至少140um、至少约150um、至少约180um、至少约200um或至少约220um。当使用筛网型的基质时，如本文所示例的，我们发现约IOOym到约220μπι范围的孔将令人满意地起作用。然而，根据三维结构和构架的复杂性，其它尺寸是允许的。根据本文的方法，允许细胞伸展和继续复制并生长长的时间段的任何形状或结构均可用以精制细胞因子。在一些方面，三维构架由聚合物或线，所述聚合物或线是编织的(braided)、织造的、编结的(knitted)或以其它方式排列以形成构架，如筛网或织物(fabric)。材料也可以通过将材料或构造(fabrication)铸塑成泡沫、基质或海绵状支架而形成。在其它方面，三维构架的形式为并结纤维，其通过将聚合物或其它纤维挤压在一起而形成，以产生具有间隙空间的材料。三维构架可以采用任何形式或几何形状，用于培养中细胞的生长。因此，如以下进一步描述地，其它形式的构架可足以产生适当的条件培养基。许多不同的材料可用于形成支架或构架。这些材料包括非聚合物和聚合物材料。 在使用时，聚合物可以是任何类型的聚合物，如均聚物、无规聚合物、共聚物、嵌段聚合物、 共嵌段聚合物(例如，二、三等)、线性或支化聚合物和交联或非交联聚合物。用作支架或构架的材料的非限制性实例包括玻璃纤维、聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺(例如，尼龙)、聚酯(例如，涤纶)、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(例如，聚氯乙烯；PVC)、聚碳酸酯、聚四氟乙烯(PTFE ；TEFLON)、thermanox(TPX)、硝基纤维素、多糖(例如，纤维素、脱乙酰壳多糖、琼脂糖)、多肽(例如，丝、明胶、胶原蛋白)、聚乙醇酸(PGA)和葡聚糖等等。在一些方面，构架或微载体/微球可以由在使用条件下随着时间降解的材料制成。生物可降解也指在体内或在体外条件下施用时化合物或组合物的可吸收性或降解。生物降解可通过生物剂直接或间接的作用而发生。生物可降解材料的非限制性实例包括聚交酯、聚乙醇酸交酯、聚(碳酸亚丙基酯)、聚交酯-乙交酯共聚物(即，PLGA)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)、聚己酸内酯、肠线结构材料、胶原蛋白(例如，马胶原蛋白泡沫)、聚乳酸或透明质酸等等。例如，这些材料可被织造成三维构架，如胶原蛋白海绵或胶原蛋白凝胶。在其它方面，在培养物将被长期维持、低温保藏的情况下和/或在期望额外的结构完整性的情况下，三维构架可由非生物可降解材料组成。如本文所使用的，非生物可降解材料指在培养基中的条件下并不明显降解或分解的材料。示例性的不可降解的材料包括——作为非限制性实例——尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯 (PTFE)、膨胀型PTFE(ePTFE)和纤维素。示例性的不可降解三维构架包括尼龙筛网，可以商品名Nitex 获得，其是一种尼龙过滤筛网，平均孔径为140 μ m和平均尼龙纤维直径为 90 μ m(#3-210/36，Tetko, Inc.，N. Y.)。在其它方面，微球、支架或构架是生物可降解和非生物可降解材料的组合。非生物可降解材料在培养期间为三维支架提供稳定性，而生物可降解材料允许形成足以产生细胞网络的间隙空间，所述细胞网络产生足以用于治疗应用的细胞因子。生物可降解材料可涂覆于非生物可降解材料上或被织造成、编织成或形成筛网。可以使用生物可降解和非生物可降解材料的各种组合。示例性的组合是涂覆有生物可降解聚合物薄膜——聚D-L-乳酸-乙醇酸共聚物——的聚对苯二甲酸乙二酯(PET)织物，以获得极性结构。在各个方面，支架或构架材料可以在用细胞接种之前被预处理，以增强细胞附着。 例如，在用细胞接种之前，用0. IM乙酸处理一些实施方式中的尼龙筛子(screen)，并在聚赖氨酸、胎牛血清和/或胶原蛋白中温育，以涂覆尼龙。可以利用硫酸同样地处理聚苯乙烯。