噬菌体φ29DNA聚合酶嵌合体的制作方法

专利名称：噬菌体φ29DNA聚合酶嵌合体的制作方法
噬菌体6 29DNA聚合酶嵌合体
本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种DNA聚合酶嵌合体及其用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的用途，所述嵌合体包含编码￠29型DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区和含有至少一个HhH结构域的羧基末端(C-末端)区，二者通过连接氨基酸序列结合。同样，本发明提供一种使用所述DNA聚合酶嵌合体对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和一种用于实施所述方法的试剂盒。现有抟术水平噬菌体￠29复制其基因组所需要的唯一酶是其DNA聚合酶，这是既能催化复制起始又能催化合成链延伸的66KDa的单体蛋白。对于起始，该聚合酶与称为“末端”(TP)的蛋白质结合，识别0 29DNA的末端并催化TP-dAMP共价复合物形成。在聚合了 10个核苷酸后，DNA聚合酶/TP异二聚体解离，并延伸来自DNA的链。复制性DNA聚合酶需要与稳定酶和DNA间的结合的辅助蛋白相互作用(Kuriyan和0' Donnell. J Mol Biol. 1993 ;234 :915-925)。另一方面，所述DNA聚合酶必须在当时未被复制的DNA链分离时偶联聚合，为此它们需要与解旋酶型蛋白的功能缔合。在这方面，噬菌体￠29的DNA聚合酶具有以下使其独特的各种内在功能特性a)高持续合成能力(定义为通过结合事件掺入的核苷酸数目)；b)高链分离能力，这使得其可在不存在解旋酶型辅助蛋白时复制所述噬菌体的基因组。持续合成能力和链分离这两个特性使得0 29DNA聚合酶能够合成超过70kb长的DNA链(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940)；c)在新链中插入核苷酸的高准确性(Esteban等，J Biol Chem. 1993 ；268 2719-2726)。所有这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶扩增双链DNA(dsDNA)的等温过程(恒温)方案。在简单构型中，0 29DNA聚合酶利用环状单链DNA(ssDNA)的能力使得可通过滚环式方法(或RCA-滚环式扩增)扩增DNA，产生很长的含有不止10个环状模板拷贝 ssDNA 分子(Blanco 等，J Biol Chem. 1989 ；264 :8935-8940 ；US5001050, US5198543 和US5576204) o在由 Amersham Biosciences/Molecular Staging (Dean 等，Genome Res. 2001 ；11 :1095-1099 ;Dean 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ；99 :5261-5266)开发的用于扩增dsDNA的方法中，将使用c^29DNA聚合酶与使用六聚物(六-核苷酸)随机序列引物联合，使得能够从皮克级环状质粒DNA[GE Healthcare的Templiphi ]或从10纳克基因组DNA[GE Healthcare 的 Genomiphi 和 Qiagen 的 Repli-G ]开始获得 IO4-IO6 扩增因子。产生的产物具有高质量，并可直接被消化或测序而不需在前纯化，这证明了 0 29DNA聚合酶是用于该目的的最强的酶。用于实施使用429DNA聚合酶的扩增反应的常见缓冲液含有tris-HCl (pH 7. 5)加不同浓度(毫摩尔级)的 NaCl 或 KCl 和 MgCl2 (US20030207267)。然而，尽管这些方案在多种情况下令人满意，但仍日益需要开发允许从更少DNA量开始的其它方案。HhH (“螺旋-发夹-螺旋”)模体不管DNA序列如何而与之结合，并存在于各种DNA聚合酶、连接酶和糖基化酶中(Shao 和 Grishin. Nucleic Acids Res. 2000 ；28 :2643-2650 ；Doherty 等，Nucleic Acids Res. 1996 ;24 :2488-2497)。这些模体含有由"发夹"型环连接的一对反向平行a-螺旋。第二个a-螺旋不从该结构中突出，因此，不象其它DNA结合模体，其不能被插入DNA的大沟中。晶体学研究表明，通过两个a-螺旋之间的"环"来建立蛋白质-DNA互相作用。该环参与建立与DNA的非特异性相互作用，通常含有共有序列GhG，其中h为疏水残基，通常为I、V或L。晶体学结构解析表明，在多肽链的氮和DNA的磷酸的氧之间建立互相作用。此外，与磷酸基建立另外相互作用的极性氨基酸往往相对于第二个G存在于2及3位。共有序列的最后的G形成第二个a-螺旋的N-末端部分，疏水残基h促成模体的两个a-螺旋之间的相互作用。两个a-螺旋被包装，在彼此之间形成25-50°角，这决定了序列内特有的疏水型式。HhH模体通常形成称为(HhH)2的主要结构的部分，(HhH)2由通过a -螺旋结合的两个HhH模体构成，该两个模体关于促进其与a -螺旋稳定结合的 DNA成镜像对称(Shao 和 Grishin. Nucleic Acids Res. 2000 ；28 :2643-2650 ；Doherty等，Nucleic Acids Res. 1996 ；24 :2488-2497 ；Thayer 等，EMBO J. 1995 ；14 :4108-4120)。先前业已将热稳定DNA聚合酶(例如Taq和Pfu)与非特异性DNA结合模体之间形成嵌合体用于通过所述聚合酶提高DNA结合能力。(Pavlov等，Proc Natl AcadSci USA. 2002 ；99 :13510-13515 ；W02004013279 ；ffang 等，Nucleic Acids Res. 2004 ；32 1197-1207)。29DNA聚合酶结构的晶体解析提供负责与链分离偶联的向前聚合的分子基础，这是该酶的特别的特点(Kamtekar 等，2006 ；EMB0 J 25:1335-1343)。与其它真核型DNA聚合酶(B家族)进行的比较性分析显示相似的通用折叠由通用亚域手指、手掌和拇指形成的C-末端聚合结构域，其形成通道，通过该通道结合DNA ;和负责移走在聚合期间错误掺入的核苷酸的3' -5' N-末端核酸外切酶结构域。已知结构的DNA聚合酶和$ 29DNA聚合酶之间的主要结构差异，是在后者的聚合结构域中存在两个另外的亚域,这两个亚域都对应于DNA聚合酶亚群中保守序列的插入，所述插入用称为TPRl和TPR2的蛋白作为引物。亚域TPRl靠近手掌，并与DNA双螺旋接触。靠近亚域拇指、手掌和手指，具P -发夹结构的亚域TPR2形成环形结构(其完全包围新合成的DNA)，使DNA聚合酶与DNA结合，其为以向前方式的复制所需。同样，亚域TPR2与亚域手指、手掌和核酸外切酶结构域一起，参与狭窄通道的形成(模板链在复制期间通过该狭窄通道到达活性中心)，随着聚合酶移动迫使双链DNA分开，以与解旋酶起作用的相似方式起作用，并为聚合酶提供将聚合与链分离偶联的能力(Kamtekar等,2006 ；EMB0 J 25 :1335-1343 ；Rodriguez等，2005;Proc Natl Acad Sci USA 102:6407-6412)。小 29DNA 聚合酶关于其余聚合酶在聚合结构域方面的这种显著差异具有这样的作用，即肽在其C-末端的融合将在聚合和DNA方面具有其不可预见的结合特性。发明简述本发明涉及一种DNA聚合酶嵌合体及其用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的用途，所述嵌合体包含编码0 29型DNA聚合酶的N-末端区和含有至少一个HhH结构域的C-末端区，二者通过连接氨基酸序列结合。同样，本发明提供一种使用所述DNA聚合酶嵌合体对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和一种用于实施所述方法的试剂盒。
