专利名称：用于通过发酵生产生物化学品的突变甲基乙二醛合酶(mgs)的制作方法
技术领域：
本发明涉及产生选自乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养微生物，所述微生物经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生，和回收所需的生物化学品，其可进一步纯化，其中微生物表达甲基乙二醛合酶(MGQ酶，所述酶的活性不受正磷酸盐的抑制。本发明还涉及突变的甲基乙二醛合酶(MGS)，其在亲本酶的蛋白序列中包含至少一个由相同位置的不同氨基酸残基替代的氨基酸残基，其中-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50%和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐抑制。
背景技术：
甲基乙二醛合酶(MGS)被发现和鉴定为大肠杆菌中甲基乙二醛旁路中的第一个酶。之后在多种生物体中发现MGS，包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌和酵母(Cooper (1984))。甲基乙二醛旁路可以作为葡萄糖分解代谢过程中将磷酸丙糖转化为丙酮酸的替代途径(Cooper和Anderson (1970)，Cooper (1984))。Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP)途径或糖酵解包括磷酸丙糖3-磷酸甘油醛(G3P)到丙酮酸的转化，而甲基乙二醛旁路由第二个磷酸丙糖，磷酸二羟基丙酮(DHAP)开始，将其通过中间体甲基乙二醛(MG)和乳酸转化为丙酮酸。MGS,首先在大肠杆菌中纯化并表征(Hopper和Cooper (1971和1972))，可催化1摩尔DHAP转化为1摩尔MG和1摩尔正磷酸(Pi)。MGS对DHAP是非常特异性的，DHAP似乎是该酶以良好亲和力接受的唯一底物(亲和力常数Km在0. 2-0. 47mM变化)。鉴定了该酶的几种抑制剂磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)、3_磷酸甘油酸、Pi和焦磷酸(PPi)。近来在大肠杆菌中编码MGS的基因(yccG，后来重命名为mgsA)的鉴定使克隆和过表达mgsA基因之后重组MGS的生产和表征更容易(T0temeyer等(1998))。提出了酶的精细表征Gaadat和Harrison (1998))，并且进一步研究了最有力的抑制剂Pi的抑制Pi作为酶的变构抑制剂，表示存在磷酸盐的情况下，进行酶反应需要更大量的DHAP (也可参见实施例2中给出的来自大肠杆菌的天然MGS的表征)。表征了几种MGS突变体(在位置D20、D71、D91、DlO和H98上)，所述突变通常会降低酶的催化速率，并提出了催化机制(Saadat和Harrison (1998)，Marks等(2004))。在酶结晶后确定来自大肠杆菌的MGS的三维结构(Saadat和Harrison (1999和2000))。MGS是具有6个相同17kDa单元的均六聚体。磷酸盐能结合MGS的活性位点，并且提出了通过单体之间盐桥传送变构信息的假设，尽管没有给出明确的证据。几种目的产物，乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的产生，可以由不同碳底物(葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油)经由甲基乙二醛旁路，特别是通过MGS的分解代谢而进行。已经研究了细菌中甲基乙二醛分解代谢的途径(Ferguson等，1998)，以理解这个化合物的解毒，还用于1，2_丙二醇的产生。已在大肠杆菌中鉴定了三个能导致从甲基乙二醛产生乳酸的途径-第一个是依赖谷胱甘肽的乙二醛酶I-II系统(由gloA和gloB基因编码)，所述系统可以将甲基乙二醛在两个步骤中转化为D-乳酸(Cooper，1984)。-第二个是不依赖谷胱甘肽的乙二醛酶III酶，其催化将甲基乙二醛在一个步骤中转化为D-乳酸(Misra等，1995)。-第三个系统是通过甲基乙二醛还原酶降解甲基乙二醛，得到丙酮醇或者D-或L-乳醛(Cameron等，1998,Bennett和San，2001)。L-乳醛可进一步通过醛脱氢酶的作用，例如通过由aldA或aldB基因编码的酶的作用转化成L-乳酸(Grabar等，2006)。由三个系统之一产生的乳酸可进一步通过D-或L-乳酸脱氢酶转化成丙酮酸。这些酶，与发酵的乳酸脱氢酶相反，是连接黄素的膜结合蛋白，其只在需氧条件下活化(Garvie,1980)o D-和L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中分别由did和IldD (或IctD)基因编码(Rule 等，1985，Dong 等，1993)。第三个系统产生的丙酮醇或乳醛可以通过几种酶活性，特别是大肠杆菌中的甘油脱氢酶(由gldA基因编码)或1，2-丙二醇氧化还原酶(由fucO基因编码)转化为1，2-丙二醇(Altaras 禾口 Cameron, 2000)。1,2-丙二醇或丙二醇，一种C3 二醇，是广泛使用的化学品。它是不饱和聚酯树脂、液体清洁剂、冷却剂、防冻剂和航空器除冰流体的组分。自1993-1994年以来，由于用作乙烯衍生物的替代物，丙二醇的使用日益增加，因为认识到乙烯衍生物比丙烯衍生物的毒性更大。1，2_丙二醇目前通过化学途径使用氧化丙烯水合过程产生，该过程消耗大量水。氧化丙烯可通过两个过程的任一产生，一个使用表氯醇，另一个使用氢过氧化物。