在其它实施方式中，在三维支撑物构架存在的情况下细胞的生长可通过以下被进一步增强向构架加入蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性蛋白纤维、网状纤维)、糖蛋白、糖胺聚糖(例如，硫酸乙酰肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等)、纤连蛋白和/或糖聚物(聚[N-对-乙烯基苄基-D-乳酰胺(lactoamide)]，PVLA)或用其涂覆，以改善细胞附着。支架或构架处理在材料为不易于细胞附着的底物的情况下是有用的。在一个方面，筛网被用于产生ECM。筛网为平织纹形式的织造尼龙6材料，具有约 IOOym的孔和约125ym的厚度。在培养中，成纤维细胞通过带电荷的蛋白质相互作用附着到尼龙，并发展成筛网空隙，同时产生并沉积ECM蛋白质。过大或过小的筛网孔可能没有效，但可以不同于以上那些而基本上不改变产生或沉积ECM的能力。在另一个方面，织纹构型的其它织造材料，如聚烯烃的织造材料被用于ECM产生，产生适当的几何形状，用于细胞生长和ECM沉积。例如，通过切割成期望的尺寸，用0. 1-0. 5Μ乙酸洗涤，接下来用高纯水漂洗，然后蒸汽清洁消毒，用本发明的任何步骤制备尼龙筛网，用于培养。为了用作ECM生产的三维支架，将筛网尺寸制作为约IOcmX IOcm的正方形。然而，筛网可以是适于预定应用的任意尺寸，并且可用于本发明的任意方法，包括用于接种的培养方法、细胞生长和ECM生产以及最终形式的制备。在其它方面，用于产生培养的组织的支架由微载体组成，所述微载体是微球或颗粒。微球可以是微观的或肉眼可见的，并可进一步被按尺寸切割，以允许穿透到组织中，或被压紧，以形成特定的几何形状。颗粒和细胞的复合体的尺寸足以被施用到组织或器官中， 如通过注射或导管。微球或微载体通常被认为是二维体系或支架，而且通常允许二维(例如，单细胞层)生长。如本文所使用的，“微载体”指具有纳米到微米大小的颗粒，其中，该颗粒可以是任何形状或几何形状，不规则的、非球形的、球形的或椭圆形。适于本文目的的微载体的尺寸可以是适于具体应用的任意尺寸。在一些实施方式中，适于本发明的微载体的尺寸可以是通过注射施用的那些尺寸。在一些实施方式中， 微载体的具体尺寸范围为至少约Ιμπκ至少约10 μ m、至少约25 μ m、至少约50 μ m、至少约 100 μ m、至少约200 μ m、至少约300 μ m、至少约400 μ m、至少约500 μ m、至少约600 μ m、至少约700 μ m、至少约800 μ m、至少约900 μ m、至少约1000 μ m。在一些方面，其中，微载体由生物可降解材料制成。在一些方面，可以使用包含一个或多个不同生物可降解聚合物层的微载体。在一些实施方式中，至少外部第一层具有形成培养中的组织的生物可降解特性，而具有不同于第一层特性的至少生物可降解的内第二层被制备，以在施用到组织或器官中时腐蚀。在一些方面，微载体为多孔微载体。多孔微载体指这样的微载体其具有空隙，通过该空隙分子可以扩散进入或者从微粒中出来。在其它实施方式中，微载体为非多孔微载体。非多孔微粒指其中具有选定尺寸的分子并不在该微粒中扩散或从该微粒中出来的微粒。用于组合物的微载体是生物相容性的并对细胞具有低毒性或没有毒性。合适的微载体可以根据以下被选择待治疗的组织、待治疗的损伤类型、期望的治疗长度、细胞培养物在体内的寿命和形成三维组织所需的时间。微载体可以包含各种聚合物，这些聚合物是天然的或合成的、带电的(即，阴离子的或阳离子的)或不带电的、生物可降解的或非生物可降解的。聚合物可以是均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、枝接物共聚物和支化聚合物。在一些方面，微载体包含非生物可降解微载体。非生物可降解微囊和微载体包括但不限于由聚砜、聚丙烯腈-氯乙烯共聚物、乙烯-乙烯基乙酸酯、羟乙基甲基丙烯酸酯-甲基-甲基丙烯酸酯共聚物制成的那些。这些对于提供组织膨胀特性或在微载体被身体消除的实施方式中是有用的。在一些方面，微载体包含可降解支架。这些包括由天然产生的聚合物制成的微载体，所述天然产生的聚合物的非限制性实例包括血纤蛋白、酪蛋白、血清白蛋白、胶原蛋白、 明胶、卵磷脂、脱乙酰壳多糖、藻酸盐或聚氨基酸，如聚赖氨酸等等。