噬菌体29DNA聚合酶具有非常令人感兴趣的用于扩增DNA的几个特点，例如无需任何辅助蛋白参与的高持续合成能力；和高链分离能力，这使得其可在与DNA单一结合事件中复制所述噬菌体的基因组；以及在新链中插入核苷酸的高准确性。这些特性导致开发各种各样基于使用该聚合酶的用于等温扩增DNA的方案，该聚合酶使得能够获得不需在前纯化就可被直接消化或测序的高品质产物。然而，仍需要允许从其更小量扩增DNA的方案。本发明通过两种途径响应该需要1)开发显著改进反应的特异性和产量的组合物；和2)在0 29DNA聚合酶和增强该酶的DNA结合能力的非特异性DNA结合模体之间形成嵌合体。在本专利实施例中显示，将聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦(Tween 20)和铵盐同时加入通常用于用0 29DNA聚合酶来扩增的缓冲液中，一方面防止非特异性DNA扩增，另一方面使得能够从有限量的0. I飞克(fg)的质粒DNA和作为模板的IOfg基因组DNA实现可检测的特异性扩增。对于提高DNA结合能力，在本发明中将坎德勒氏甲烧嗜热菌(Methanopyruskandleri)的拓扑异构酶V的HhH模体通过源自4种不同嵌合体的连接序列或接头与(t29DNA聚合酶的羧基端融合。这些嵌合体能够从小于天然0 29DNA聚合酶所需的量扩增模板DNA。本发明第一方面涉及一种DNA聚合酶嵌合体(下文称为本发明DNA聚合酶嵌合体)，所述嵌合体包含a)通过其C-末端与b)结合的编码小29型DNA聚合酶的氨基酸序列；b)通过其C-末端与c)结合的连接氨基酸序列； c)包含至少一个螺旋-发夹-螺旋结构域(HhH)的氨基酸序列。本说明书所用术语“DNA聚合酶”涉及能够催化脱氧核苷三磷酸聚合的酶。通常，所述酶在与模板DNA序列杂交的引物3'端起始合成，并向模板DNA链的5'端行进。本说明书所用术语“嵌合体”涉及其氨基酸序列为至少两种不同蛋白质的氨基酸序列的融合产物的蛋白质。嵌合蛋白通常通过其从编码嵌合氨基酸序列的嵌合DNA的表达来产生。本说明书所用术语“DNA聚合酶嵌合体”或“嵌合DNA聚合酶”涉及其氨基酸序列为至少两种不同蛋白质(其中之一是DNA聚合酶)的氨基酸序列的融合产物的蛋白质，且该蛋白质能够催化脱氧核苷三磷酸的聚合。本发明DNA聚合酶嵌合体包含编码￠29型DNA聚合酶的N-末端区(a)和含有至少一个HhH结构域的C-末端区(c)，(a)和(C)通过连接氨基酸序列(b)结合。本发明所用术语“ ￠29型DNA聚合酶”涉及在其聚合结构域中含有TPRl和TPR2亚域的任何DNA聚合酶，所述聚合结构域为聚合酶提供将向前聚合与链分离偶联的能力。可用于本发明的$ 29型DNA聚合酶的实例选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶$ 29,Cp-UPRD-I、15、<j5 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-l、SF5、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722、L17 或酸菌属瓶形病毒(Acidianus Bottle-shaped virus, ABV)。在本发明该第一方面的优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(a)的氨基酸序列编码0 29型DNA聚合酶，所述0 29型DNA聚合酶选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶￠29, Cp-I、PRD-I、小15、小 21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-1、SF5、Cp_5、Cp_7、PR4、PR5、PR722、L17或酸菌属瓶形病毒(ABV)。 优选本发明DNA聚合酶嵌合体的(a)的氨基酸序列与SEQ ID NO : I具有至少80%同一性。更优选本发明嵌合体的(a)的氨基酸序列与SEQ ID NO: I具有至少90%同一性。甚至更优选本发明嵌合体的(a)的氨基酸序列为SEQ ID NO:l。
￠29型DNA聚合酶的核酸外切酶结构域为已知的，并可经修饰降低核酸外切酶活性，但保留高持续合成能力和链分离能力。这些经修饰的DNA聚合酶尤其可用于大分子测序。在本发明该第一方面的优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(a)的氨基酸序列编码在核酸外切酶结构域中具有修饰的￠29型DNA聚合酶，其中所述经修饰的DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶或“野生型”相比优选具有小于10%的核酸外切酶活性，更优选具有小于1%的核酸外切酶活性。在又一更优选实施方案中，所述经修饰的小29型DNA聚合酶相对于相应的天然存在的DNA聚合酶缺乏可检测的核酸外切酶活性。HhH(“螺旋-发夹-螺旋”)模体为非序列依赖性的DNA结合模体。在结构上，HhH模体由通过钩型环连接的一对反向平行a-螺旋形成。该环参与与DNA的相互作用，并一般具有由甘氨酸-疏水氨基酸-甘氨酸(GhG)组成的共有序列，其中h为疏水氨基酸残基，通常为亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。共有序列的最后的甘氨酸作为第二个a-螺旋的N-末端残基起作用，疏水残基h有助于模体的两个a -螺旋之间的相互作用。在其序列中具有HhH模体的蛋白质实例为但不限于坎德勒氏甲烷嗜热菌的DNA拓扑异构酶 V、大肠杆菌(Escherichia coli)的蛋白 MutY、Nth、MutM/Fpg、Nei、UvrC、DinP, RecR、UmuC, DnaE 或 DnIJ 或者酵母的蛋白 RADI、RAD2、RADIO、RAD27、RAD 55、RAD57、REVl、OGGI、NTGl、NTG2、DIN-7或EX0-1，以及其它生物中这些蛋白的同源物，所述其它生物例如但不限于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)、流感嗜血杆菌(Haemophilus inf luenzae)、詹氏甲烧球菌(Methanococcusjannaschii)、藤黄微球菌(Micrococcus Iuteus)、热甲酸甲烧杆菌(Methanobacteriumthermoformicum)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。因此，在本发明该第一方面的优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(C)的氨基酸序列包含选自以下的蛋白质的至少一个HhH结构域-坎德勒氏甲烷嗜热菌的拓扑异构酶V；-大肠杆菌的MutY、Nth、MutM/Fpg、Nei、UvrC、DinP、RecR、UmuC> DnaE 或 DnIJ ；-酵母的RAD1、RAD2、RAD10、RAD27、RAD 55,RAD 57、REVl、0GG1、NTGl、NTG2、DIN_7或EX0-1 ;或-枯草芽孢杆菌、秀丽隐杆线虫、流感嗜血杆菌、詹氏甲烷球菌、藤黄微球菌、热甲酸甲烷杆菌或鼠伤寒沙门氏菌中的以上蛋白质的蛋白质同源物。坎德勒氏甲烷嗜热菌的拓扑异构酶V的C-末端被组织为12个约50个氨基酸的重复，其各称为A-L结构域，且各具有两个HhH模体。在本发明该第一方面的优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(C)的氨基酸序列，包含源自坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V(其氨基酸序列为SEQ ID NO 2)的至少一个HhH结构域。在本发明该第一方面的更优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(C)的氨基酸序列为对应于坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的H结构域的序列的SEQ ID NO :3。在本发明该第一方面的另一更优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的(C)的氨基酸序列为通过其C-末端与SEQ ID NO :4结合的SEQ ID NO :3，其对应于通过其C-末端与坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的I结构域结合的坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的H结构域的序列。
