纯化活性gla结构域凝固蛋白的方法

文档序号:392822阅读:380来源:国知局
专利名称:纯化活性gla结构域凝固蛋白的方法
纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法发明名称纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法发明领域本发明涉及蛋白质纯化领域,特别涉及GLA结构域凝固蛋白,甚至更具体地活性的GLA结构域凝固蛋白纯化的领域。
现有技术一般而言,GLA结构域蛋白形成具有共同结构——GLA结构域的蛋白质家族,所述GLA结构域由位于这些蛋白质N末端的区域组成并且包含多个谷氨酰胺残基,所述谷氨酰 胺残基特别被羧化以产生羧基谷氨酸或“GLA”残基。GLA结构域蛋白一般包含被称为前肽的N端部分,该部分被维生素K依赖性的羧化酶识别。在GLA结构域的谷氨酰胺残基羧化后,前肽被蛋白水解切割并释放成熟和活性的GLA结构域蛋白。根据考虑的蛋白质,GLA结构域由约45个氨基酸组成,所述氨基酸包含通常被羧化产生Gla的9至12个谷氨酰胺残基。GLA结构域蛋白由“维生素K依赖性”的蛋白质组成。GLA结构域蛋白涵盖了凝固因子、骨组织蛋白和芋螺肽(conopeptides)。GLA结构域凝固因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA结构域骨组织蛋白涵盖了骨钙蛋白和基质Gla蛋白。GLA结构域芋螺肽涵盖了芋螺毒素(conantokin)G和芋螺毒素T。GLA结构域蛋白还涵盖了其他蛋白质,例如蛋白Z、Gas6、PRGPl和PRGP2。由Furie等人在文章(1999,Blood,卷93 :1798-1808)中特别介绍了 GLA结构域蛋白。维生素K依赖性的GLA结构域凝固蛋白由有治疗性兴趣的蛋白质组成。在所述蛋白质中,因子II、因子VII、因子IX和因子X代表具有极大治疗性兴趣的蛋白质,所述蛋白质被施用于多种内稳态病症的预防和治疗。能够从天然的人体液中(一般是从人血浆中)纯化人GLA结构域凝固蛋白。此外,为了开发生产和纯化重组人GLA结构域凝固蛋白的方法,已进行了大量研究。例如可提及已作为药物销售的重组人因子VII。应理解获得其中的目标凝固因子处于生物学活性形式的纯化制备物具有极大重要性,因为所述凝固因子是用作药物活性成分的物质。应特别提及的是,在体外通过遗传转化的细胞的手段,或者在体内通过转基因动物的手段,而获得以重组蛋白形式生产的GLA结构域凝固因子的纯化制备物,对此而言,选择在人工系统或与人异源的系统中生产的这些重组因子的生物学活性形式是必需的。对于获得从生物液体中纯化的GLA结构域蛋白(其中这些蛋白质是天然或另外以重组蛋白质形式产生的)而言,合适的纯化方法是现有技术中已知的。这些方法一般包括基于蛋白质沉淀和通过层析支持物步骤的一系列的选择性分离步骤,随后是顺序洗脱步骤、深层过滤步骤、超滤,或者其他浓缩步骤。目前用于生产药物的纯化GLA结构域凝固蛋白的方法不包括亲和层析步骤。此类技术选择的ー个原因在于这样的缺陷,所述缺陷是由于移植到亲和支持物上的配体分子一部分脱离造成的,发现所述脱离与层析洗脱物体积中的纯化的治疗性蛋白质相关联。作为示例,可提及产品Mononine ,这是基于纯化的人因子IX的药物组合物,所述人因子IX是通过使用在其上固定小鼠抗fix单克隆抗体的免疫亲和支持物的方法获得的。然而,Mononine 产品的专题文章说明在最终产品中存在痕量的鼠抗人fix单克隆抗体,所述抗体能够在受治疗的患者体内导致免疫原性问题,因为患者变得对“可滤物(Ieachables) ” (鼠抗体和抗体片段)免疫。Mononine 产品的专题文章说明对鼠蛋白质过敏的患者的禁忌症。现有技术中已知,GLA结构域凝固蛋白(包括凝血酶原、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S)的部分或完整的GLA结构域对维持其生物学活性是重要的。因此,现有技术需要用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的改善的或备选的方法。这涵盖了用于获得包含单一纯化的活性蛋白质(例如因子VII或因子IX)的组合物的备选或改善的方法的需求,和用于获得包含活性GLA结构域蛋白的组合的组合物(例如包含活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X的组合的组合物)的备选的或改善的方法的需求。这涵盖了用于纯化非重组的活性GLA结构域蛋白或重组的活性GLA结构域蛋 白的备选或改善的方法的需求。发明概述本发明涉及用于纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,所述方法包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白并可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与其上固定有与至少一种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白特异性结合的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,b)从步骤a)形成的复合物中释放活性的GLA结构域凝固蛋白,和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。在上述方法中,所述适配体优选是脱氧核糖核酸适配体。在上述方法中,所述GLA结构域凝固蛋白可以是维生素K依赖性的凝固因子,例如选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在这些方法的某些实施方案中,所述核酸适配体由序列SEQ ID NO. 4的适配体组成。