在其它方面，可降解微载体由合成的聚合物制成，所述合成的聚合物的非限制性实例包括聚交酯(PLA)、聚乙醇酸交酯(PGA)、聚交酯-乙交酯共聚物(PLGA)、聚(己酸内酯)、聚二氧六环酮碳酸亚丙基酯、 聚羟链烷基酯(polyhybroxyalkonates)(例如，聚(羟丁酸)、聚(乙基谷氨酸盐)、聚(DTH 亚氨基羰基(iminocarbony)(双酚A亚氨基碳酸酯)、聚(原酸酯)和聚氰基丙烯酸酯等寸。在一些方面，微载体包含水凝胶，其通常是填充水的亲水聚合物网络。水凝胶具有聚合物溶胀选择性引发的优势。根据聚合物网络的组合物，可以通过多种刺激——包括PH、 离子强度、热、电、超声和酶活性——引发微粒溶胀。在水凝胶组合物中有用的聚合物的非限制性实例包括那些由以下形成的聚合物聚交酯-乙交酯共聚物；聚(N-异丙基丙烯酰胺)；聚(甲基丙烯酸-g_聚乙烯乙二醇)；聚丙烯酸和聚(氧丙烯-氧乙烯共聚物)乙二醇；和天然化合物，如硫酸软骨素(chrondroitan sulfate)、脱乙酰壳多糖、明胶、凝血因子 I、或者合成聚合物和天然聚合物的混合物，例如脱乙酰壳多糖-聚(环氧乙烷)。聚合物可以可逆地或不可逆地交联，形成适于形成三维组织的凝胶。在示例性的方面，用于本发明的微载体或微球全部或部分由葡聚糖组成。根据本发明，培养方法可应用于不同类型细胞——包括基质细胞，如成纤维细胞， 尤其是初级人新生儿包皮成纤维细胞的增殖。在各个方面，如以下进一步描述地，在其它细胞存在或不存在的情况下，被接种到支架或构架上的细胞可以是基质细胞——包括成纤维细胞。在一些实施方式中，细胞为通常源自结缔组织的基质细胞，所述结缔组织包括但不限于(1)骨；(2)疏松结缔组织，包括胶原蛋白和弹性蛋白；(3)形成韧带和腱的纤维结缔组织；(4)软骨；(5)血液的ECM ； (6)脂肪组织，包括脂肪细胞；和(7)成纤维细胞。基质细胞可以源自各种组织和器官，如皮肤、心、血管、骨髓、骨骼肌、肝、胰腺、脑、 包皮，其可以通过活体解剖(在合适的情况下)或尸体解剖获得。在一个方面，胎儿成纤维细胞可以大量地从包皮，如新生儿包皮获得。在一些方面，细胞包括成纤维细胞，其可来自胎儿、新生儿、成体来源或其组合。在一些方面，基质细胞包括胎儿成纤维细胞，其可支持多种不同细胞和/或组织的生长。如本文所使用的，胎儿成纤维细胞指源自胎儿来源的成纤维细胞。如本文所使用的，新生儿成纤维细胞指源自新生儿来源(newborn source)的成纤维细胞。在适当的条件下，成纤维细胞可产生其它细胞，如骨细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞以及中胚层来源的其它细胞。在一些实施方式中，成纤维细胞包括真皮成纤维细胞，其是源自皮肤的成纤维细胞。正常的人真皮成纤维细胞可以从新生儿包皮中分离。这些细胞通常在原代培养结束时被深低温保藏。在其它方面，可以利用干细胞或祖细胞——单独地或与本文所述的任何细胞类型组合地——制备三维组织。干细胞和祖细胞包括——举例来说而不限于——胚胎干细胞、 造血干细胞、神经元干细胞、表皮干细胞和间充质干细胞。在一些实施方式中，“特异的”三维组织可以通过用细胞接种三维支架而制备，所述细胞源自特定器官即，皮肤、心和/或来自稍后即将根据本文所描述的方法接收培养基中生长的细胞和/或组织的特定个体。对于某些体内的应用，优选获得来自患者自身组织的基质细胞。在三维基质支撑构架存在的情况下，细胞的生长可通过将蛋白质，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、弹性纤维、网状纤维、糖蛋白；糖胺聚糖，例如，硫酸肝素、软骨素-4-硫酸盐、软骨素-6-硫酸盐、硫酸皮肤素、硫酸角质素等；细胞基质和/或其它材料加入到构架或用其涂覆构架支撑物而进一步增强。因此，由于本文所述的二维或三维培养体系适于不同细胞类型和组织的生长，并且，根据待培养的组织和所述胶原蛋白类型，可以选择合适的基质细胞来接种构架。尽管本发明的方法和应用适合与不同的细胞类型，如组织特异性细胞或本文所述的不同类型的基质细胞一起使用，但本发明使用的细胞衍生化也可以是物种特异的。因此， 也可以产生物种特异的ECM组合物。例如，用于本发明的细胞可以包括人细胞。例如，细胞可以是人成纤维细胞。同样地，细胞也来自其它动物种类，如马(马)、犬(狗)或猫(猫) 的细胞。另外，来自一个物种或物种菌株的细胞可用于产生ECM组合物，用于其它物种或相关菌株(例如，同种异型的、同源的和异源的)。