两个途径都使用高毒性物质，此外，氢过氧化物途径生成副产物如叔丁醇和1-苯基乙醇。为了经济地产生丙烯，必须为这些副产物找到用途。化学途径通常产生外消旋1，2-丙二醇，而两个立体异构体(R)l，2-丙二醇和(S) 1，2-丙二醇各自是某些应用(例如专用化学品和药物产品的手性起始材料)中感兴趣的。丙酮醇或羟基丙酮(1-羟基-2-丙酮)是C3酮醇。这个产物在纺织业的瓮染过程中用作还原剂。它能有利地替代传统的含硫还原剂，从而降低危害环境的废水中的硫含量。丙酮醇也是化学工业的起始材料，例如用于产生多元醇或杂环分子。它还具备引人关注的螯合和溶剂性质。丙酮醇目前主要通过1，2_丙二醇的催化氧化或脱氢而产生。现在提出了由可再生物料开始的新过程(参见DE4U8692和WO 2005/095536)。目前，化学过程产生丙酮醇的成本削弱了其工业应用和市场。用于产生1，2_丙二醇和丙酮醇的化学过程的劣势使生物合成成为具备吸引力的替代方法。MGS是从中央代谢开始产生这两个化合物所必经的第一步。已披露了使用不同的微生物，楔形梭菌(Clostridium sphenoides) (DE3336051)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) (W0 2004/087936)、重组酵母(W099/28481)或重组大肠杆菌(E. coli) (W098/37204)产生1，2-丙二醇或丙酮醇的过程。也已经披露了产生1，2-丙二醇或丙酮醇的替代方法(W0 2005/073364、W02008/116852、WO 2008/116848、WO 2008/116849、WO2008/116851)。
乳酸或乳酸盐及其衍生物在食品、药物、皮革和纺织业中有广泛的应用。近来，聚乳酸(PLA)已经开发为可再生、生物可降解和环境友好的塑料，因此，预期对乳酸盐的需求将增加。可以通过化学合成或生物过程产生乳酸盐。然而，只有生物过程能产生所需的立体异构体，具有高光学纯度的D-或L-乳酸盐，这是对于其很多终端用途而言很重要的特性。PLA的物理性质和生物降解速率可以通过操纵手性底物，D-和L-乳酸盐的比例而控制。因此，生产光学纯D-和L-乳酸盐的生物过程的可用性是高质量聚合物合成的先决条件。乳酸细菌是乳酸的天然生产者，并且发现其中对D-或L-形式是特异性的。这些细菌传统上已用于产生乳酸作为专用化学品(例如在US2004/0005677中)。然而，随着乳酸开始作为PLA合成的日用化学品，需要更有效和更经济的过程。研究了能在矿物盐培养基上生长和使用多种不同糖底物的替代生物催化剂。酵母和大肠杆菌将这些特性与多种遗传工具对于代谢工程的可用性组合。已经在WO 0310220UW0 03102152和US2005/0112737 (酵母菌株)和EP 1760156和WO 2005/033324 (大肠杆菌菌株)中描述了这些催化剂用于产生乳酸的用途。微生物中这些D-或L-乳酸的生产过程依赖于由NADH-依赖性乳酸脱氢酶通过糖的分解作用将丙酮酸还原(通常在厌氧条件下)。具有上述MG降解的三个途径的甲基乙二醛旁路能作为乳酸生产的可替代的非发酵途径，如PCT/EP2009/053093所述。根据Pi对MGS的变构抑制，酶有活性所需的条件是高浓度的底物DHAP或低浓度Pi。当环境中Pi有限时，缺少其底物之一，G3P脱氢酶不能继续作用，因此将积累G3P以至于DHAP，满足MGS有效作用的两个条件。在这些条件下，甲基乙二醛旁路将替代磷酸丙糖分解代谢的糖酵解。当Pi丰富时，因为Pi的浓度过高而DHAP的浓度过低以使MGS不能成为有活性的，所以糖酵解将运行(C00per(1984)，Fergusson等(1998))。这个机制使微生物可应对关于Pi的不同状况。然而，考虑到甲基乙二醛旁路中代谢物的产生，当这些分子是代谢的终产物时，两条平行途径，糖酵解和甲基乙二醛旁路将一起作用；糖酵解确保为生长供应前体和能量，而甲基乙二醛旁路用于合成所需的产物。在这种情况下，不受磷酸盐抑制的MGS酶会是明显的优势。本发明人鉴定了不受磷酸盐的变构抑制的新突变MGS，同时保持其将DHAP转化为MG的大部分特异活性，如实施例2中通过表征纯化的酶所证明的。这些突变体的用途是设计用于产生甲基乙二醛旁路的产物，特别是丙酮醇、1，2_丙二醇和乳酸的更有效的过程中的关键要素。发明简述本发明涉及产生选自乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括在合适的培养基中培养微生物，所述微生物经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生，和回收所需的生物化学品，其可进一步纯化，其中所述微生物表达活性不受正磷酸盐抑制的甲基乙二醛合酶(MGQ酶。本发明涉及突变甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶的蛋白序列中包含至少一个由相同位置的不同氨基酸残基取代的氨基酸残基，其中-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50%和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐抑制。本发明还涉及包含编码本发明的突变MGS的序列的DNA序列，和表达这种活性不受正磷酸盐抑制的MGS的微生物，特别是包含编码本发明突变MGS的基因的微生物。