附图简介图I显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子IX与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振单位表示。I号曲线由惠氏公司(Wyeth)以名称BeneFIX 出售的重组Fix ;2号曲线由转基因猪生产的重组因子IX的半纯化制备物(FIXtg)。该FIX是低Y羧基化的(在存在的12个中,羧基化量度< 7个Y羧基化);3号曲线阴性对照(仅缓冲液)。图2是人血浆因子IX的纯化级分中,或因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,所述蛋白质已经过预处理,所述预处理是通过澄清、然后在MEP HyperCel 支持物上层析,然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右第I道起始组合物来自人因子IX的转基因猪的乳汁,其经过了通过澄清然后在MEP HyperCel 支持物上层析的预处理;第2道未滞留在亲和支持物上的级分中含有的蛋白质;第3道洗脱级分中含有的蛋白质;第4道来自亲和支持物的输出物中、再生缓冲液中含有的蛋白质;第5道人血浆因子IX的纯化级分;6道已知分子量的參照蛋白质。标出了參照蛋白质的某些蛋白质条带的表观分子量。图3是人血浆因子IX的纯化级分中,或人因子IX的转基因猪的乳汁中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,所述蛋白质已经过预处理,所述预处理通过澄清、然后在MEP HyperCel 支持物上层析、然后在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化。用硝酸银处理SDS-PAGE凝胶。图4A代表了染色后整个SDS-PAGE凝胶。图3B是图3A的凝胶的细节部分。“St”和“S”道已知分子量的參照蛋白质;第I、2和4道在不同测定后,在MEP HyperCel 支持物上层析,然后在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上纯化后洗脱级分中含有的蛋白质;第3道 人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的25ng因子IX);第3’道人血浆因子IX的纯化级分(在SDS-PAGE凝胶上样的550ng因子IX)。图3A和图3B中标出了某些蛋白质条带的表观分子量。图4显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子IX与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。I号曲线人血浆因子IX的制备物;2号曲线由转基因猪生产的重组因子IX的制备物,通过在MEPHyperCel 支持物然后在包含抗GLA适配体的亲和支持物上的层析来纯化;3号曲线由转基因猪生产的重组因子IX的制备物,在通过包含抗GLA适配体的亲和支持物之前(在MEPHyperCel 之后);4号曲线阴性对照制备物(仅缓冲液)。图5显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,(i)在多种组合物中存在的因子VII、因子IX或因子X,分别与(ii)特异性针对固定在支持物上的GLA结构域蛋白的适配体之间的结合曲线。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。I号曲线人重组因子IX的制备物(BeneFIX ) ;2号曲线人血浆因子Vii的制备物;3号曲线人血浆因子X的制备物;4号曲线阴性对照制备物。图6显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,本发明的多种核酸与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。曲线“I”:低亲和カ核酸;曲线“2”中等亲和カ核酸;曲线“3”高亲和力核酸;曲线“4” 非常高亲和カ核酸。图7显示了在根据表面等离振子共振技术的測定中,核酸适配体“Mapt-L 2. -CS”和“Mapt-1. 2. -CS0”与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿x轴时间,按秒表示;沿y轴共振信号,按任意共振単位表示。I号曲线是用Mapt-L 2. -CS适配体获得的结合曲线;2号曲线是用Mapt-1. 2. -CSO适配体获得的结合曲线。图8显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析谱,所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿X轴时间;沿7轴在254纳米处的吸光度值(0. D.)。(I):注射人血浆FIX浓缩物的时刻;(2):非滞留级分的消除峰;(3)纯化的FIX的洗脱峰;(4):在层析支持物再生步骤的过程中生成的峰。图9是人血浆因子IX的纯化级分含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,其具有4%至12%双丙烯酰胺梯度(无还原剂),所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右第I道(“SM”)起始组合物、人血浆因子IX浓缩物;第2道(“NR”)未滞留在亲和支持物上的级分含有的蛋白质;第3道(“£1”)洗脱级分El含有的蛋白质;第4道(“E2”)在来自亲和支持物的输出物、再生缓冲液中含有的蛋白质;第5道(“E3”)在来自亲和支持物的输出物、再生缓冲液中含有的蛋白质;第6道(“T FIX”)人血浆因子IX 的纯化级分。

图10显示了当进行纯化人血浆因子IX的方法时获得的层析谱,所述人血浆因子IX是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿X轴时间;沿丫轴在254纳米处的吸光度值(0. D.)。(I):非滞留级分;(2):纯化的人FIX的洗脱峰;(3):层析支持物的再生峰。图11是人血浆因子IX的纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶的图像,其具有4%至12%双丙烯酰胺梯度,不含还原剂,所述人血浆因子IX经过在移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右第I道(“起始物”)起始组合物、人血浆因子IX浓缩物;第2道(“未滞留的”)未滞留在亲和支持物上的级分含有的蛋白质;第3道(“洗脱物”)洗脱级分含有的蛋白质。图12显示了当进行纯化转基因人因子IX的方法时获得的层析谱,所述人因子IX是在转基因母猪的乳汁中用其上固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿X轴时间 ’沿I轴在254纳米处的吸光度值(0. D.)。(I):注射转基因FIX的时刻;⑵非滞留级分;(3):洗脱级分。图13是在转基因母猪的乳汁中生产的重组人因子IX的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述重组人因子IX经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右 第I道(“E5”、”起始物”)起始组合物,在MEPHyperCel 上预纯化的转基因人因子IX;第2道(“E6”、”未滞留的”)未滞留在亲和支持物上的级分中含有的蛋白质;第3道(17”、”洗脱物”)洗脱级分含有的蛋白质;第4道(18”、”再生”)再生级分中含有的蛋白质;第5道(“T FIX”、”纯FIX对照”)纯化的FIX对照。