本发明所用术语“连接氨基酸序列”涉及至少2个氨基酸长的短氨基酸序列，其使得能够维持本发明DNA聚合酶嵌合体的(a)和(C)的氨基酸序列的功能。优选(b)的连接氨基酸序列由6个氨基酸组成。更优选(b)的连接氨基酸序列为SEQ ID NO :5或SEQ IDNO :6。本发明另一方面涉及本发明DNA聚合酶嵌合体用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的用途。本发明另一方面涉及一种用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触a)本发明DNA聚合酶嵌合体；b)缓冲液；c)氯化镁；d)引物；和e)核苷三磷酸。本发明该方面的一个优选实施方案涉及一种用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与反应混合物接触,所述反应混合物包含前述成分(a)-(e)，并进一步包含聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦、铵盐、钾盐或上述的任何组合。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的浓度为5nM-75nM。在一个更优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的浓度为25nM-60nM。在又一更优选实施方案中，本发明DNA聚合酶嵌合体的浓度为大约50nM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦(Tween 20)的浓度为总反应体积的0. 003% -0. 1%。在一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 006% -0. 05%。在又一更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 01% -0.03%。在又一更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的大约0. 025%。“总反应体积”应理解为将模板DNA加入到反应混合物中以后得到的体积。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐选自硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为硫酸铵。在一个更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为30mM-60mM。在又一更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为40mM-50mM。在又一更优选实施方案中，硫酸铵的浓度为大约45mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为氯化铵。在一个更优选实施方案中，氯化铵的浓度为60mM-120mM。在又一更优选实施方案中，氯化铵的浓度为80mM-100mM。在又一更优选实施方案中，氯化铵的浓度为大约90mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，铵盐为乙酸铵。在一个更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为60mM-120mM。在又一更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为80mM-100mM。在又一更优选实施方案中，乙酸铵的浓度为大约90mM。
在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，缓冲液的pH为7.0-8. 5。在一个更优选实施方案中，缓冲液的pH为7. 2-8。在又一更优选实施方案中，缓冲液的pH为大约7. 5。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，缓冲液为tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为7. 0-8. 5。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为7. 2_8。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的pH为大约7. 5。在本发明用于复制、扩增或测序的方法该方面的一个优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为25mM-50mM。在一个更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM。在又一更优选实施方案中，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为大约40mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，钾盐为氯化钾或乙酸钾。在一个更优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为30mM-70mM。在又一更优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在又一更优选实施方案中，氯化钾或乙酸钾的浓度为大约50mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，氯化镁的浓度为2mM-20mM。在一个更优选实施方案中，氯化镁的浓度为5mM-15mM。在又一更优选实施方案中，氯化镁为大约10mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0. 01 % -0. 03 %，硫酸铵的浓度为40mM-50mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025 %，硫酸铵的浓度为45mM，缓冲液tris_盐酸、tris_乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10禮，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0.01% -0. 03%，氯化铵的浓度为80mM-100mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025%，氯化铵的浓度为90mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总体积的0.01% -0. 03%,乙酸铵的浓度为80mM-100mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为30mM-45mM和pH为7. 2-8. 0，氯化镁的浓度为5mM-15mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。、