也应该理解，源自多个物种的细胞可以被组合，以产生多物种ECM组合物。因此，本发明的方法和组合物适于涉及非人动物的应用。如本文所使用的，“兽医的”指关于医疗或外科手术治疗动物，尤其是家养动物或与其有关的医学科学。普通的兽医动物可以包括哺乳动物、两栖动物、禽类、爬行类和鱼。例如，典型的哺乳动物可以包括狗、 猫、马、兔、灵长类、啮齿动物和农场动物，如母牛、马、山羊、绵羊和猪。当如上所述时，另外的细胞可以与基质细胞一起存在于培养基中。这些另外的细胞可以具有许多有益效果，包括支持在培养基中长期生长、增强生长因子的合成以及促进细胞附着到支架等等。另外的细胞类型包括——作为非限制性实例——平滑肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、周细胞、巨噬细胞、单核细胞和脂肪细胞。这样的细胞可以与成纤维细胞一起被接种到构架，或者在一些方面，在成纤维细胞不存在的情况下被接种到构架。这些基质细胞可以源自合适的组织或器官，包括——举例来说而不限于——皮肤、心、血管、骨髓、骨骼肌、肝、胰腺和脑。在其它方面，一种或多种其他细胞类型——除成纤维细胞以外——被接种到支架。在其它方面，仅用成纤维细胞接种支架。成纤维细胞可以通过解聚充当成纤维细胞源的合适的器官或组织而容易地分离。 例如，组织或器官可以被机械解聚和/或用消化酶和/或螯合剂处理，所述螯合剂削弱邻近细胞之间的连接，使得将组织分散到不含可观察到的细胞断裂的个体细胞的悬浮液成为可能。可以通过切碎组织和用任何数量的消化酶单独地或组合地处理被切碎的组织来完成酶分离。这些酶包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、链霉蛋白酶和/或分散酶等。机械分裂也可以通过一些方法完成，所述方法包括但不限于应用研磨机、搅拌器、滤网、均浆器、挤压细胞或insonator等等。在一个方面，利用消化酶，通常用胶原蛋白酶和/或胰蛋白酶处理切除的包皮组织，以使细胞从包封的结构中分离。成纤维细胞的分离，例如，可以通过如下完成彻底洗涤新鲜组织样品，并在 Hanks平衡盐溶液(HBSS)中切碎，以去除血清。在新制备的解离酶，如胰蛋白酶溶液中，使切碎的组织温育1-12小时。在这样的温育之后，使解离的细胞悬浮，通过离心沉淀，并铺设在培养皿上。所有成纤维细胞将在其它细胞之前附着，因此，合适的基质细胞可以被选择性地分离和生长。然后，分离的成纤维细胞可以生长至汇合，将其从汇合的培养中提起(lift) 并接种到三维构架上，参见Naughton等，1987，J.Med. 18 (3&4) :219_250。用高浓度基质细胞，例如，约IO6到5X IO7细胞/ml接种三维构架将导致较短时间内三维基质支撑物的建立。一旦组织被简化成单个细胞的悬浮液，可将该悬浮液分馏成亚群，从该亚群中可以获得成纤维细胞和/或其它基质细胞和/或元件。这也可以利用用于细胞分离的标准技术来完成，所述标准技术包括但不限于克隆和选择特定细胞类型、选择性破坏不需要的细胞(负选择)、基于混合群体中差别细胞凝集力、冻融程序、混合群体中细胞的差别粘附特性的分离、过滤、常规和区带离心、离心淘汰同步(逆流离心(counter-streaming centrifugation))、单位重力分离(unit gravity s印aration)、逆流分布、电泳和荧光激活细胞分选术。对于克隆选择和细胞分离技术的评论，参见Freshney，Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques,第二版，A. R. Liss, Inc. , New York, 1987,11 禾口 12 章，pp. 137-168。在一个方面，分离的成纤维细胞可以生长以产生细胞库。产生细胞库，以允许开始培养批次(cultivation batch)的各种定量和计时，以及允许先行测试细胞污染物和特定细胞特性。来自细胞库的成纤维细胞随后生长，以将细胞数目增加到适当的水平，用于接种支架。涉及细胞和细胞接触材料环境暴露的操作通过无菌实践来进行，以降低外源物质或不期望的微生物污染的可能。在本发明的另一个方面，分离后，通过几代，细胞生长的量可以适于构建主细胞库。然后，可以收获细胞库并装入合适的器皿中，在低温条件下保存。