箭头FIX迁移的位置。图14显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,本发明的多种核酸与固定在支持物上的重组人因子IX的结合曲线。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振单位表示。曲线“I”:低亲和力核酸;曲线“2”中等亲和力核酸;曲线“3”高亲和力核酸;曲线“4” 非常高亲和力核酸。图15显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析谱,所述人因子VII是用固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿X轴时间;沿7轴在254纳米处的吸光度值(O.D.)。(I):注射的时刻;(2):非滞留级分;(3):注射洗脱缓冲液的时刻;(4):洗脱级分。图16是人血浆因子VII的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述人血浆因子VII经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右(I):第I道(”起始物”)起始组合物、人血浆因子VII ; (2):第2道(”洗脱物”)洗脱级分中含有的蛋白质;(3)Des-Gla FVII =FVII的低糖基化形式;(4) =FVII的其他难鉴别的形式。图17显示了当进行纯化转基因人因子VII的方法时获得的层析谱,所述人因子VII是用其上固定了抗GLA核酸适配体的亲和支持物生产的。沿X轴时间;沿7轴254纳米的吸光度值(O. D.)。(I):非滞留级分;(2):洗脱级分;(3):再生级分。图18是人血浆因子VII的预纯化级分中含有的蛋白质的SDS-PAGE电泳凝胶图像,所述人血浆因子VII经过在其上移植了特异性针对GLA结构域蛋白的核酸适配体的亲 和支持物上的层析。用考马斯蓝处理SDS-PAGE凝胶。从左至右(I):第I道(”起始物”)起始组合物,人血浆因子VII ; (2):第2道(“NR”)非滞留蛋白质的级分;(3):第3道(”洗脱物”)洗脱级分中含有的蛋白质;⑷=Des-Gla FVII:FVII的低糖基化形式。图19显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线分别对应于血浆FVII在使用多种运行缓冲液的过程中的结合动力学,图16从下至上T3 :缓冲液3 ;Τ2 :缓冲液2 ;T1 :缓冲液I ;T4 :缓冲液4和Τ5 :缓冲液5。沿X轴时间,按秒表示;沿y轴共振信号,按任意共振単位表示。图从下至上曲线说明増加的亲和カ的相互作用。图20显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线使得能够确定在使用缓冲液I (50mM Tris、50mMNaClUOmM CaCl2、4mM MgCl2, pH 7.5)的过程中血浆FVII的结合动力学參数。沿x轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。图21显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用缓冲液5 (50mM TrisUOmM CaCl2,pH 7. 5)的过程中血浆FVII的结合动力学。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。图22显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液的过程中血浆FVII 与 Mapt-2 的结合抗性(I):注射 FVII ; (2):含有 IM NaClUOmM CaCl2、4mM MgCl2 的50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ; (3):含有 2M NaClUOmM CaCl2、4mM MgCl2 的 50mMTris 缓冲液,pH 7. 5,(4) :50mM 含 3M NaCl、IOmM CaCl2、4mM MgCl2 的 Tris 缓冲液,pH 7. 5 ;和(5):含IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间,按秒表示;沿y轴共振信号,按任意共振单位表示。图23显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于在使用多种洗涤缓冲液时血浆FVII与Mapt-2 的结合抗性(I):注射 FVII ; (2):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ; (3):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5,(4):含有IOmM CaCl2、4mM MgCl2,2M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ;和(5):含有 IOmM CaCl2、4mMMgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ;和(6):含 IOmM EDTA 的 50mM Tris 缓冲液。沿X轴时间,按秒表示;沿7轴共振信号,按任意共振単位表示。图24显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与人血浆因子VII的结合曲线。曲线对应于使用多种洗涤缓冲液时血浆FVII与Mapt-2的结合抗性(I):注射FVII ; (2) : 10 %こ醇缓冲液;(3):含有IOmM CaCl2、4mMMgCl2UM NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ; (4):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,2M NaCl 的50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ; (5):含有 IOmM CaCl2、4mMMgCl2、3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ;和(6):含有IOmMEDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间,按秒表示;沿y轴共振信号,按任意共振単位表示。 