发明详述在本申请中，除非特别指出，否则使用的术语均具有它们通常的意义。微生物“微生物”指所有种类的单细胞生物，包括原核生物如细菌，和真核生物如酵母。优先地，微生物选自下组细菌、酵母和真菌，更优先地选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽抱杆菌禾斗(Bacillaceae)、链毒菌禾斗(Streptomycetaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)和棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)。更优先地，微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pmtoea)、沙门氏菌属(Salmonela)、芽抱杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、梭菌属(Clostridium)或棒状杆菌属(Corynebacterium)的菌种。甚至更优先地，微生物选自下组大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum)、模形梭菌(Clostridiumsphenoides)或酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。如本文所使用的，术语“修饰的微生物”或“修饰的”或“重组的”指具有其基因组的修饰的宿主细胞，例如，通过添加不天然存在于生物体中的核酸，或者通过对天然存在于宿主细胞中的核酸进行修饰来进行。“经过修饰而改进选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的生物化学品的产生的微生物”是其中通过转化简单碳源而将有利于生产所需的生物化学品的途径已经过修饰的微生物。经过修饰而改进生产的微生物产生的所需的生物化学品比天然的、未修饰的微生物多。图2表示用本发明的微生物生产乳酸、丙酮醇和丙二醇的优选生物合成途径。本领域的技术人员可以鉴定与待促进的途径相关的酶活性和待削弱的其它酶活性。在Cameron 等，1998，Bennett 和 San，2001，Ko 等，2005 和 WO 99/28481，WO98/37204， WO 2005/073364， WO 2008/116852， WO 2008/116848， W02008/116849, WO2008/116851，PCT/EP2009/053093 (其内容通过提述并入本文)中也披露了经过修饰而改进通过转化甲基乙二醇生产乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的微生物。在酵母的情况中，宿主生物体的下述修饰是优选的 削弱下述基因中至少一个的表达TPI1、NDEU NDE2、GUT2、GPDU GPD2、PDCUPDC2、PDC5、PDC6、GL01 增强GRE3基因的表达。在本发明的微生物中，编码本发明突变MGS的DNA序列可以引入载体，用于突变MGS的表达和翻译。也可以将其整合入所述微生物的染色体。DNA序列的整合可以完整地，或者简单地通过在微生物的天然基因中引入编码序列中的突变而进行，即，由编码突变蛋白的氨基酸的核苷酸取代编码待改变的氨基酸的核苷酸。微生物基因中的全部、部分或特定核苷酸取代是遗传工程领域中熟知的，包括Sambrook J等，Molecular cloning :a laboratory manual,Cold Spring Harbour Press，New York(2001)，Ausubel FM 等，Current protocols in molecular biology,John Wiley禾口sons，New York(1999)，Adams A等，Methods in yeast genetics，Cold Spring HarbourPress，New York(1997)。
本发明的微生物可以额外地包含编码YqhD酶的基因，所述酶可增加对于NADPH的
催化效率。“可增加对于NADPH的催化效率”的YqhD酶指微生物中表达的YqhD酶对于NADPH的催化效率高于相同微生物的天然YqhD酶的对于NADPH的催化效率。催化效率定义为催化常数(Kcat)和米氏常数(Michaelis constant) (Km)之间的比例。YqhD酶催化效率的增加表示酶的Kcat增加或酶的Km减少。在一个优选的实施方案中，YqhD酶的Kcat增加而且YqhD酶的Km减少。优选地，YqhD酶的对于NADPH的催化效率高于大肠杆菌的天然YqhD酶的效率。这种酶优选地具有大肠杆菌的YqhD活性的至少50 %，更优选大肠杆菌YqhD活性的至少60%的酶活性。特别地，YqhD酶是突变YqhDS酶，其中-突变酶保留亲本酶YqhD活性的多于50%和-与亲本酶对于NADPH的催化效率相比，突变YqhD对于NADPH的催化效率增加。优选地，突变YqhD包含选自下组的至少一个突变G149E、G149S和A286T，和它们的组合。参照大肠杆菌的YqhD序列给出氨基酸位置。本领域的技术人员通过序列比对的标准技术可以在来自其它生物体的序列中找到相应的氨基酸。本发明的微生物可以额外地包含编码甘油脱氢酶(GlyDH)酶的基因，所述酶具有NAD+和/或其底物和/或其产物对其活性的抑制下降。"NAD+和/或其底物和/或其产物对其活性的抑制下降”指微生物中表达的GlyDH酶活性的抑制低于相同微生物的天然GlyDH酶活性的抑制。GlyDH酶活性的抑制可以通过抑制浓度50(IC50)或抑制常数(Ki)或技术人员已知的任何其它技术定义。GlyDH酶活性抑制下降指本发明的GlyDH酶的IC50或Ki高于天然GlyDH酶的IC50或Ki。技术人员知晓IC50和Ki之间的关系，以及它们在传统的Michaelis-Menten动力学中对于酶活性的意义。优选地，GlyDH酶活性的抑制低于大肠杆菌的天然GlyDH酶活性的抑制。