来自主细胞库的冰冻小瓶中的细胞可以融化，并通过另外的代次生长(通常为两代或更多代)。然后，可将细胞用于制备低温保存的工作细胞库。细胞增殖步骤利用处于工作细胞库阶段的成瓶细胞，以进一步增加细胞数目，用于接种支架或支撑物，如筛网或微载体。每一代是一系列的继代培养步骤，包括接种细胞生长支撑物、温育、供养细胞和收获。细胞库的培养和细胞增殖可以通过接种培养瓶，如培养烧瓶、滚瓶或微载体来进行。基质细胞，如成纤维细胞附着于预定的生长表面，并在培养基存在的情况下进行生长。 培养瓶，如培养烧瓶、滚瓶和微载体被特别配置，用于细胞培养，一般由准予用于预定应用的各种可塑性材料制成。微载体通常是微观的或宏观的微球，通常由各种塑性材料制成。然而，它们可以由其它材料制成，所述其它材料，如玻璃或固体/半固体生物基材料，如胶原蛋白或其它材料，如葡聚糖、改性的糖复合体一如上所述。在培养期间，在细胞生长过程中定期用新鲜培养基替换消耗的培养基，以保持营养供应充足，并去除抑制性培养产物(在条件培养基不是优选的情况下)。培养烧瓶和滚瓶为细胞在其上生长提供表面，并且，通常用于培养依赖贴壁细胞。在一个方面，在加热到37°C的室中进行温育。要求培养基与室环境交流的培养拓扑学(topology)使用5%C02V/V，同时空气在室气体空间中以助于调节pH。可选地，被装备来维持培养温度和PH的器皿可用于细胞增殖和ECM生产作业。温度低于35°C或高于38°C以及(X)2浓度低于3%或高于12%可能是不合适的。从附着表面收获细胞可以通过以下来进行去除生长培养基并用缓冲盐溶液漂洗细胞以减少酶竞争蛋白质，施用解离酶，然后在细胞脱离之后中和所述酶。收集收获的细胞悬浮液，并通过离心分离收获液体。从继代培养收获的细胞悬浮液可以被取样以评估回收的细胞量和其它细胞特性，并且，随后与新鲜培养基组合以及作为接种物被应用。用于制备细胞库和支架接种物的传代数目对于实现可接受的ECM特征是关键的。在制备合适的支架之后，通过用制备的基质细胞种植对其进行接种。可以以各种方式进行支架接种，如沉降。以与缺氧生长筛网相同的方式制备用于在厌氧条件下进行ECM 培养而制备的筛网，例外是厌氧培养室不被用于产生低氧含量条件。例如，对于用于在厌氧和低氧含量条件下进行ECM培养而制备的两种筛网，将被制备并消毒的筛网放置于无菌的150mm直径X 15mm深的培养皿中，并堆叠成约10片的厚度。然后，通过沉降接种筛网堆。将细胞加入到新鲜的培养基中，以获得适当浓度的接种物细胞。将接种物加入到筛网堆，在该筛网堆中，细胞固定在尼龙纤维上并在温育条件中附着。在充足的时间之后，可以将单独种植的筛网片无菌地与堆分离，并逐个放入到独立的 150mm X 15mm培养皿，该培养皿中约含50ml的生长培养基。在低氧含量条件下温育接种的培养物，发现与在正常培养条件下产生的ECM相比低氧含量条件下产生具有独特特性的ECM和周围介质。如本文所使用的，低氧含量条件特征在于与环境空气的氧浓度(约15% -25%的氧)相比较低的氧浓度。在一个方面，低氧含量条件特征在于氧浓度小于约10%。在另一个方面，低氧含量条件特征在于氧浓度约为 0. 到 10%、1%到 10%、1%到9%、1%到8%、1%到7%、1%到6%、1%到5%、1%到 4%、1(%到3(%或1(%到2(%。在某个方面，系统维持约1-3%的氧在培养瓶内。可以通过使用允许控制环境气体浓度的培养装置，例如厌氧培养室来产生和维持低氧含量条件。细胞培养物的温育通常在具有15-22%氧和5% CO2的正常大气压下进行，用于增殖和种植，在该点，低氧培养物分裂成充满95%氮/5% CO2的气密室，以便在培养基中产生缺氧环境。例如，具有筛网的培养皿被培养以在低氧含量条件下产生ECM，该培养皿最初在温育中在37°C和95%空气/5% CO2中生长2-3周。在近似大气培养(atmospheric cultivation)时期之后，使具有筛网的培养皿在被设计用于厌氧培养的室中温育，所述室用约95%氮和5% CO2的气体混合物净化。在培养期间，在大气氧水平用新鲜培养基替换消耗的生长培养基，并且，在交换培养基之后，将装满筛网的培养皿放入厌氧培养室中，该室用95%氮和5% CO2净化，然后在37°C温育。当它们达到期望的尺寸或含有期望的生物学成分时，收获培养的筛网。