图25显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-I适配体与重组人因子VII的结合曲线。曲线对应于当使用多种洗涤缓冲液时重组FIX与Mapt-I 的结合抗性(I):注射重组 FVII ; (2):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2UM NaCl 的 50mMTris 缓冲液,pH 7. 5 ; (3):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,2M NaCl 的 50mMTris 缓冲液,pH7. 5 ; (4):含有 IOmM CaCl2、4mM MgCl2,3M NaCl 的 50mM Tris 缓冲液,pH 7. 5 ;和(5):含有IOmM EDTA的50mM Tris缓冲液。沿x轴时间,按秒表示;沿y轴共振信号,按任意共振单位表示。图26显示了在根据表面等离振子共振技术的测定中,固定在支持物上的Mapt-2适配体与重组人因子IX的结合曲线。曲线对应于当使用下列洗涤缓冲液时重组FIX与Mapt-I的结合抗性50mM TrisUOmM CaCl2、50%丙ニ醇,pH 7. 5。沿x轴:时间,按秒表示;沿I轴共振信号,按任意共振単位表示。(I)在缓冲液5中注射50%丙ニ醇。发明详述申请人:努力设计用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的新方法,S卩,适用于从包含GLA结构域凝固蛋白或多种GLA结构域凝固蛋白的起始样品中获得纯化且活性的GLA结构域凝固蛋白的新方法。換言之,申请人寻求开发出(i)对给定的活性GLA结构域凝固蛋白,或(ii)对多种活性GLA结构域凝固蛋白选择性的富集或纯化的方法。为了开发这些纯化方法,申请人已经分离并表征了新的配体,所述配体具有特异性结合活性GLA结构域蛋白或多种活性GLA结构域凝固蛋白的能力。这些新的配体不与无活性的GLA结构域凝固蛋白可检测地结合。此外,能够把这些新配体固定在固体支持物的表面,从而制备用于亲和纯化GLA结构域凝固蛋白的支持物,所述亲和纯化支持物具有配体释放的降低风险,或甚至零风险,因而纯化的终产物被所述配体,或被所述配体降解导致的片段或产物污染的降低风险或零风险。本说明书下文中将详述其特征的这些新配体由核酸组成,也称为“核酸适配体”,其与活性GLA结构域凝固蛋白結合。在某些实施方案中,所述适配体对预定的活性GLA结构域凝固蛋白是特异性的。在其他实施方案中,所述适配体对特定的活性GLA结构域凝固蛋白不是特异性的井能够结合多种活性GLA结构域凝固蛋白。本发明提供了纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法,其中优势是利用这些核酸类型的新配体的结合特性。申请人:还努力开发获得特异性结合活性GLA结构域蛋白的核酸适配体的方法,目标是使用方法中的所述核酸适配体纯化所述活性蛋白。根据本发明,已获得特异性结合活性GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体。更具体而言,申请人已获得并表征了与仅ー种或多种活性GLA结构域凝固蛋白专有地结合(S卩,与具有GLA结构域的蛋白质结合,所述GLA结构域的GLA结构域特征性谷氨酰胺残基已经至少部分被Y羧基化并且所述GLA结构域的GLA结构域部分羧基化足以使所述GLA结构域凝固蛋白为活性的)的核酸适配体。在某些实施方案中,本发明的对预定GLA结构域凝固蛋白特异性的核酸适配体能够选择性地与所述GLA结构域凝固蛋白的活性形式结合,而不与所述GLA结构域蛋白的无活性形式結合。在其他实施方案中,对活性GLA结构域蛋白特异性的本发明的核酸适配体能够无差别地与具有保守的共同特征的多种蛋白质结合,所述共同特征是GLA结构域,其Y羧基化的水平使这些蛋白质能够是活性的,且不结合所述GLA结构域凝固蛋白的无活性形式。实施例中特别显示,对GLA结构域凝固蛋白特异性的适配体能够结合多种活性蛋白,例如因子IX、因子VII和因子X。实施例中展示的结果显示,本发明的抗GLA适配体(例如序列SEQ IDN0. 37的Mapt-2-CS适配体,或序列SEQ ID NO. 38的Mapt-2. 2. -CS适配体)专有地结合GLA结构域凝固蛋白的活性形式,特别是专有地结合人因子VII的活性形式。例如,这些抗GLA适配体不结合人因子VII的Des-Gla形式,该形式由包含修饰或缺少GLA结构域的无功能形式组成。特异且単独识别GLA结构域蛋白(例如因子II、因子VII、因子IX或因子X)的核酸适配体是现有技术已知的,包括结合凝血酶的适配体(Zhao等人,2008, Anal Chem, 80卷
(19):7586-7593)、结合因子 IX/IXa 的适配体(Subash 等人,2006,Thromb Haemost,第 95卷:767-771 ;Howard 等人,2007,Atherioscl Thromb Vasc Biol,第 27 卷:722-727 ;PCT 申请号WO 2002/096926 ;美国专利号US 7312325)、结合因子X/Xa的适配体(PCT申请号WO2002/096926 ;美国专利号US 7312325)或者其它结合人因子VII/VIIa的适配体(Rusconi等人,2000, Thromb Haemost, 84 卷(5) :841-848 ;Layzer 等人,2007, Spring,第 17 卷1-11)。应说明的是上述适配体无ー描述了用于纯化其结合的靶蛋白的用途。此外,上述适配体专有地结合单一 GLA结构域蛋白,不与另一 GLA结构域蛋白交叉結合,从而使得能够想象已知的适配体不结合GLA结构域凝固蛋白的GLA结构域,因此不能选择性地结合活性GLA结构域蛋白的GLA结构域。 对给定的GLA结构域蛋白是特异性的,并且不具有结合另一蛋白质(包括另ーGLA结构域蛋白)的能力的此类适配体,由例如Layzer等人(2007, Oligonucleotides,第17卷1-11)所描述。然而,就申请人已知,现有技术中尚未描述过这样的核酸适配体,所述核酸适配体的结合特异性是蛋白质的GLA结构域,且具有选择性地结合一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的能力。此外,就申请人已知,现有技术中也尚未描述过这样的核酸适配体,所述核酸适配体的结合特异性是蛋白质的GLA结构域,且具有结合多种不同活性GLA结构域凝固蛋白的能力。