在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个更优选实施方案中，聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的浓度为总体积的0. 025%,乙酸铵的浓度为90mM，缓冲液tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES的浓度为40mM和pH为7. 5，氯化镁的浓度为10mM，且氯化钾或乙酸钾的浓度为50mM。本说明书所用术语“复制”涉及从模板DNA合成互补DNA。本说明书所用术语“扩增”涉及增加模板DNA的拷贝数。本说明书所用术语“测序”涉及测定模板DNA核苷酸的顺序。“接触”应理解为这样的事实，即在引物延伸条件下孵育模板DNA与反应混合物。本文所用术语“引物”涉及当其在引物延伸条件下时能够作为DNA合成起点起作用的寡核苷酸。优选引物为脱氧核糖寡核苷酸。可通过任何合适的方法制备引物，所述方法包括例如但不限于直接化学合成。可将引物设计为与模板DNA的特定脱氧核苷酸序列杂交(特异性引物)，或可随机合成(随意引物)。本说明书所用术语“特异性引物”涉及其序列与待扩增的模板DNA的特定脱氧核苷酸序列互补的引物。“互补”应理解为这样的事实，即引物可与模板DNA的区域杂交，使得当其在引物延伸条件下时可作为DNA合成起点起作用。优选该区域与模板DNA的区域具有100%互补性。换言之，与引物互补的区域中的各核苷酸可与单链模板中存在的核苷酸形成氢键。然而，具有本领域一般知识的人员将会承认，含相对于模板DNA具有小于100%互补性的区域的引物可发挥作用以实施本发明用于复制、扩增或测序的方法。术语“随意引物”涉及其序列随机合成并用于在模板DNA的随机位置起始DNA合成的引物。通常，在本发明用于复制、扩增或测序的方法中，使用一组随意引物。术语“随意引物”涉及具有随机序列并用于在模板DNA的随机位置起始DNA合成的一系列引物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，引物为特异性的。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的另一优选实施方案中，引物为随意的。优选随意引物受到保护免受3' -5'核酸外切酶的作用。且更优选随意引物为6个核苷酸的寡核苷酸、“六核苷酸”或“六聚物”，其受到保护免受3' -5'核酸外切酶的作用。本说明书所用表述“受到保护免受核酸外切酶的作用”涉及经修饰的引物，使得其抵抗本发明DNA聚合酶嵌合体中存在的任何3' -5'核酸外切酶活性的核酸降解。在本发明用于复制、扩增或测序的方法中，可使用不止一种引物，能使用特异性引物和/或随意引物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一个优选实施方案中，引物的浓度为2 u M-IOO u M0在一个更优选实施方案中，引物为的浓度20 yM-80 PM。在又一更优选实施方案中，引物的浓度为40 u M-60 u M0在又一更优选实施方案中，引物的浓度为大约50 u M。本说明书所用术语“核苷三磷酸”涉及由戊糖、氮碱基和三个磷酸基团的共价键形成的有机分子。术语核苷三磷酸包括脱氧核苷三磷酸(dNTP)，例如但不限于dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。优选脱氧核苷三磷酸为dATP、dITP、dGTP和dCTP。甚至 更优选这四种dNTP处于等摩尔条件。在本发明该方面的一个优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为100 i! M-800 i! M。在一个更优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为200 u M-600 u M0在又一更优选实施方案中，脱氧核苷三磷酸的浓度为大约500 PM。
术语核苷三磷酸亦包括双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，例如但不限于ddATP、ddCTP、ddlTP、ddUTP、ddGTP、ddTTP 或其衍生物。在本发明用于复制、扩增或测序的方法的一些优选实施方案中，通过本领域现状中熟知的技术标记至少一种核苷三磷酸或一种引物。被标记的核苷酸可为例如脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。可检测的标记包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记或酶标记。本说明书所用术语“模板DNA”涉及可作为用于合成互补DNA链的底物的DNA分子；即其涉及待复制、扩增或测序的DNA分子。在一个优选实施方案中，模板DNA为质粒DNA。在另一优选实施方案中，模板DNA为基因组DNA。在引物延伸条件下实施模板DNA的复制、扩增或测序。表述“引物延伸条件”指其中可发生在引物中起始的依赖模板DNA的合成的条件。按照本发明用于复制、扩增或测序的方法，可通过热循环过程或在基本上恒温下发生模板DNA合成。“等温条件”应理解为基本上恒温。按照本发明用于复制、扩增或测序的方法，优选模板DNA合成在基本上恒温下发生。更优选基本上恒温为25-40°C，甚至更优选为大约30。。。允许DNA扩增的大量方法在本领域现状中众所周知。一些方法需要热循环过程，例如但不限于聚合酶链式反应(PCR)。其它方法不需要热循环过程，而是在基本上恒温下进行，例如但不限于滚环式扩增(RCA)、多重置换扩增(multiple detachmentamplification,MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMP)。按照本发明方法可通过热循环过程或在基本上恒温下发生模板DNA扩增。按照本发明扩增方法，优选通过滚环式扩增(RCA)、通过多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMPA)来进行模板DNA的扩增。本发明另一方面涉及一种包括适于实施本发明用于复制、扩增或测序的方法的组成部分的试剂盒或装置。本发明另一方面涉及一种用于实施本发明用于复制、扩增或测序的方法的试剂盒，所述试剂盒包括a)本发明DNA聚合酶嵌合体；b)缓冲液；和c)氯化镁。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒还包括聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦、铵盐、钾盐或上述的任何组合。优选所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。优选所述钾盐为氯化钾或乙酸钾。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒还包括引物。在一个更优选实施方案中，引物为受到保护免受3' -5'核酸外切酶作用的随意引物。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒还包括核苷三磷酸。例如，在本发明该方面一个更优选实施方案中，试剂盒还包括脱氧核苷三磷酸和/或双脱氧核苷三磷酸。在本发明该方面一个优选实施方案中，试剂盒包括至少一种三磷酸核苷或一种标记引物。标记的核苷可为例如脱氧核苷三磷酸或双脱氧核苷三磷酸。试剂盒还可包括但不限于任何形式的缓冲液、防止污染的试剂等。在另一方面，试剂盒可包括用于将其付诸实施及用于其优化所需的所有支持物和容器。优选试剂盒还包括用于实施本发明方法的说明书。贯穿本说明书和权利要求书的术语"包含"及其变体不排除其它技术特征、添加齐U、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，可部分地从本说明书和部分地从本发明的实施推知其它目的、优势及特征。通过举例说明提供以下附图及实施例，其不限制本发明。


图I显示Tween 20和(MM)2SO4在$ 29DNA聚合酶扩增能力方面的作用。如主要的正文所述在所示量的质粒DNA(4. 2kpb)存在下实施测定。在30°C孵育5小时后，如主要的正文所述分析反应物。左边为用作DNA长度标记的在用HindIII消化4 29DNA后获得的线性DNA片段。图2显示4 29DNA聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下对不同量的质粒DNA (飞克数量级)的扩增。如主要的正文所述在0.025% Tween 20和45mM(MM)2SO4存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。图3显示NH4+离子在4 29DNA聚合酶扩增能力方面的作用。如主要的正文所述在0. 025% Tween 20和所示铵盐以及所示量的质粒DNA(4. 2kpb)存在下实施测定。在30°C孵育6小时后，如主要的正文所述分析反应物。DNA长度标记与图I中所用相同。图4显示(j5 29DNA聚合酶在Tween 20和(MM)2SO4存在下对不同量枯草芽孢杆菌基因组DNA的扩增。如主要的正文所述在0. 025% Tween 20和45mM(MM)2SO4存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。图5显示通过将0. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4加入到用于基于029 DNA聚合酶的DNA扩增的商业试剂盒(General Electrics HealthCare的Illustra试剂盒)的目前反应缓冲液中所表示的显著改进。如主要的正文所述实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。图6显示构建嵌合体HAY、HGT、HIAY和HIGT遵照的不同步骤的图。图7显示由天然和嵌合4 29DNA聚合酶引起的引物/模板DNA分子在凝胶中的阻滞。使在5’标记的15个碱基/21个碱基的杂交分子(dsDNA)与天然0 29DNA聚合酶或与所示的嵌合DNA聚合酶在本文所述条件下孵育。通过其在4% (w/v)天然聚丙烯酰胺凝胶(80 I的单体双丙烯酰胺)中电泳分离后放射自显影来检测游离dsDNA和聚合酶-DNA复合物的迁移。图8显示天然和嵌合c^29DNA聚合酶引起的DNA向前复制。(A)天然和嵌合(t29DNA聚合酶引起的与链分离偶联的M13DNA复制。如本文所述用天然或嵌合029DNA聚合酶(30nM)以单一引物进行250ng的M13DNA的复制。单位长度的M13DNA的位置显示在右边。(B)由天然和嵌合0 29DNA聚合酶引起的向前合成。在与(A)相同的条件下用所示的渐减DNA聚合酶浓度实施测定。在30°C孵育20分钟后，如(A)所述处理样品。、
图9显示天然和嵌合0 29DNA聚合酶引起的IOfg质粒DNA的多重引发的滚环式扩增。如主要的正文所述在所示缓冲液B和50nMDNA聚合酶存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。图10显示天然和嵌合c^29DNA聚合酶引起的IOOfg枯草芽孢杆菌基因组DNA的多重引发的全基因组扩增。如本文所述在所示缓冲液B和50nM DNA聚合酶存在下实施测定。DNA长度标记与图I中所用相同。
实施例本专利文件中提供的以下具体实施例起阐明本发明特性的作用。包括这些实施例仅为了阐明目的，不必理解为对本文主张的本发明的限制。因此，下述实施例阐明本发明而不限制其应用领域。实施例I用于4 29DNA聚合酶多重引发扩增DNA的实验条件的优化业已显示c^29DNA聚合酶从几皮克环状DNA开始扩增IO4-IO6倍。为此目的，使用含有40mM tris-HCl (pH 7. 5)、50mM KCl和IOmMMgCl2 (下文称为缓冲液A)的反应缓冲液。在测试不同去污剂和盐条件对029DNA聚合酶的DNA扩增能力的影响后，发现将0. 025%Tween 20和45mM(NH4)2SO4同时加入到缓冲液A中，大大改善所提供的有限量的DNA的扩
增o用于扩增质粒DNA的反应条件。-孵育混合物含有12. 5 ill缓冲液A、50 u M受保护免受3' -5'核酸外切酶作用的六聚物、500 ii M的各脱氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)、所示量的质粒DNA (大小为4. 2kbp)，并按所示加入(NH4)2SO4 45mM或0. 025%Tween 20或二者的组合。通过在95°C孵育3分钟和随后在冰中冷却5分钟，使DNA变性。加入50nM(j5 29DNA聚合酶后起始反应，通过加热到65°C持续10分钟在30°C孵育后终止反应。为了分析结果，从反应物中取出Iul样品，用EcoRI限制性核酸内切酶消化扩增的DNA，并在0. 7%琼脂糖凝胶中电泳。通过用溴化乙锭对凝胶染色来检测DNA。用于扩增基因组DNA的反应条件。-孵育混合物含有12.5iU缓冲液A、45mM(NH4)2SO4^O. 025% Tween 20、50 y M受保护免受:V -5/核酸外切酶作用的六聚物、500 ii M各脱氧核苷三磷酸(dCTP、dGTP、dTTP和dATP)和所示量的枯草芽孢杆菌基因组DNA(大小为4Mpb)。通过在95°C孵育3分钟和随后在冰中冷却5分钟来使DNA变性。力口A 50nM(j5 29DNA聚合酶后起始反应，通过加热到65°C持续10分钟在30°C孵育后终止反应。为了分析结果，从反应物中取出Iu I样品，并在0. 7%琼脂糖凝胶中电泳。通过用溴化乙锭对凝胶染色来检测DNA。图I显示加入45mM(NH4)2SOdPO. 025% Tween 20在扩增所提供的少量质粒DNA中的作用。如所示，当使用IOOfg所提供的DNA时，$ 29DNA聚合酶用标准缓冲液A未产生可检测的任何扩增产物。在这些反应条件中，在不存在DNA时加入0. 025% Tween 20导致出现痕量DNA产物，大部分可能是由于随机六聚物引物的杂交和延伸引起的非特异性DNA扩增。用IOfg所提供的DNA观察到同样的痕量。然而，在IOOfg所提供的DNA存在下，力口A 0. 025% Tween 20使得小29DNA聚合酶能够产生可检测量的扩增的质粒。特异性或非特异性扩增的DNA的总产量表明，将0. 025% Tween㊣20加入到缓冲液A中促进了小29DNA聚合酶的扩增能力。用NP40去污剂观察到相似的作用。相反，所分析的其它去污剂例如Triton XlOO和Triton X114未促进29DNA聚合酶的扩增能力(未显示)。将0.025%Tween 20和45mM (NH4)2SO4同时加入到缓冲液A中，在扩增产物的产量及特异性方面具有两种结果1)在不存在所提供的DNA时检测不到DNA扩增；2)即使在所提供的DNA量低至IOfg时，通过扩增也获得若干Ug的单位长度的质粒DNA。作为对照，将45mM(NH4)2SO4W入到缓冲液A中对29DNA聚合酶扩增能力不产生任何改进。因此，可得出的结论是，将0.025% Tween 20和45mM (NH4)2SO4同时加入到缓冲液A中(下文称为缓冲液B)对于实施0 29DNA聚合酶对环状DNA的多重引发扩增的实验条件产生明显优化，二者皆为扩增所提供的有限量(IOfg)的DNA所绝对必需的试剂。事实上，如图2所见，使用缓冲液B使得29DNA聚合酶能够用低至0. Ifg(约24个分子)的所提供的质粒量在6小时反应后合成微克DNA。作为质量控制，用EcoRI消化扩增产物产生了
4.2kb的线性dsDNA片段，这表明扩增产物确实是原始质粒的串联重复。此外，缓冲液B亦防止非特异性DNA扩增(参见图2中对应于未提供DNA所实施的反应的泳道)。图3显示铵离子和0. 025 % Tween 20在改进扩增少量质粒DNA方面的作用。在0. 025% Tween 20和所示铵盐存在下在先前所述条件中实施测定。如图3可观察到的，NH4Cl和NH4CH3COO 二者都在扩增产物的产量和特异性方面具有与(NH4) 2S04相似的作用。该结果表明，前述(NH4)2SO4在扩增有限量质粒DNA中的作用是由于NH4+离子。为了测定上述优化条件是否亦适用于扩增基因组DNA，在有限浓度的枯草芽孢杆菌基因组DNA(长4Mpb)存在下，进行了所实施的同样类型的测定。如图4所示，在缓冲液B中存在0. 025% Tween 20和45mM(NH4)2SO4, —方面防止非特异性DNA扩增(无所提供的DNA的泳道)，另一方面使得0 29DNA聚合酶能够产生可检测的和特异性的基因组DNA扩±曾，即使在使用IOfg所提供的DNA时，即相比目前商业基因组扩增试剂盒所推荐的量降低至 1/106。为了测定同时加入0.025% Tween 20和45mM (NH4)2SO4是否提高用于基于029DNA聚合酶的DNA扩增的目前商业试剂盒的扩增效率，进行了如图1、2和3所述相同类型的质粒DNA扩增测定。图5显示通过将0. 025% Tween 20和45mM(NH4)2S04加入到Illustra试剂盒(GE Healthcare)的目前反应缓冲液中所表示的显著改进。如可观察到的，根据供应商的推荐，用Illustra试剂盒只有在所提供的质粒量等于或大于IOpg时，才可以以在琼脂糖凝胶中可检测的方式扩增。与此相反，将0. 025 % Tween .㊣20和45mM (NH4) 2S04同时加入到Illustra试剂盒的反应缓冲液中，显著降低所需的可扩增的DNA的量，从所提供的Ifg质粒DNA可观察到扩增产物，这涉及扩增的四个数量级的提高。实施例2.通过加入HhH结构域改讲4 29DNA聚合酶的扩增能力使$ 29DNA聚合酶与一个或两个HhH结构域融合，构建具改进的DNA结合能力的新DNA聚合酶，其使得能够使用所提供的较小量的DNA。29DNA聚合酶的结构检查导致选择HhH结构域与该酶的C-末端融合，因为该末端(亚域拇指的末端)靠近顶部dsDNA序列的通道入口。HhH结构域与4 29DNA聚合酶的N-末端融合将损害内在的链分离能力，因为生物化学及结构数据表明母DNA解旋发生在氨基端附近。此外，将HhH结构域定位在N-末端对于改进六聚物引物与模板DNA杂交形成的dsDNA部分的结合是不合适的。在这种情况下，在小29DNA聚合酶N-末端融合序列(His)6对于扩增具有破坏作用。 2. I嵌合DNA聚合酶构津体