在一个优选的实施方案中，由NAD+、酶底物和酶产物组成的组中至少两个成员对于酶活性的抑制下降。更优选地，NAD+、其底物和其产物三者对酶活性的抑制下降。酶“底物”是二羟基丙酮、羟基丙酮、甲基乙二醛、乳醛、甘油醛、乙二醇醛(glycolaldehyde)和它们的衍生物。酶“产物”是由所选底物通过羰官能还原而获得的分子。对于1，2_丙二醇的产生，底物是羟基丙酮，而产物是1，2_丙二醇。特别地，GlyDH酶是突变酶，其中-突变酶保留亲本酶活性的多于50%和-与亲本酶相比，NAD+和/或其底物和/或其产物对突变GlyDH的甘油脱氢酶活性的抑制下降。优选地，突变GlyDH优选包含选自下组的至少一个突变A160T，T120N和它们的组合。参照大肠杆菌的GldA序列给出氨基酸位置。本领域技术人员可以通过序列比对的标准技术在来自其它生物体的序列中找到相应的氨基酸。甲基乙二醛合酶(MGS)酶
本发明涉及其活性不受正磷酸盐抑制的甲基乙二醛合酶(MGS)，包含所述酶的微生物和用于通过在含简单碳源的培养基上发酵所述微生物而产生所需的生物化学品的方法。“不受正磷酸盐抑制”或“无正磷酸盐的抑制”指在存在正磷酸盐的情况下研究酶活性时，在活性测定法中鉴定无正磷酸盐的抑制。这种活性测定法是本领域中熟知的并且能如实施例2所披露的进行。此外，无论是否存在正磷酸盐，本发明MGS酶的动力学都遵从Michaelis-Menten动力学。天然酶的动力学仅在不存在正磷酸盐的情况下遵循Michaelis-Menten模型。正磷酸盐的存在使天然酶的动力学曲线(比活性对底物浓度)成S形(sigmoidal)，表明正磷酸盐的变构抑制。这种酶优选地具有大肠杆菌甲基乙二醛合酶活性的至少50%的甲基乙二醛合酶活性。可通过本领域技术人员已知的多种方法获得酶。第一种方法包括筛选各种生物体不受正磷酸盐抑制的天然酶。第二种方法包括诱导已知生物体的酶中的突变并选择不受正磷酸盐抑制的酶。可以通过本领域已知的方法诱导突变，如对微生物进行诱变剂处理。另一种诱导突变的方法是在选择压力下(以高水平正磷酸盐)生长微生物，鉴定在这种条件下生长的微生物，并选择获得的不受正磷酸盐抑制的酶。本领域还已知其它方法以通过将各种来源的DNA重排并基于它们的甲基乙二醛合酶活性和它们不受正磷酸盐抑制的酶选择由如此获得重排的DNA编码的蛋白。在本发明一个特定的实施方案中，本发明人通过如WO 2005/073364披露的和实施例1中所示，选择在选择压力下培养的经过修饰而改进乳酸、丙酮醇和/或1，2_丙二醇产生的菌株，从而获得保留其甲基乙二醛合酶活性且不受正磷酸盐抑制的几种突变体MGS。本发明特别涉及突变甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶蛋白序列中包含至少一个在相同位置用不同氨基酸残基取代的氨基酸残基，其中-突变酶保留亲本酶活性的多于50%和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐的抑制。“突变(体)”指人为将突变引入蛋白序列。根据本发明，突变酶是与亲本酶相比包含至少一个氨基酸差异的酶。在本发明的突变酶中，可以通过直接诱变或随机诱变在氨基酸中引入任何变化，也可以使用嵌合酶，其包含替代了亲本酶的相应部分另一个酶的部分。“亲本酶”是突变之前的酶。亲本酶可以是任何来源的，天然的、自另一种生物体分离的或合成的。用于确定突变MGS保留“多于50%”的方法是本领域中公知的并且在实施例2中披露。事实上，技术人员可以根据突变MGS的最终用途选择所需活性的水平。事实上，当需要高活性时，技术人员可选择与未突变亲本酶相比具有多于80%活性，更优选多于90%活性的突变体。在其它情况下，选择与亲本酶相比具有大约50%和多于50%的突变MGS可防止微生物中的额外修饰，像修饰启动子以降低酶的表达水平。本发明人发现在包含多至3mM正磷酸盐的培养基中，在相应亲本酶受到抑制时，突变酶的酶活性不受正磷酸盐的抑制。选择正磷酸盐的量，只要酶反应通常在微生物中发生即可。根据本发明，“与亲本MGS相比不受正磷酸盐的抑制”应理解为在与在培养基上生长的微生物中正磷酸盐浓度相容的正磷酸盐浓度，所述培养基以与微生物生长相容的浓度包含正磷酸盐。在一个优选的实施方案中，本发明的突变MGS在天然亲本MGS中包含鉴定区的至少一个在相同位置由不同氨基酸残基取代的氨基酸残基。本发明人已经鉴定了突变体，其中天然亲本MGS中下述保守区(CR)之一的至少一个氨基酸残基在相同位置由不同氨基酸残基取代，三个保守区CR1、CR2和CR3鉴定如下-Xal-Leu-Xa2-Xa3-His-Asp-Xa4-Xa5-Lys-(CRl)其中Xal 代表 Ala 和 Val，优选 Ala，Xa2 代表 Val 禾Π lie，Xa3 代表 Ala 和 kr，优选 Ala,Xa4 代表 Ala、Arg、Asn、Gin、Glu、His、Lys、Met 和 kr，优选 His 和 Lys，和Xa5 代表 Arg、Cys, Gin、Lys、Met 和 Tyr，优选 Cys 和 Lys-Asp-Xa6-Xa7-Xa8-Xa9-X10-Xll-His-X12-X13-Asp-X14-(CR2)其中Xa6 代表 Asp 和 Pro，优选 Pro，Xa7 代表 Leu 和 Met，优选 Leu，Xa8 代表 Asn、Glu、Ser 和 Thr，优选 Asn 和 Thr,Xa9 代表 Ala、Asn、Pro, Ser 和 Val，优选 Ala，XlO 代表 Ala、Leu、Gin、Lys、Met 和 Val，优选 Gln 和 Val，Xll 代表 Ala 和 Pro，优选 Pro，X12 代表 Asp 和 Glu,X13 代表 Ala、Pro 和 Val，优选 Pro，和X14 代表 Ile 和 Val，优选 Val-X15-X16-X17-X18-Pro-X19-X20-X21-X22-(CR3)其中X15 代表 Ile、Leu*Val，iftitVal，X16 代表 Arg、Gin、His、Trp 和 Tyr，优选 Trp 和 Tyr，X17 代表 Ala、Asn、Arg、Asp、Gin、Glu、Gly、Lys 和 kr，优选 Asn，X18 代表 lie、Leu 和 Val，优选 lie,X19 代表 Cys、His、lie、Leu、Met 和 Val，优选 Leu 和 Val，X20 代表 Ala 和 Val，优选 Ala，X21 代表 Cys、lie、Leu、Met 和 Thr，优选 Thr，和X22 代表 Asn 和 Thr，优选 Asn。