可获得特异性结合活性GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体使得能够开发纯化这些蛋白质的方法,特别是以获得可用作药物活性成分的纯化终产物为目标。依据所使用的核酸适配体的特异性类型,所述纯化方法允许(i)预定的活性GLA结构域凝固蛋白的选择性的纯化,(ii)或者多种GLA结构域凝固蛋白的活性形式的选择性的纯化。本发明涉及纯化至少ー种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤a)使含有ー种或多种GLA结构域凝固蛋白的样品与其上固定了特异性结合生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,b)从步骤a)形成的复合物中释放生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。本发明还涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤a)使含有ー种或多种GLA结构域凝固蛋白的样品与其上固定了特异性结合多种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,b)从步骤a)形成的复合物中释放生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。术语“GLA结构域凝固蛋白”涵盖了包含名为GLA结构域的区域的任何凝固蛋白,所述区域包含多种在蛋白质合成过程中Y羧基化的谷氨酰胺残基。GLA结构域凝固蛋白涵盖了在N末端具有GLA结构域的凝固蛋白,所述GLA结构域一般位于前肽的下游,即C端一侧,所述前肽在合成过程中被天然的水解。GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的凝固蛋白,所述凝固蛋白中的GLA结构域由包含9至12个谷氨酰胺残基的约45个氨基酸的区域組成,至少部分所述9至12个谷氨酰胺残基在细胞的蛋白质合成过程中被正常的羧基化以产生GLA残基。由维生素K依赖性的蛋白质组成的GLA结构域凝固因子涵盖了凝血酶原(因子II)、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。GLA结构域凝固蛋白涵盖了从天然源(例如血浆)产生的非重组蛋白,以及在体外通过用编码所述凝固蛋白的DNA转染或转化细胞能够生产的重组蛋白,或者在体内通过已导入编码所述凝固蛋白的转基因的动物能够生产的重组蛋白。在本说明书中由转基因动物生产的GLA结构域凝固蛋白也被称为“转基因蛋白,,。本说明书的下文中详细描述了測定GLA结构域凝固蛋白的活性的方法。“活性的”或“生物学活性的”GLA结构域凝固蛋白涵盖了具有对相应的參照蛋白质测定的抗凝血或酰胺分解(amidolytic)活性的至少一半水平的GLA结构域凝固蛋白,分别判断所述參照蛋白质的抗凝血或酰胺分解活性是最佳的。活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的GLA结构域凝固蛋白,其具有对相应參照蛋白质所测定的抗凝血或酰胺分解活性的至少 O. 5,0. 55,0. 6,0. 65,0. 7,0. 75,0. 8,0. 85,0. 9,0. 95,0. 96,0. 97,0. 98,0. 99 或 I 倍水平,分别判断所述參照蛋白质的抗凝血或酰胺分解活性是最佳的。活性GLA结构域蛋白还涵盖了这样的GLA结构域蛋白,其也可被称为“超活的”GLA蛋白,其具有高于參照蛋白或组合物的抗凝血或酰胺分解活性水平,即具有大于I的抗凝血或酰胺分解活性水平。
活性因子II (凝血酶原)涵盖了具有对相应的參照因子II測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子II,分别判断所述參照因子II的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。活性因子VII涵盖了具有对相应的參照因子VII測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子VII,分别判断所述參照因子VII的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。活性因子IX涵盖了具有对相应的參照因子IX測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子IX,分别判断所述參照因子IX的抗凝血活性或酰 胺分解活性是最佳的。活性因子X涵盖了具有对相应的參照因子X測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的因子X,分别判断所述參照因子X的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。活性蛋白C涵盖了具有对相应的參照蛋白C測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的蛋白C,分别判断所述參照蛋白C的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。活性蛋白S涵盖了具有对相应的參照蛋白S測定的抗凝血或酰胺分解活性的至少一半水平的蛋白S,分别判断所述參照蛋白S的抗凝血活性或酰胺分解活性是最佳的。根据上述内容,本领域技术人员将理解,“活性的”或“生物学活性的” GLA结构域凝固蛋白不应与“活化的”GLA结构域凝固蛋白混淆。“活化的”GLA结构域凝固蛋白是切割肽的蛋白水解反应的结果,所获得的蛋白质之后行使它自身的生物学活性。“活化的”凝固因子一般用额外的“a”标注。作为示例,因子VII/ “活化的”因子VII对可被标注为FVII/FVIIa对。然而,出于本发明的目的,存在“活化的”凝固因子的“生物学活性的”形式和“生物学无活性的”形式,因为存在“生物学无活性的”(例如由于其GLA结构域的不正确的Y羧基化)“活化的”GLA结构域凝固因子的形式。因而,出于本发明的目的,“生物学活性的” GLA结构域凝固蛋白涵盖了⑴所述GLA结构域凝固蛋白的“活化的”形式,该形式直接行使其自身的生物学活性,和(ii)所述蛋白质的非活化形式,所述蛋白质的非活化形式在活化后导致行使其自身生物学活性的所述蛋白质的形式。术语“相应的蛋白质”或“相应的因子”意在优选地表示相同哺乳动物(例如人)的蛋白质或因子。活性GLA结构域凝固蛋白,也称为生物学活性的GLA结构域凝固蛋白,涵盖了这样的蛋白质类型,其中GLA结构域的所有谷氨酰胺残基被Y羧基化。