为了制备嵌合体HIAY和HIGT,委托GenScript Corporation合成DNA片段,所述片段含有编码坎德勒氏甲烷嗜热菌拓扑异构酶V的HhH结构域H (56个氨基酸)和I (51个氨基酸)的核苷酸(GenBank 代码 AF311944，Pavlov 等，Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ；99 :13510-13515),将该DNA片段克隆到商业载体pUC57的EcoRV位点之间。将得到的质粒pUC57-HhH用作模板用于通过PCR扩增编码结构域H和I的DNA片段。因此，引物3(SEQ IDNO :7)与引物 1(SEQ ID N0:8)或 2(SEQ ID NO :9)—起分别产生 369bp 的 DNA I和 II 片段。除了由两个引物引入的KasI位点外，引物I亦引入编码SEQ ID NO :5接头的序列(Pavlov等，Proc Natl Acad Sci USA. 2002 ;99 :13510-13515)，而引物 2 引入编码 SEQ ID NO :6 接头的核苷酸序列(先前在Sun等，Proteins. 2006 ；65 =231-238中所述的SEQ ID NO : 10接头衍生物)。引物3含有编码6个组氨酸残基接着终止密码子和BamHI位点的序列(参见图6中嵌合DNA聚合酶构建体简图)同时，将含有编码0 29DNA聚合酶(572个氨基酸)的基因的pJLw2质粒衍生物(Lazaro 等，Methods Enzymol. 1995 ；262 :42_49)用作模板，用于用包含 5' HindIII 位点的引物 4(SEQ ID NO :11)和引物 5(SEQ ID NO :12)或 6 (SEQ ID NO 13)实施的 PCR 反应，以分别获得1757bp的片段III和IV。因此，片段III和IV应含有编码0 29DNA聚合酶，接着是SEQ ID NO :5(片段III)和亦包含KasI位点的SEQ ID NO :6(片段IV)序列的DNA。在0. 7%琼脂糖凝胶中纯化片段I-IV，然后用KasI消化。用T4DNA连接酶连接消化的DNA片段I和III及II和IV，分别获得编码嵌合体HIAY (片段V)和HIGT (片段VI)的2108bp的线性DNA。在0. 7%琼脂糖凝胶中纯化连接的产物，然后用BamHI和HindIII核酸内切酶消化。通过在琼脂糖凝胶中电泳纯化消化的产物。最终将片段V和VI克隆到载体PT7-4中(Tabor 等，Proc Natl Acad Sci USA. 1985;82:1074-1078)。将嵌合体 HIAY (29DNA 聚合酶+SEQ ID NO :5接头+拓扑异构酶V的结构域H和I)和HIGT (29DNA聚合酶+SEQ IDNO :6接头+拓扑异构酶V的结构域H和I)用作模板，以通过QuikChange (Stratagene)定向诱变试剂盒将终止密码子插入拓扑异构酶V的H片段之后分别构建嵌合体HGT和HAY。通过对全基因测序来进行DNA序列和不存在另外突变的确认。在容纳有克隆到pJLw2质粒衍生物中的嵌合基因的大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中表达嵌合DNA聚合酶，然后大体上如(Lazaro 等，Methods Enzymol. 1995 ；262 :42_49)所述纯化。总之，获得的嵌合DNA聚合酶如下HAY 29DNA 聚合酶-SEQ ID NO :5_HhH H(635aa ;约 73kDa)HGT 29DNA 聚合酶-SEQ ID NO 6-HhH H(635aa ;约 MkDa))HIAY 29DNA 聚合酶-SEQ ID NO :5_HhH H-I (692aa ;约 80kDa)HIGT 29DNA 聚合酶-SEQ ID NO :6_HhH H-I (692aa ;约 80kDa)2. 2.嵌合DNA聚合酶的DNA结合能力。为了测定在0 29DNA聚合酶末端的HhH模体融合是否赋予嵌合体改进的与DNA的结合能力，在凝胶中进行了 DNA的电泳迁移阻滞分析。测定条件。-由Isogen提供15个碱基(SEQ ID NO 14)的寡核苷酸和除了与15个碱基的寡核苷酸互补的序列外还具有6个核苷酸的5’延伸的21个碱基(SEQ ID NO 15)的寡核苷酸。在5’用[Y -32PlATP和T4激酶多核苷酸标记15个碱基的寡核苷酸。在5’标记的15个碱基的寡核苷酸在0. 2M NaCl和60mM(pH 7. 5) tris-HCl存在下与21个碱基的寡核苷酸杂交。用杂交的在5’标记的15个碱基的寡核苷酸分子/21个碱基的寡核苷酸分析与天然或嵌合0 29DNA聚合酶的相互作用。20iU终体积的孵育混合物含有50mM(pH7.5) tris-HCl> ImM 二硫苏糖醇、10mMMgCl2、20mM 硫酸铵、0. lmg/ml 牛血清白蛋白(BSA)、4%甘油、lnM15个碱基/21个碱基的寡核苷酸分子和所示浓度的天然或嵌合0 29DNA聚合酶。在4°C孵育5分钟后，使样品在含有12mM(pH 7. 5) tris-乙酸和ImM EDTA的4%聚丙烯酰胺凝胶(w/v)(单体双体80 I)中电泳，在4°C的相同缓冲液中以8V/cm显色，其基本上如(Carthew等，Cell. 1985 ；43 =439-448)所述。在放射自显影后，聚合酶-dsDNA复合物检测为在标记的DNA迁移位置中的迁移分离(阻滞)。在这些条件中，天然029DNA聚合酶用15个碱基/21个碱基的标记的杂交寡核苷酸分子产生单一阻滞带(参见图7)，可将所述杂交的寡核苷酸分子理解为能用于聚合的稳定酶-DNA 复合物(M6ndez 等，J Biol Chem. 1994 ；269 :30030-30038)。嵌合体 HAY、HGT 和HIGT显示比天然酶更强的DNA结合能力，因为大部分底物在9. 5nM浓度时分开，不象天然DNA聚合酶需要大约2倍的浓度。嵌合体HIAY具有与天然聚合酶相似或甚至更低的DNA结合能力。从这些结果可得出，一般而言，将拓扑异构酶V的HhH H和H+I结构域加到4 29DNA聚合酶的C-末端赋予改进的DNA结合能力，但有例外，例如在嵌合体HIAY的情况下。2. 3.通过嵌合DNA聚合酶进行的滚环式复制。为了测定通过将拓扑异构酶V的HhH结构域加到小29DNA聚合酶的C-末端获得的DNA结合的改进是否一方面影响聚合活性和另一方面影响与链分离偶联的DNA向前合成，用Ml3引物实施了复制测定，其中DNA聚合酶从DNA寡核苷酸的3’ -OH基团开始聚合。在该测定中，第一个复制循环不需要链分离，但一旦完成，聚合酶就找到引物的5’端，由此需要主动分离以继续以后的复制循环(滚环式型)。测定条件。-使M13mpl8ssDNA 在 0. 2M NaCl 和 60mM(pH 7. 5) tris-HCl 存在下与通用引物杂交，将得到的分子用作引物/模板，来分析嵌合DNA聚合酶进行的与链分离偶联的向前的DNA聚合。25 ill孵育混合物含有50mM (pH 7. 5) tris-HCl UOmM MgCl2、lmM 二硫苏糖醇、4%甘油、0. lmg/ml BSA、40iiM dCTP、dGTP、dTTP 和[a-32P] dATP (I y Ci)、250ng 用序列SEQ ID NO :16的寡核苷酸引发的M13mpl8ssDNA和30nM天然或嵌合4 29DNA聚合酶。在30°C孵育所示时间后，通过加入0. 1% EDTAUOmM-SDS来终止反应，通过S印hadex G-50柱过滤样品。从对应于排除体积的Cerenkov辐射计算相对活性。对于大小分析，通过用0. 7M NaOH处理来使标记的DNA变性，在0. 7%碱性琼脂糖凝胶中进行电泳，其如(McDonell等，J Mol Biol. 1977 ；110 =119-146)所述。在电泳后，通过用溴化乙锭染色来检测单位长度的M13mp8ssDNA,然后干燥凝胶并放射自显影。如图8A所示，重大发现为HhH结构域的存在不干扰嵌合DNA聚合酶的链分离能力。