在温育期间期间，在开始发展成构架的孔之前，基质细胞将沿着并包围三维构架线性地生长。生长的细胞产生无数的生长因子、调节因子和蛋白质，它们中的一些分泌在周围介质中，而沉积在支撑物上以更充分地补充ECM的其它一些在以下论述。可将生长和调节因子加入到培养物中，但并不是必需地。基质细胞的培养同时产生不可溶部分和可溶部分。细胞生长到合适的程度，以允许ECM蛋白质的充分沉积。在三维组织培养期间，增殖的细胞可以从构架释放并粘贴到它们可以继续增殖并形成汇合的单层的培养瓶的壁上。为了最小化可能影响细胞生长的这种情况的发生，可以在送料期间或者通过将三维细胞培养物转移到新的培养瓶中来去除释放的细胞。去除汇合的单层或将培养的组织转移到新器皿中的新鲜培养基中维持或恢复三维培养物的增殖活性。在一些方面，除去或转移可以在培养瓶中进行，该培养瓶具有超过25%汇合的培养细胞的单层。可选地，在一些实施方式中，培养物被搅拌以防止释放的细胞粘住；在其它实施方式中，新鲜培养基通过系统被连续地注入。在一些方面，两种或更多种细胞类型可以同时地或者先后地在一起培养(例如，成纤维细胞和平滑肌细胞或内皮细胞)。在接种三维支架后，使细胞培养物在支持细胞生长成三维组织的合适营养培养基和温育条件下温育。许多商业可得的培养基，如达尔伯克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco' s Modified Eagles Medium) (DMEM)、RPMI 1640、Fisher 培养基、Iscove 培养基和McCoy培养基可适于支持细胞培养物的生长。培养基可以补充有另外的盐、碳源、 氨基酸、血清和血清成分、维生素、矿物质、还原剂、缓冲剂、脂质、核苷、抗生素、附着因子和生长因子。不同类型培养基的制剂在本领域技术人员可得的多种参考著作中有描述(例如，Methods for Preparation of Media,Supplement s and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York(1984) ；Tissue Culture !Laboratory Procedures, John Wiley&Sons, Chichester, England(1996) ；Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques，第四版，Wiley-Liss (2000))。本发明任何培养步骤中应用的生长培养基或培养基——无论是在厌氧条件下或是在低氧含量条件下——可以包括血清或不含血清。在一个方面，培养基是达尔伯克氏改良伊格尔培养基，具有4. 5g/L葡萄糖、丙氨酰-L-谷氨酰胺、Eq 2mM,并象征性地补充有 10%胎牛血清。在另一个方面，培养基是不含血清的培养基，并且是达尔伯克氏改良伊格尔培养基，具有含Glutamax 的4. 5g/L葡萄糖基培养基，补充有0. 5%血清白蛋白、2 μ g/ml肝素、1 μ g/ml重组碱性FGF、1 μ g/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、1 X ITS补充剂(胰岛素-运铁蛋白-硒，Sigma批号13146)、1 1000稀释的脂肪酸补充剂(Sigma批号7050)和1 1000 稀释的胆留醇。另外，相同的培养基可同时用于缺氧培养和厌氧培养。在一个方面，在种植和第一周生长之后，生长培养基由血清基培养基转变成不含血清的培养基。温育条件将在适当的pH、温度和气体(例如，O2^CO2等)条件下，以维持低氧含量的生长条件。在一些实施方式中，三维细胞培养物可以在温育期间悬浮在培养基中，以使增殖活性最大化并产生促进各部分期望生物学活性的因子。另外，可以定期给培养物“送料”， 以除去消耗的培养基、减少释放的细胞并增加新的营养源。在温育期间，在开始生长到支架的孔中之前，培养的细胞沿着并包围三维支架的丝体线性地生长。与在大约15-20 %的正常大气氧浓度下温育相比，在低氧含量条件下温育期间，数千细胞被差异表达。已经发现在这样的组合物中，最显著地，在某些层粘连蛋白物质、胶原蛋白物质和Wnt因子中若干基因被上调或下调。