在某些情况下,活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的蛋白质类型,其中GLA结构域的至少ー个谷氨酰胺残基没有被Y羧基化,但出于本发明的目的,所述蛋白质类型仍然是生物学活性的。根据本发明,术语“核酸适配体”意在表示特异性结合一种或多种活性GLA结构域凝固蛋白的单链核酸,在本说明书中也可被称为“抗GLA适配体”。因而本发明的适配体涵盖了这样的适配体,对其而言,在使各个核酸和蛋白质伙伴(partner)接触的在先步骤之后能够检测具有单个活性GLA结构域凝固蛋白的复合物或具有多个给定的活性GLA结构域凝固蛋白的复合物。优选地,根据本发明的“核酸适配体”具有结合多个活性GLA结构域蛋白的能力。本领域技术人员可以容易地进行检测根据本发明的抗GLA适配体和活性GLA结构域凝固蛋白之间形成的复合物,例如,通过执行表面等离振子共振检测技术,包括Biacore 技术,如实施例中示例的。本领域的技术人员通过ELISA类型的常规技术也能够容易地检测根据本发明的抗GLA适配体和活性GLA结构域凝固蛋白之间复合物的形成,如本领域技术人员已知的。实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够选择性地结合GLA结构域凝固蛋白的活性形式,例如因子IX。根据本发明还显示,抗GLA适配体能够分别结合多种不同的活性GLA结构域凝固蛋白,特别是结合多种活性的人GLA结构域凝固蛋白。已特别显示,根据本发明的给定的抗GLA适配体能够分别与活性因子VII、活性因子IX和活性因子X结合。
在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白是维生素K依赖性的凝固因子。在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些实施方案中,上述纯化方法适合选择性纯化选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的单个活性GLA结构域凝固蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X。在某些实施方案中,上述纯化方法适合纯化活性因子IX。因而在实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够区分活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白。特别是在实施例中已显示,根据本发明的抗GLA适配体能够区分GLA结构域被正确地Y羧基化的GLA结构域凝固蛋白和其GLA结构域被不正确地Y羧基化的GLA结构域凝固蛋白。出于本发明的目的,根据本发明,正确Y羧基化的GLA结构域涵盖了其所有的特征性谷氨酰胺残基都被Y羧基化的GLA结构域,以及这样的GLA结构域,所述GLA结构域仅部分特征性谷氨酰胺残基被Y羧基化,而它的部分Y羧基化不导致所考虑的GLA结构域凝固蛋白不是生物学活性的。作为示例,对于GLA结构域凝固蛋白如因子IX,当它的GLA结构域的所有特征性谷氨酰胺残基都被Y羧基化之吋,以及当在它的GLA结构域中含有的12个特征性谷氨酰胺残基中,GLA结构域的至少7个谷氨酰胺残基被Y羧基化之时,所述蛋白质是生物学活性的。因而,对于因子IX,活性蛋白质涵盖了这样的因子IX,其中GLA结构域的7、8、9、10、11和12个谷氨酰胺残基已被Y羧基化。对于因子IX,根据本发明的抗GLA核酸适配体涵盖了这样的适配体,所述适配体结合其中的GLA结构域的7、8、9、10、11和12个谷氨酰胺残基已被Y羧基化的因子IX,而不结合其中的GLA结构域的少于7个谷氨酰胺残基已被Y羧基化的因子IX。作为此类适配体的实例,可提及序列SEQ ID NO. 4的适配体。
本发明的抗GLA适配体的区分活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白的这些特性,可用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的方法中,从而获得极大富集了目标GLA结构域凝固蛋白的活性形式的终产物。实施例中说明了用于纯化活性GLA结构域凝固蛋白的活性形式,特别是因子IX的活性形式的执行方法的实例。本发明的抗GLA适配体的这些有利的区分特性使其能够例如从人因子IX转基因的哺乳动物乳汁中,获得活性的重组人因子IX的纯化制备物,当所述乳汁包含重组人因子IX的活性形式和无活性形式吋,特别是其GLA结构域被正确Y羧基化的重组人因子IX形式和其GLA结构域被不正确Y羧基化的重组人因子IX形式。本发明还涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤a)使含有ー种或多种GLA结构域凝固蛋白,并可能含有GLA结构域凝固蛋白的生物学无活性分子的样品与其上固定了与生物学活性的GLA结构域凝固蛋白或多种生物学 活性的GLA结构域凝固蛋白特异性结合的核酸适配体的亲和支持物接触,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述活性GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,b)从步骤a)形成的复合物中释放活性GLA结构域凝固蛋白,和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。在以上方法的某些实施方案中,所述核酸适配体由脱氧核糖核酸适配体组成。在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白是维生素K依赖性的凝固因子。在某些实施方案中,上述纯化方法的特征是所述GLA结构域凝固蛋白选自因子