使用标准序列比对工具如ClustalW2、Kal ign、MAFFT、MUSCLE 或 T_cof f ee (全部可在网站http://www. ebi.ac.uk/上获得)通过简单的序列比对可在不同MGS酶中鉴定这些保守区。
图1中给出了不同种的几个MGS的序列比对。参照大肠杆菌的蛋白给出本申请中的氨基酸编号。在图1中可以发现CRl对应于大肠杆菌MGS的氨基酸15_23，CR2对应于大肠杆菌MGS的氨基酸91-102，而CR3对应于大肠杆菌MGS的氨基酸111-119。根据本发明，突变MGS在CRl、CR2或CR3之一中具有至少一个突变。它可以在CRl禾口 CR2中，CRl禾PCR3中，或CR2和CR3中具有至少两个突变。它也可以在CR1、CR2和CR3
中具有至少三个突变。在上下文中，“至少”表示突变的酶可以有其它突变，但不与鉴定的保守区CR1、CR2和CR3相关。这些其它非鉴定的突变对本发明的突变酶没有实质影响，只要-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50%和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐抑制。在优选的实施方案中，由突变MGS中相同位置的不同氨基酸残基取代的亲本MGS中保守区CRl至CR3中的氨基酸残基选自下组CR1中的氨基酸)(a4、CR2中的氨基酸)(a9和 CR3 中的氨基酸 X19 和它们的组合(CR1&CR2、CR1&CR3、CR2&CR3 和 CR1&CR2&CR3)。Xa4对应于大肠杆菌MGS序列中的氨基酸21。Xa9对应于大肠杆菌MGS序列中的氨基酸95。X19对应于大肠杆菌序列中的氨基酸116。特别地，本发明的突变MGS包含选自下组的至少一个突变H21Q、A95V、V116L，和它们的组合，参照大肠杆菌的MGS序列给出氨基酸位置。更优选地，本发明的突变MGS在保守区CRl至CR3中包含下述氨基酸序列中的至少一个-CRl :Ala Leu Val Ala His Asp Gln Cys Lys-CR2 :Asp Pro Leu Asn Val Pro His Asp Pro Asp Val-CR3 :Val Trp Asn lie Pro LeuAla Thr Asn用粗体和下划线标出的氨基酸残基对应于突变MGS中不同于亲本MGS的氨基酸的
氨基酸。特别地，本发明的突变MGS与大肠杆菌MGS序列相比具有至少50 %的序列同一性，只要其在CRl和/或CR2中包含至少一个下述突变-CRl :Ala Leu Val Ala His Asp Gln Cys Lys-CR2 :Asp Pro Leu Asn Val Pro His Asp Pro Asp Val-CR3 :Val Trp Asn lie Pro LeuAla Thr Asn。使用EBI网站(见上文)可得到的CLUSTALW2，将大肠杆菌的MGS序列与待比较的蛋白序列以默认参数进行序列比对，然后定义序列同一性。然后通过在相同位置同样氨基酸的数目与参照序列(大肠杆菌)中氨基酸的总数的比值，以序列比对计算序列同一性。优选地，突变MGS具有至少70%的序列同一性。在最优选的实施方案中，本发明的突变MGS包含选自下组的序列SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3 中鉴定的 MGS。DNA、载体、基因本发明还涉及包含编码本发明的突变MGS的序列的DNA序列。编码本发明的突变MGS的序列本身不是限定因素。技术人员能够轻易地从微生物获得天然MGS的序列，并通过改变一个或多个合适的核苷酸而在编码序列引入待引入蛋白质中的突变。技术人员还能在微生物序列中进行诱变，并通过标准方法分离突变的DNA序列。通过常用的方法如聚合酶链式反应(PCR，参见Sambrook J等，Molecularcloning :a laboratory manual, Cold Spring Harbour Press, New York(2001), AusubelFM 等，Current protocols in molecular biology,John Wiley 禾口 sons,New York(1999),Adams A等,Methods in yeast genetics,Cold Spring Harbour Press,New York(1997)),或通过随机突变技术，如使用诱变剂(紫外线或化学试剂如亚硝基胍(NTG)或甲烷磺酸乙酯(EMS))或使用PCR技术(DNA重排或易错PCR)，用定点诱变引入突变。本领域的技术人员还能制备合成基因，其具有选择的优选密码子用于在特定生物体中改进的表达。多种生物体的密码子选择是本领域中公知的并且几家公司正在生产密码子优化的合成基因。本发明的序列可以是分离的，由上述编码序列组成，或者在包含编码序列的上游和下游用于其在特定生物体中表达的调节元件的基因中。