在各个方面，三维ECM可以通过与在正常条件下生长相比由于在低氧含量条件下生长而由细胞产生的特有指纹或一组细胞产物来限定。在本文特别示例的ECM组合物中，三维组织和周围介质的特征在于各种因子的表达和/或分泌。本文描述的三维组织和组合物具有存在于支架或构架上的ECM。在一些方面，由于在低氧含量条件下生长和选择在支撑物上生长的细胞，ECM包括多种层粘连蛋白和胶原蛋白类型。通过选择加工合适的胶原蛋白类型的成纤维细胞以及使细胞在上调或下调特定层粘连蛋白和胶原蛋白类型的表达的低氧含量条件下生长，可以操纵或提高沉积的ECM蛋白质的比例。在一些方面，可以利用限定特定胶原蛋白类型的合适的同种型或亚类的单克隆抗体来完成成纤维细胞的选择。在其它方面，固体底物，如磁珠可用于选择或消除已经结合到抗体的细胞。这些抗体的结合可用于选择(正向地或负向地)表达期望的胶原蛋白类型的成纤维细胞。可选地，用于接种构架的基质可以是合成期望的胶原蛋白类型的细胞混合物。 示例性的胶原蛋白类型的分布和来源显示在表I中。表1 各种类型胶原蛋白的分布和来源胶原蛋白类型主要组织分布细胞来源
疏松结缔组织和致密普通结成纤维细胞和网状细胞；平滑
权利要求
1.制备包含一种或多种胚蛋白质的组合物的方法，包括在低氧含量条件下在合适的生长培养基中在支撑物上培养细胞，从而产生包含一种或多种胚蛋白质的可溶和不可溶组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述生长培养基包含血清。
3.权利要求1的方法，其中所述生长培养基不含血清。
4.权利要求1的方法，其中所述低氧含量条件包括1-5%的氧。
5.权利要求1的方法，其中与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质相比，胶原蛋白物质被上调。
6.权利要求5的方法，其中所述胶原蛋白选自V型α1 ；IX型α 1 ；IX型α 2 ;VI型α 2 ； VIII 型 α 1 ;IV 型 α 5 ；VII 型 α 1 ；XVIII 型 α 1 ；或 XII 型 α 1。
7.权利要求1的方法，其中与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质相比，Wnt物质被上调。
8.权利要求7的方法，其中所述Wnt物质为wnt7a和wnt 11。
9.权利要求1的方法，其中与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质相比，层粘连蛋白物质被上调。
10.权利要求9的方法，其中所述层粘连蛋白物质为层粘连蛋白8。
11.权利要求1的方法，其中不含细胞的上清液在缓冲液中被透析、低压冻干和重构。
12.权利要求1的方法，其中不含细胞的上清液在缓冲液中被透析、干燥和重构。
13.权利要求1的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
14.权利要求13的方法，其中所述成纤维细胞是新生儿成纤维细胞。
15.权利要求1的方法，其中所述细胞是干细胞。
16.权利要求1的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。
17.权利要求1的方法，其中所述支撑物允许三维生长。
18.权利要求17的方法，其中所述支撑物包含筛网。
19.权利要求1的方法，其中所述支撑物允许二维生长。
20.权利要求19的方法，其中所述支撑物包含微球。
21.权利要求1的方法，其中所述细胞是种特异性的。
22.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述可溶部分。
23.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述不可溶部分。
24.通过权利要求1的方法制备的组合物，其中所述组合物是所述可溶和不可溶部分的组合。
25.修复和/或再生细胞的方法，包括使待修复或再生的细胞与由权利要求1所述的方法制备的组合物接触。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞是骨软骨细胞。
27.权利要求25的方法，其中所述细胞是干细胞。