II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。在某些实施方案中,上述纯化方法适合选择性纯化选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的单个活性GLA结构域凝固蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域凝固蛋白。在某些实施方案中,上述纯化方法适合同时纯化活性因子II、活性因子VII、活性因子IX和活性因子X。在某些实施方案中,上述纯化方法适合纯化活性因子IX。如前文已经提及的,GLA结构域凝固蛋白的“活性”形式由GLA结构域被正确Y羧基化的形式(即,由根据本发明的抗GLA适配体识别的GLA结构域凝固蛋白形式)组成。能够通过出于本发明需要而特别开发的方法获得抗GLA适配体,所述方法详述在本说明书的下文中。多于ー种的GLA结构域凝固蛋白的同时纯化特别取决于用于执行纯化方法的起始样品的类型。特别地,在方法结束吋,以纯化形式获得的GLA结构域凝固蛋白的数量和身份,逻辑上受初始存在于起始样品中的GLA结构域凝固蛋白的数量和身份的限制。出于本发明的目的,活性GLA结构域凝固蛋白的“纯化”意指富集所述GLA结构域凝固蛋白的活性形式,即,获得这样的“纯化的”组合物,所述组合物具有的活性GLA结构域蛋白的浓度可检测地大于受纯化步骤的起始样品中的所述活性GLA结构域凝固蛋白的初始浓度。“纯化形式的”活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的组合物,所述组合物包含其浓度可检测地大于在进行纯化步骤前的起始组合物中其浓度的活性GLA结构域凝固蛋白。因而,本发明的活性GLA结构域凝固蛋白涵盖了这样的组合物,所述组合物中所述活性GLA结构域凝固蛋白被纯化为均质,但不以任何方式被限制为这ー特定的纯化形式。特别地,当纯化前的样品包含多于ー种的GLA结构域凝固蛋白时,纯化的活性蛋白质不能被定义为纯化为均质,单纯是由于纯化后的组合物中并存至少两种活性GLA结构域凝固蛋白。—般而言,抗GLA适配体能够由DNA(脱氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)分子组成,并具有结合活性GLA结构域蛋白的能力,该能力大于结合无活性的GLA结构域凝固蛋白的能力。能够通过出于本发明的需要而开发的方法获得抗GLA适配体,所述方法详细描述于本说明书的下文中。在某些实施方案中,根据本发明的抗GLA适配体具有多个共同的结构特征,包括 这样的序列,所述序列从5’端至3’端顺序包含⑴长度约20个核苷酸(例如,18个核苷酸长)的不变的特定核苷酸序列,接着(ii)长度约40至50个核苷酸(例如,44个核苷酸长)的可变核苷酸序列,接着(iii)长度约20个核苷酸(例如,18个核苷酸长)的不变的特定核苷酸序列。应说明,可变核苷酸序列(ii)彼此可具有非常强的核苷酸序列同一性。在本说明书中说明的ー些选择抗GLA适配体的方法是这样的类型,其使得能够获得抗GLA适配体的家族,所述抗GLA适配体能够选择性识别预定的活性GLA结构域凝固蛋白,特别是预定的人活性GLA结构域凝固蛋白。在本说明书中说明的一些其他选择抗GLA适配体的方法是这样的类型,其使得能够获得抗GLA适配体的家族,所述抗GLA适配体能够选择性识别多种活性GLA结构域凝固蛋白,特别是多种人活性GLA结构域凝固蛋白。从结构的观点出发,特异性结合本发明的活性GLA结构域凝固蛋白的核酸或核酸适配体的家族包含多核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述多核苷酸与下列通式(I)的核酸具有至少40%核苷酸同一性5,-[SEQ ID NO. I] X-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]y_3’(I),其中- “SEQ ID NO. X” 由序列 SEQ ID NO 3 的核酸组成,- “X”是等于O或I的整数,和- “Y”是等于O或I的整数。在某些实施方案中,序列SEQ ID NO. X的酸长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在其他实施方案中,序列SEQ ID勵]的核酸长度为43、44、45、46、47、48或49个
核苷酸。在某些其他优选的实施方案中,序列SEQ ID勵]的核酸长度为43、44或45个核苷酸。如前文已经提及的,通式(I)的核酸长度至少是15个核苷酸。在某些实施方案中,通式(I)的核酸长度至少是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80或81个核苷酸,从而涵盖了具有所述每个确切长度的核酸。当整数“X”等于0,而整数“y”等于I时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(I-I)的核酸具有至少40%核苷酸同一'丨生的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸5,-[SEQ ID NO. X]-[SEQ ID N0.2]_3,(I-I)当整数“X”等于1,而整数“y”等于O时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(1-2)的核酸具有至少40%核苷酸同一'丨生的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸
5,-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID Ν0·Χ]_3,(1-2)当整数“X”等于0,而整数“y”等于O时,本发明的核酸适配体涵盖了这样的核酸,所述核酸包含与下列通式(1-3)的核酸具有至少40%核苷酸同一'丨生的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸5’ -[SEQ ID Ν0·Χ]_3,(1-3)因而,上述核酸适配体涵盖了包含与序列SEQ ID NO. 3的核酸具有至少40%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸。—般而言,与第二多核苷酸或核酸具有至少40%核苷酸同一'丨生的第一多核苷酸与所述第二多核苷酸或核酸具有至少41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,71 %,72%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%、96%、97%、98%或100%的核苷酸同一性。在包含序列SEQ ID NO. X的本发明核酸的某些实施方案中,所述序列SEQ ID NO. X选自这样的核酸,所述核酸具有与选自序列SEQ ID NO. 3、6至35、37和38的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续的核苷酸。在包含序列SEQ ID NO. X的本发明核酸的某些实施方案中,所述序列SEQ ID NO. X选自这样的核酸,所述核酸与选自序列SEQ ID NO. 3、6至35、37和38的序列具有至少41%、42%,43%,44%,45%,46%,47%,48%,49%,50%,51 %,52%,53%,54%,55%,56%,57%,58%,59%,60%,61 %,62%,63%,64%,65%,66%,67%,68%,69%,70%,7172%,73%,74%,75%,76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^; 100% 的核苷酸同一性。