嵌合体HAY、HGT、HIAY和HIGT合成的DNA的量大于天然小29DNA聚合酶合成的量(分别为4、5、5和7倍)。复制速度与用天然0 29DNA聚合酶获得的速度相似(在嵌合体HAY和HGT情况下)或甚至更快(嵌合体HIGT和HIAY)。该结果表明，在嵌合体中小29DNA聚合酶C-末端存在HhH结构域，改进滚环式复制期间的模板DNA的利用。2. 4.通过嵌合DNA聚合酶讲行的向前聚合。0 29DNA聚合酶是用于DNA向前复制的范例，因为其在不存在辅助蛋白时能掺入大于70kb的碱基而不与DNA解离。因此，分析了嵌合DNA聚合酶中(t29DNA聚合酶C-末端融合HhH结构域是否影响聚合的持续合成能力。测定条件。-用不同比例的酶/DNA分析了嵌合DNA聚合酶的持续合成能力。25 ill的孵育混合物含有 50mM(pH 7. 5) tris-HCL、IOmMMgCl2、ImM 二硫苏糖醇、4% 甘油、0. lmg/mlBSA、40iiM dCTP、dGTP、dTTP 和[a-32P] dATP (I y Ci)、250ng 引发的 M13mpl8ssDNA 和所示渐减量的天然4 29DNA聚合酶或嵌合DNA聚合酶。在30°C孵育20分钟后，通过加入IOmMEDTA-0. 1% SDS来终止反应，通过S印hadexG-50柱过滤样品。对于大小分析，通过用0. 7MNaOH处理来使标记的DNA变性，并在0. 7 %碱性琼脂糖凝胶中电泳。通过用渐减比例的DNA聚合酶/DNA分析复制产物的长度来评估聚合的持续合成能力。如图8B所示，按照向前DNA聚合模型，渐减比例的酶/DNA不改变天然或嵌合小29DNA聚合酶合成的延伸产物的长度。 2.5.通过天然和嵌合0 29DNA聚合酶进行的质粒DNA的多重引发的滚环式扩增(RCA)。如上所述，429DNA聚合酶具有的高持续合成能力和链分离能力，是AmershamBiosciences/Molecular Staging开发用于扩增等温ssDNA的更有效方法之一的基础，其中29DNA聚合酶与随机六聚物引物的组合通过皮克环状质粒[Tempiiphi (www.gehealthcare. com)]的链分离实现IO4-IO6倍的等温准确扩增。在其C-末端含有融合的(His)6序列的0 29DNA聚合酶的结果显示，尽管其在滚环式复制期间用单引物效率很好，但是在多重引发的RCA期间不能够产生可检测的扩增产物。对于029DNA聚合酶的其它突变衍生物同样是这样，所述其它突变衍生物对于dNTP显示更大的亲和力，其以天然DNA聚合酶的水平复制M13DNA，但不能得到扩增产物。因此，尽管HhH结构域与$ 29DNA聚合酶C-末端的融合改进天然酶用单一引物进行滚环式复制的内在能力，但不能预期在多重引发的RCA期间有相似的效率提高。测定条件。-12. 5 ill缓冲液B中的孵育混合物如所提供含有IOfg质粒DNA(4. 2kpb)。为了使所提供的DNA变性，将样品在95°C孵育3分钟，然后在冰中冷却5分钟。通过加入50nM天然或嵌合4>29DNA聚合酶来起始反应。在30°C孵育所示时间后,通过将样品在65°C孵育10分钟来终止反应。用EcoRI消化I ii I的每种反应物，然后通过在0. 7%琼脂糖凝胶中电泳来分析。电泳后通过用溴化乙锭染色来检测扩增的DNA。如图9所示，天然0 29DNA聚合酶从反应4小时起产生可检测的扩增产物。嵌合体HAY从4小时起产生可检测的扩增产物，5小时后扩增的总产物量是用天然小29DNA聚合酶获得的2倍。嵌合体HGT产生可与用嵌合体HAY获得的相当量的扩增的DNA ;令人感兴趣的是在较短反应时间(3小时)内获得最大扩增产量。用嵌合体HIAY和HIGT扩增的DNA的最大量与用天然0 29DNA聚合酶获得的相似，但在嵌合体HGT情况下，所述最大产量自反应3小时起获得。在用EcoRI消化4种嵌合体合成的DNA后，超过80%的扩增的DNA产生4. 2kb的dsDNA片段，这表明大部分扩增产物确实由原始质粒的串联重复组成。该结果表明，嵌合DNA聚合酶比天然0 29DNA聚合酶扩增有限量(IOfg)的质粒DNA的能力更强。2. 6通过天然和嵌合小29DNA聚合酶讲行的基因组DNA的多重引发的DNA扩增。除了上述多重引发的RCA技术外，基于小29DNA聚合酶性质与使用随机六聚物弓丨物联合，开发了称为多重置换扩增(MDA)的用于扩增全基因组的方法(Dean等，Proc Natl Acad SciUSA. 2002 ;99 :5261-5266)。基于该方法的 Genomiphi (GE Healthcare)和 R印Ii~G (Qiagen)试剂盒需要最少量为IOng的基因组DNA。为了研究嵌合DNA聚合酶相对于天然小29DNA聚合酶是否改进扩增有限量基因组DNA的能力，进行了枯草芽孢杆菌基因组DNA的MDA。测定条件。-12. 5 U I缓冲液B中的孵育混合物含有IOOfg枯草芽孢杆菌基因组DNA。为了使DNA变性，将样品在95°C孵育3分钟，然后在冰中冷却5分钟。通过加入50nM天然或嵌合0 29DNA聚合酶来起始反应。在30°C孵育所示时间后，通过将样品在65°C孵育10分钟来终止反应。通过在0. 7%琼脂糖凝胶中电泳来分析I ii I的每种反应物。电泳后通过用溴化乙锭染色来检测扩增的DNA。如图10所示，在上述实验条件中，天然小29DNA聚合酶在孵育5小时后产生可检测的扩增产物。嵌合体HAY在此时亦产生扩增产物，但6小时后扩增的总DNA量比用天然小29DNA聚合酶获得的量多得多。亦可观察到，其余嵌合体HGT、HIAY和HIGT在较短测定时间(3小时)内产生明显的扩增产物，此时的总扩增量与用天然4 29DNA聚合酶6小时后观察到的相似(HIAY和HIGT)或多得多(HGT)。这些结果表明，HhH结构域的存在为嵌合DNA聚合酶提供相对于天然0 29DNA聚合酶改进的扩增基因组DNA的能力。2. 7嵌合DNA聚合酶准确度的测暈在17 ii I 限制混合物(2 ii I New England Biolabs (NEB) IOX EcoRI 缓冲液、0. 5 ill [10个单位]NEB EcoRI核酸内切酶和14. 5 ill H2O)存在下，孵育对应于多重滚环式扩增IOfg质粒DNA的来自图9中所示实验的3 u I每种样品，以获得扩增质粒的线性单体。在37 °C孵育I小时后，通过Qiagen凝胶-提取试剂盒柱纯化DNA，并在30 TE缓冲液(IOmM (pH 7. 5) tris-HCl、ImM EDTA)中洗脱。通过将其与 2 yl NEB IOX 连接酶缓冲液、8 ylH2O和0. 5 ill (200个单位)NEB T4DNA连接酶孵育，再次连接10 U I的每种洗脱液。在16 °C将反应物孵育一夜，用2 ii I每种反应物转化大肠杆菌XL-IBlue感受态细胞。用每种扩增样品获得大约1000株转化体，而用含有以与上述各样品相似的方式处理的IOfg 4. 2kpb质粒的对照样品未获得转化体。从各转化中选择两个克隆，按照标准方法纯化相应质粒并测序。用于测序的寡核苷酸为pT7-N(SEQ ID NO :17)、sp4+10(SEQ ID NO :18) sp 10+7 (SEQ IDNO 19)。合计对由天然和嵌合DNA聚合酶扩增的每种质粒的4918个非重叠的核苷酸进行了测序。结果示于表I中，其表明嵌合DNA聚合酶与天然酶相似的合成准确度。表I.天然和嵌合29DNA聚合酶的聚合准确度
权利要求
1.一种DNA聚合酶嵌合体，所述嵌合体包含 a)通过其C-末端与b)结合的编码029型DNA聚合酶的氨基酸序列； b)通过其C-末端与c)结合的连接氨基酸序列； c)含有至少一个螺旋-发夹-螺旋(HhH)结构域的氨基酸序列。
2.权利要求I的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(c)的氨基酸序列包含选自以下的蛋白质的至少一个HhH结构域 -坎德勒氏甲烷嗜热菌的拓扑异构酶V ； -大肠杆菌的 MutY、Nth、MutM/Fpg、Nei、UvrC、DinP、RecR、UmuC> DnaE 或 DnIJ ； -酵母的 RADI、RAD2、RADIO、RAD27、RAD 55、RAD 57、REV1、OGGI、NTG1、NTG2、DIN-7 或EXO-I ;或 -枯草芽孢杆菌、秀丽隐杆线虫、流感嗜血杆菌、詹氏甲烷球菌、藤黄微球菌、热甲酸甲烷杆菌或鼠伤寒沙门氏菌中的上述蛋白质的同源蛋白质。
3.权利要求2的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(c)的氨基酸序列包含源自坎德勒氏甲烷嗜热菌的拓扑异构酶V的至少一个HhH结构域。