序列还可存在于载体中，用于其在微生物中复制(复制载体)或用于本发明突变的蛋白质在微生物中的表达和翻译(表达载体)。这种载体是本领域中公知的，并且不是本发明定义的限定因素。 所述基因和载体也是本发明的一部分。优选地，本发明的DNA序列在具有允许本发明的突变MGS的表达和翻译的调节元件的微生物中。乳酸、丙酮醇或1，2-丙二醇的产生本发明还涉及通过发酵生产选自乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括培养本发明的微生物，所述微生物经过修饰而改进乳酸、丙酮醇和/或1，2-丙二醇的产生，和回收所述生物化学品。在一个特定的实施方案中，纯化回收的乳酸和/或丙酮醇和/或1，2_丙二醇。纯化乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇的方法是本领域中公知的，并在Datta和Henry，2006，Wasewar, 2005，US5076896 和 WO 2007/074066 中描述。有利地，根据微生物发酵领域的技术人员已知过程，产生可以通过在分批、补料分批或连续过程中通过发酵进行。优选地，产生通过在补料分批过程中通过发酵而进行。培养基和碳源在本发明的生产方法中，在合适的培养基上培养微生物。“合适的培养基”指适合于微生物生长的已知分子组成的培养基。特别地，所述培养基至少包含磷源和氮源。所述合适的培养基是例如适合于所用细菌的已知设定组成的矿物质培养基，其包含至少一种碳源。所述合适的培养基还可以是包含氮源和/或磷源的任何液体，所述液体加入和/或混合至蔗糖源中。特别地，用于肠杆菌科的矿物质生长培养基的组成因而可与M9培养基(Anderson, 1946)、M63培养基(Miller, 1992)或如khaefer等(1999)所定义的培养基相同或相似。在这个培养基中，碳源“葡萄糖”可以由任何其它碳源代替，特别是由蔗糖或任何含蔗糖碳源如甘蔗汁或糖甜菜汁代替。“碳源”或“碳底物”指任何能由微生物代谢的碳源，其中所述底物包含至少一个碳原子。优选地，碳源选自下组葡萄糖、蔗糖、单糖或寡糖、淀粉或其衍生物或甘油和它们的混合物。事实上本发明方法中使用的微生物可进行修饰以使其能在特定碳源上生长，而未修饰微生物不能在相同的碳源上生长，或以低速率生长。当碳源是生物质降解的副产物如甘蔗副产物(包括来自原汁澄清的滤饼和不同种类的糖蜜)时，这些修饰可为必需的。附图简述图1代表多种来源MGS的36个蛋白序列的比对。序列获得自UniProt KnowledgeBase (The UniProt consortiumQ008))，并且使用 MUSCLE，用默认参数进行比对。图2代表在本发明的微生物中生产乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的代谢途径。图3代表在SDS 4-15%梯度聚丙烯酰胺凝胶上对蛋白mgsA*V116L的不同纯化步骤的分析。泳道1 分子量标志物，泳道2:粗提物，泳道3，第一硫酸铵沉淀的上清，泳道4，第二硫酸铵沉淀的沉淀，泳道5，Resource Q汇集物，泳道6，MonoQ汇集物，泳道7，superdwx200汇集物，泳道8，用BSA的最终汇集物。
实施例实施例1 :3株修饰的大肠杆菌MG1655菌株在恒化培养中的进化和进化克隆中3个突变MGS酶的鉴定菌株大肠杆菌MG1655 lpd*AtpiA，ApflAB, AadhE, IdhA: :Km, Δ gloA, AaldA,AaldB, Aedd(菌株 1)，大肠杆菌 MG1655 lpd* AtpiA, ApflAB, AadhE, Δ IdhA::Cm，AgloA, AaldA, AaldB, Aedd (菌株 2)和大肠杆菌 MG1655 lpd* AtpiA, ApflAB,AadhE, Δ IdhA, Δ gloA, AaldA, AaldB, Δ edd, Δ arcA, Δ ndh: :Km(菌株 3)的构建，对于菌株1先前在专利申请WO 2005/073364中描述，对于菌株2和3在专利申请WO2008/116852 中描述。为了向改进1，2丙二醇生产的方向进化，在连续培养中，或者在厌氧条件下，或者在微氧条件下(1%氧)，在含0.42或0.84g/l硝酸钠，及过量葡萄糖(如果葡萄糖耗尽则起初添加20g/l)的培养基MPG(在专利申请W02008/116852中给出)中培养这3株菌株。温度设为37°C，通过加入碱将pH调为6. 5，并将恒化器的稀释率设为0. 04-0. OStT1。在恒化器中进化菌株后，在几周中，生物质浓度增加，其与产物1，2_丙二醇和副产物乙酸的增加偶联。这表示菌株性能的改进。当培养到达稳态，而在这些条件下浓度不再进一步增加时，进化完成。评价进化前后的菌株特性。在培养皿上分离代表个体克隆的单菌落。使用初始菌株作为对照，使用与恒化培养所用相同的培养基MPG但用MOPS缓冲，在锥形瓶试验中评价这些克隆。在这些克隆中，与对照相比，几株表现出更好的1，2_丙二醇比生产速率(specific production rate)。在每种进化条件下对最佳克隆获得的结果报道于下面的表1-3 中。^ ι 在厌氧,κ牛下讲化 81 iifsm^M^M^mmmmm
权利要求
1.用于产生选自乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的生物化学品的方法，所述方法包括-在合适的培养基中培养微生物，所述微生物经过修饰而改进所述选自乳酸、丙酮醇和1，2_丙二醇的生物化学品的产生，和-回收所需的生物化学品其中所述微生物表达甲基乙二醛合酶(MGQ酶，其活性不受正磷酸盐抑制。