28.组织再生补片，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。
29.组织培养体系，包括由权利要求1所述的方法制备的组合物。
30.权利要求四所述的组织培养体系，其中所述体系用于支持干细胞生长。
31.权利要求30所述的组织培养体系，其中所述干细胞是胚胎干细胞、间充质干细胞或神经元干细胞。
32.联合在对象中植入装置应用的表面涂层，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。
33.权利要求32的方法，其中所述装置是起搏器、支架、支架移植物、人工血管、心瓣膜、支路、药物递送端口、导管或补片。
34.权利要求32的方法，其中所述涂层可用于改良伤口愈合、改良炎症、改良纤维囊形成、改良生长中的组织或改良生长中的细胞。
35.治疗损伤组织的方法，包括使所述损伤组织与由权利要求1所述的方法制备的组合物在允许治疗所述损伤组织的条件下接触。
36.权利要求35的方法，其中所述组织是心组织。
37.权利要求35的方法，其中所述组织是梗塞的组织或缺血性组织。
38.权利要求35的方法，其中所述组织是肠组织。
39.改善对象中的皮肤表面的方法，包括在皱纹部位给所述对象施用由权利要求1的方法制备的组合物，从而提供改善的皮肤表面。
40.生物抗粘连剂，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。
41.用于细胞输送或维持在输送位点的生物学载体，包含由权利要求1所述的方法制备的组合物。
42.用于修复或增强对象中的软组织的方法，包括在皱纹部位给所述对象施用由权利要求1的方法制备的组合物，从而使软组织修复或增强。
43.促进毛发生长的方法，包括使细胞与由权利要求1的方法制备的组合物接触，从而促进毛发生长。
44.权利要求43的方法，其中所述细胞是毛囊细胞。
45.权利要求43的方法，其中所述细胞在体内被接触。
46.权利要求43的方法，其中所述细胞在体外被接触。
47.权利要求46的方法，其中所述细胞被移植到对象中。
48.产生Wnt蛋白质和血管内皮生长因子(VEGF)的方法，包括在低氧含量条件下在支撑物上在合适的生长培养基中培养细胞，从而产生所述Wnt蛋白质和所述VEGF。
49.权利要求48的方法，其中所述生长培养基不含血清。
50.权利要求48的方法，其中所述低氧含量条件为1-5%的氧。
51.权利要求49的方法，其中与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质相比，Wnt物质被上调。
52.权利要求51的方法，其中所述Wnt物质为wnt7a和wnt 11。
53.权利要求48的方法，其中与在约15-20%氧的氧条件中产生的介质相比，VEGF物质被上调。
54.权利要求53的方法，其中所述VEGF物质是VEGF-A或其同种型。
55.权利要求48的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。
56.权利要求48的方法，其中所述支撑物允许三维生长。
57.权利要求56的方法，其中所述支撑物包含筛网。
58.权利要求48的方法，其中所述支撑物允许二维生长。
59.权利要求58的方法，其中所述支撑物包含微球。
60.产生干细胞的方法，包括在低氧含量条件下在支撑物上在合适的生长培养基中培养细胞，从而产生以比含氧量正常的条件高至少3倍的水平表达干细胞基因特征的细胞。
61.权利要求60的方法，其中所述基因选自0ct4、Sox2、KLF4、NAN0G*cMyc。
62.权利要求61的方法，其中所述基因是0ct4。
63.权利要求60的方法，其中低氧含量条件包含1-5%的氧。
全文摘要
本发明涉及产生包含胚蛋白质的组合物的方法。该方法包括在生物相容性支撑物上在低氧含量条件下体外培养细胞。培养方法同时产生可溶和不可溶部分，其可单独使用或组合使用以获得生理学上可接受的在各种应用中有用的组合物。
文档编号C12P21/04GK102482698SQ201080040131
公开日2012年5月30日 申请日期2010年7月9日 优先权日2009年7月10日
发明者F·齐格勒, G·K·诺尔顿, K·尼克, M·鲍姆加特纳 申请人:希斯托金公司