4.权利要求3的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(c)的氨基酸序列为SEQID NO :3。
5.权利要求3的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(c)的氨基酸序列为通过其C-末端与SEQ ID NO 4 结合的 SEQ ID NO :3。
6.权利要求1-5中任一项的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(b)的连接氨基酸序列为SEQID NO 5 或 SEQ ID NO :6。
7.权利要求1-6中任一项的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的￠29型DNA聚合酶选自分离自以下噬菌体的DNA聚合酶小29、Cp-1、PRD-1、小15、小21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、GA-I、SF5、Cp_5、Cp_7、PR4、PR5、PR722、L17 或 ABV。
8.权利要求1-7中任一项的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的￠29型DNA聚合酶具有与SEQ ID NO :1具有至少80%同一性的氨基酸序列。
9.权利要求8的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的小29型DNA聚合酶具有与SEQIDNO 1具有至少90%同一性的氨基酸序列。
10.权利要求9的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的小29型DNA聚合酶具有氨基酸序列 SEQ ID NO :1。
11.权利要求1-10中任一项的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的￠29型DNA聚合酶在核酸外切酶结构域中具有修饰，其中所述经修饰的DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于10%的核酸外切酶活性。
12.权利要求11的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的经修饰的￠29型DNA聚合酶与相应的天然存在的DNA聚合酶相比具有小于1%的核酸外切酶活性。
13.权利要求12的DNA聚合酶嵌合体，其中所述(a)的经修饰的￠29型DNA聚合酶相对于相应的天然存在的DNA聚合酶缺乏可检测的核酸外切酶活性。
14.权利要求1-13中任一项的DNA聚合酶嵌合体用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的用途。
15.用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的方法，所述方法包括使所述DNA与包含至少以下的反应混合物接触a)权利要求1-12中任一项的DNA聚合酶嵌合体； b)缓冲液； c)氯化镁； d)引物；和 e)核苷三磷酸。
16.权利要求15的方法，其中所述反应混合物还包含聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦。
17.权利要求15或16的方法，其中所述反应混合物还包含铵盐。
18.权利要求15-17中任一项的方法，其中所述反应混合物还包含钾盐。
19.权利要求18的方法，其中所述钾盐为氯化钾或乙酸钾。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 003% -0. 1%。
21.权利要求20的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 006% -0. 05%。
22.权利要求21的方法，其中所述聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦的比例为总反应体积的0. 01% -0. 03%。
23.权利要求17-22中任一项的方法，其中所述铵盐选自硫酸铵、氯化铵或乙酸铵。
24.权利要求23的方法，其中所述铵盐为硫酸铵。
25.权利要求24的方法，其中所述硫酸铵的浓度为30mM-60mM。
26.权利要求25的方法，其中所述硫酸铵的浓度为40mM-50mM。
27.权利要求23的方法，其中所述铵盐为氯化铵或乙酸铵。
28.权利要求27的方法，其中所述氯化铵或乙酸铵的浓度为60mM-120mM。
29.权利要求28的方法，其中所述氯化铵或乙酸铵的浓度为80mM-100mM。
30.权利要求15-29中任一项的方法，其中所述缓冲液为tris-盐酸、tris-乙酸或HEPES。
31.权利要求15-30中任一项的方法，其中所述缓冲液的pH为7.0-8. 5。
32.权利要求15-31中任一项的方法，其中所述氯化镁的浓度为2mM-20mM。
33.权利要求32的方法，其中所述氯化镁的浓度为5mM-15mM。
34.权利要求18-33中任一项的方法，其中所述氯化钾或乙酸钾的浓度为30mM-70mM。
35.权利要求34的方法，其中所述氯化钾或乙酸钾的浓度为40mM-60mM。
36.权利要求15-35中任一项的方法，其中所述核苷三磷酸为dCTP、dGTP、dTTP和dATPo
37.权利要求36的方法，其中所述dCTP、dGTP、dTTP和dATP核苷三磷酸为等摩尔量。
38.权利要求15-37中任一项的方法，其中所述引物为随意的，并受到保护免受核酸外切酶的作用。
39.权利要求15-38中任一项的方法，其中所述模板DNA为质粒DNA。
40.权利要求15-38中任一项的方法，其中所述模板DNA为基因组DNA。
41.权利要求15-40中任一项的方法，其中所述扩增在25-40°C的基本上恒温下进行。
42.权利要求15-40中任一项的用于扩增模板DNA的方法，其中所述扩增通过滚环式扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)、链置换扩增(SDA)或环介导扩增(LAMPA)进行。
43.权利要求15-42中任一项的方法,其中至少一种核苷三磷酸或一种引物被标记。
44.用于实施权利要求15-43的方法的试剂盒，所述试剂盒包括a)权利要求1-13中任一项的DNA聚合酶嵌合体；b)缓冲液；和c)氯化镁。
45.权利要求44的试剂盒，所述试剂盒还包括聚氧乙烯化单月桂酸山梨坦。
46.权利要求44或45的试剂盒，所述试剂盒还包括铵盐。
47.权利要求44-46中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包括钾盐。
48.权利要求44或47的试剂盒，所述试剂盒还包括引物。
49.权利要求44-48中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包括权利要求38的引物。
50.权利要求44-49中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包括核苷三磷酸。
51.权利要求48-50的试剂盒,其中至少一种核苷三磷酸或一种引物被标记。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种DNA聚合酶嵌合体及其用于对模板DNA进行复制、扩增或测序的用途，所述嵌合体包含编码φ29型DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区和含有至少一个HhH结构域的羧基末端(C-末端)区，二者通过连接氨基酸序列结合。同样，本发明提供一种用所述DNA聚合酶嵌合体对脱氧核糖核酸进行复制、扩增或测序的方法和一种用于实施所述方法的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102648275SQ201080039946
公开日2012年8月22日 申请日期2010年7月1日 优先权日2009年7月2日
发明者J·M·拉扎罗博罗斯, L·布兰科达维拉, M·德贝加霍斯, M·萨拉斯法尔盖拉斯, M·门西亚卡瓦列罗 申请人:康斯乔最高科学研究公司