2.根据权利要求1的方法，其中所述活性不受正磷酸盐抑制的甲基乙二醛合酶(MGS)酶是突变甲基乙二醛合酶(MGS)，其在亲本酶的蛋白序列中包含至少一个由相同位置的不同氨基酸残基替代的氨基酸残基，其中-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50%和-突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐抑制。
3.根据权利要求2的方法，其中突变MGS在未突变(亲本)MGS酶的下述保守区1-3 (CR1-CR3)之一中包含至少一个突变-Xal-Leu-Xa2-Xa3-His-Asp-Xa4-Xa5-Lys-(CRl)其中Xal代表Ala和Val，优选Ala，Xa2 代表 Val 禾Π Ile，Xa3代表Ala和kr，优选Ala，Xa4 代表 Ala、Arg, Asn、Gin、Glu、His、Lys、Met 和 kr，优选 His 和 Lys，和Xa5 代表 Arg、Cys、Gln、Lys、Met 和 Tyr，优选 Cys 和 Lys-Asp-Xa6-Xa7-Xa8-Xa9-X10-Xll-His-X12-X13-Asp-X14-(CR2)其中Xa6代表Asp和Pro，优选Pro，Xa7代表Leu和Met，优选Leu，Xa8 代表 Asn、Glu、Ser 和 Thr，优选 Asn 和 Thr，Xa9 代表 Ala、Asn、Pro、Ser 和 Val，优选 Ala,XlO 代表 Ala、Leu、Gin、Lys、Met 和 Val，优选 Gln 和 Val，Xll代表Ala和ftx)，优选ftx)，X12 代表 Asp 和 Glu,X13代表Ala、Pro和Val，优选Pro，和X14代表Ile和Val，优选Val-X15-X16-X17-X18-Pro-X19-X20-X21-X22-(CR3)其中X15 代表 lie、Leu 和 Val，优选 Val,X16 代表 Arg、Gin、His、Trp 和 Tyr,优选 Trp 和 Tyr,X17 代表 Ala、Asn、Arg、Asp、Gin、Glu、Gly、Lys 和 kr，优选 Asn,X18 代表 lie、Leu 和 Val，优选 lie,X19 代表 Cys、His、lie、Leu、Met 和 Val，优选 Leu 和 Val,X20代表Ala和Val，优选Ala,X21 代表 Cys、lie、Leu、Met 和 Thr，优选 ThrJPX22代表Asn和Thr，优选Asn。其中上述保守区1-3中的至少一个氨基酸残基由相同位置的不同氨基酸残基替代，保守区1-3中在相同位置由不同氨基酸残基替代的所述氨基酸残基选自下组-CRl中的氨基酸)(a4，-CR2中的氨基酸)(a9，-CR3中的氨基酸X19和-它们的组合，而且其中所述突变酶的活性不受正磷酸盐抑制。
4.根据权利要求3的方法，其中突变MGS在保守区CR1-CR3中包含至少一个下述氨基酸序列-CRl :Ala Leu Val Ala His Asp Gln Cys Lys-CR2 :Asp Pro Leu Asn Val Pro His Asp Pro Asp Val-CR3 :Val Trp Asn lie Pro Leu Ala Thr Asn用粗体和下划线标注的氨基酸残基对应于突变MGS中与亲本MGS中的氨基酸不同的氨基酸。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中突变MGS包含选自SEQID NO 1、SEQ IDNO 2和SEQ ID NO 3中所示的MGS的序列。
6.根据权利要求1-5中任一项的用于产生丙酮醇的方法，其中所述微生物另外包含编码突变YqhD的基因。
7.根据权利要求1-5中任一项的用于产生1，2_丙二醇的方法，其中所述微生物另外包含编码突变YqhD的基因和/或编码突变甘油脱氢酶的基因。
8.根据权利要求6或7中任一项的方法，其中所述突变YqhD包含选自下组的至少一个突变G149E、G149S、A286T和它们的组合。
9.根据权利要求7或8中任一项的方法，其中所述突变甘油脱氢酶包含选自下组的至少一个突变A160T、T120N和它们的组合。
10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述微生物选自下组肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、芽抱杆菌禾斗(Bacillaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、链霉菌禾斗(Streptomycetaceae)、棒状杆菌禾斗(Corynebacteriaceae)禾口酵母。
11.根据权利要求10的方法，其中所述微生物选自下组大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharoIyticum)、模形梭菌(Clostridiumsphenoides)或酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
12.根据权利要求1-8的方法，其中所述微生物是大肠杆菌。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中纯化回收的生物化学品。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中所述合适的培养基包括选自下组的碳源葡萄糖、蔗糖、单糖或二糖、淀粉及其衍生物，和它们的混合物。
15.根据权利要求14的方法，其中所述碳源选自葡萄糖和蔗糖。
16.根据权利要求1-15中任一项的方法，其中所述产生在分批、补料分批或连续过程中进行。
17.权利要求2中所定义的突变甲基乙二醛合酶(MGS)酶。
18.突变的甲基乙二醛合酶(MGS)酶，其中所述未突变(亲本)MGS酶包含下述保守区1-3 (CR1-CR3)中的至少一个-Xal-Leu-Xa2-Xa3-His-Asp-Xa4-Xa5-Lys-(CRl)其中Xal代表Ala和Val，优选Ala，Xa2 代表 Val 禾Π Ile，Xa3代表Ala和kr，优选Ala，Xa4 代表 Ala、Arg、Asn、Gin、Glu、His、Lys、Met 和 kr，优选 His 和 Lys，和Xa5 代表 Arg、Cys, Gin、Lys、Met 和 Tyr，优选 Cys 和 Lys-Asp-Xa6-Xa7-Xa8-Xa9-X10-Xll-His-X12-X13-Asp-X14-(CR2)其中Xa6代表Asp和Pro，优选Pro，Xa7代表Leu和Met，优选Leu，Xa8 代表 Asn、Glu、Ser 和 Thr，优选 Asn 和 Thr，Xa9 代表 Ala、Asn、Pro、Ser 和 Val，优选 Ala,XlO 代表 Ala、Leu、Gin、Lys、Met 和 Val，优选 Gln 和 Val，Xll代表Ala和ftx)，优选ftx)，X12 代表 Asp 和 Glu,X13代表Ala、Pro和Val，优选Pro，和X14代表Ile和Val，优选Val-X15-X16-X17-X18-Pro-X19-X20-X21-X22-(CR3)其中X15 代表 lie、Leu 和 Val，优选 Val,X16 代表 Arg、Gin、His、Trp 和 Tyr,优选 Trp 和 Tyr,X17 代表 Ala、Asn、Arg、Asp、Gin、Glu、Gly、Lys 和 kr，优选 Asn,X18 代表 lie、Leu 和 Val，优选 lie,X19 代表 Cys、His、lie、Leu、Met 和 Val，优选 Leu 和 Val,X20代表Ala和Val，优选Ala,X21 代表 Cys、lie、Leu、Met 和 Thr，优选 ThrJPX22代表Asn和Thr，优选Asn其中上述保守区1-3中至少一个氨基酸残基由相同位置的不同氨基酸残基替代，保守区1-3中在相同位置由不同氨基酸残基替代的所述氨基酸残基选自下组-CRl中的氨基酸)(a4，-CR2中的氨基酸)(a9，-CR3中的氨基酸X19和-它们的组合，并且其中所述突变酶的活性不受正磷酸盐的抑制。
19.根据权利要求18的突变MGS，其中所述MGS在保守区CRl至CR3中包含至少一个下述氨基酸序列-CRl :Ala Leu Val Ala His Asp Gln Cys Lys-CR2 :Asp Pro Leu Asn Val Pro His Asp Pro Asp Val-CR3 :Val Trp Asn lie Pro Leu Ala Thr Asn用粗体和下划线标出的氨基酸残基对应于突变MGS中与亲本MGS中的氨基酸不同的氨基酸。
20.根据权利要求18或19中任一项的突变MGS，其中所述MGS包含选自下组序列中所示的 MGS 的蛋白序列SEQ ID NO U SEQ ID NO 2 和 SEQ ID NO 3。
21.DNA序列，所述序列包含编码权利要求17-20中任一项的突变MGS的序列。
22.修饰的微生物，其中所述微生物表达权利要求17-20中任一项的突变甲基乙二醛合酶(MGQ酶。
23.根据权利要求22的修饰的微生物，其中所述微生物经过进一步修饰而改进选自下组的生物化学品的产生乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇。
24.根据权利要求23的用于产生丙酮醇的修饰的微生物，其中所述微生物另外包含编码突变YqhD的基因。
25.根据权利要求23的用于产生1，2_丙二醇的修饰的微生物，其中所述微生物另外包含编码突变YqhD的基因和/或编码突变甘油脱氢酶的基因。
26.根据权利要求M或25中任一项的微生物，其中突变YqhD包含选自下组的至少一个突变G149E、G149S、A^6T和它们的组合。
27.根据权利要求25或沈中任一项的方法，其中所述突变甘油脱氢酶包含选自下组的至少一个突变A160T、T120N和它们的组合。
28.根据权利要求22-27中任一项的微生物，其中所述微生物选自下组肠杆菌科、芽孢杆菌科、梭菌科、链霉菌科、棒状杆菌科和酵母。
29.根据权利要求观的微生物，其中所述微生物选自下组大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、热解糖热厌氧杆菌、楔形梭菌或酿酒酵母。
全文摘要
本发明涉及用于产生生物化学品的方法，所述生物化学品选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇，所述方法包括在适当的培养基中培养经过修饰以改进生物化学品生产的微生物，所述生物化学品选自乳酸、丙酮醇和1，2-丙二醇，并回收所需的生物化学品，所述产品可以进一步纯化，其中所述微生物表达甲基乙二醛合酶(MGS)，其酶活性不受正磷酸盐的抑制。本发明涉及突变的甲基乙二醛合酶(MGS)，所述酶在亲本酶的蛋白序列中至少一个氨基酸残基由相同位置的不同氨基酸残基替代，其中-突变酶保留亲本酶的甲基乙二醛合酶活性的多于50％和-与亲本酶相比，突变MGS的甲基乙二醛合酶活性不受正磷酸盐的抑制。
文档编号C12N9/88GK102575235SQ201080043839
公开日2012年7月11日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月30日
发明者F.沃尔克, L.杜蒙-西格诺弗特, P.索凯勒 申请人:代谢探索者公司