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含与选自序列SEQ ID NO. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列的至少15个连续核苷酸的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含选自序列SEQ ID NO. 3、4和6至39的序列的至少15个连续核苷酸的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含与选自序列SEQ ID NO. 3、4和6至39的序列具有至少40%核苷酸同一性的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸包含选自序列SEQ ID NO. 3、4和6至39的序列。在本发明的核酸适配体的某些实施方案中,所述适配体选自这样的核酸,所述核酸由选自序列SEQ ID NO. 3、4和6至39的序列组成。由上述可得出,本发明涵盖了具有上文定义的系列通式(I)的至少15个连续核苷酸的单链核酸家族。出于本发明的目的,两条核酸序列之间的“百分比同一性”是通过比较窗ロ由比较两条最佳比对的序列来确定的。因而比较窗口中的核苷酸序列部分能够包含相比參照序列(所述參照序列不包含这些添加或这些缺失)的添加或缺失(例如空位),从而获得两条序列间的最佳比对。 通过确定在比较的两条序列中观察到相同核酸碱基的位置的数量来计算百分比同一性,之后用两个核酸碱基之间相同的位置的数目除以比较窗ロ中的位置总数,再将结果乘以一百,从而获得两条序列相对于彼此的百分比核苷酸同一性。可以通过使用已知算法的计算机就比较执行序列的最佳比对。完全优选的,使用CLUSTAL W软件(I. 82版)确定百分比序列同一性,參数固定如下(I)CPU MODE = Clustalff mp ; (2) ALIGNMENT = “全面” ;(3) OUTPUT FORMAT = “aln w/numbers ” ; (4) OUTPUT ORDER = “ 比对的 ” ;(5) COLOR ALIGNMENT = “ 否”;(6) KTUP (字节)=“默认 ” ;(7) WINDOW LENGTH = “ 默认 ” ;(8) SCORE TYPE = “ 百分比 ” ;(9) TOPDIAG = “ 默认” ;(10)PAIRGAP = “默认” ;(II)PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE = “无” ;(12)MATRIX =“默认” ;(13) GAP OPEN = “默认” ;(14) END GAPS = “默认” ;(15) GAP EXTENSION = “默认”;(16) GAP DISTANCES = “默认”;(17) TREE TYPE =“进化树”和(18) TREE GRAPH DISTANCES=“隐藏”。在本发明的抗GLA核酸适配体的某些优选的实施方案中,所述核酸适配体包含与通式(I)的核酸具有至少80%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸,从而涵盖了包含与通式(I)的所述核酸具有至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%^; 100%核苷酸同一性的多核苷酸的至少15个连续的核苷酸的适配体。根据本发明的核酸适配体涵盖了序列SEQ ID NO. 4的核酸适配体。回忆序列SEQID NO. 4的适配体由通式(I)的适配体组成,其中序列SEQID NO. X由序列SEQ ID NO. 3组成。还回忆序列SEQ ID NO. 3的适配体由通式(1-3)的适配体组成,其中缺少序列SEQ IDNO. I 和 SEQ ID NO. 2。申请人:已经显示了序列SEQ ID NO. 3的适配体具有选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力,这与序列SEQ ID NO. 4的适配体的能力基本相同。这些结果显示在序列SEQ ID NO. 4的适配体的特定结合特性中存在序列SEQ ID NO. 3的核酸的关键属性。一般而言,这些结果显示序列SEQ ID NO. X的核酸在通式(I)的适配体中的关键属性,序列SEQID NO. X的核酸赋予通式(I)的适配体选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力。本发明的核酸适配体因而也涵盖了序列SEQ ID NO. 3的适配体。实施例中还显示多种适配体,包括序列SEQ ID NO. 6至35的适配体,具有选择性结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力,根据需要具有不同亲和力水平。作为示例,在序列SEQ ID NO. 6至35的适配体中,具有与人因子IX最大结合能力的适配体是序列SEQ IDNO. 35的适配体,也可被标注为“Mapt-1. 2. -CS”。实施例中也鉴定了具有甚至大于上述Mapt-1. 2. -CS适配体的结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力的适配体。此类适配体的实例是序列SEQ IDN0. 36的适配体,也可被标注为 “Mapt-1. 2. -CS0”。序列SEQ ID NO. 36的Mapt_l. 2. -CSO适配体是包含这样的多核苷酸的至少15个连续核苷酸的适配体,所述多核苷酸与下列通式(I)的长度为62个核苷酸的核酸具有至少40%的核苷酸同一性 5,-[SEQ ID NO. I]-[SEQ ID NO. 35] _3’,并且由所述通式(I)的核酸中从第10位的核苷酸至第49位的核苷酸的核酸组成。实施例中还显示,序列SEQ ID N0S. 37至39的每种核酸都具有结合活性GLA结构域凝固蛋白的能力。序列SEQ ID N0S. 39的适配体还可表示为“Mapt-2”。序列SEQID NO. 37的适配体还可表示为“Mapt-2-CS”。序列SEQ ID NO. 38的适配体还可表示为“Mapt-2. 2-CS”。应说明的是Mapt_2_CS适配体的序列包括在Mapt-2适配体的序列内■ 它是Mapt-2适配体的“核心序列” SEQ ID NO. X。实施例中显示,本发明的抗GLA适配体可成功用于生产亲和层析支持物,所述支持物用于分离活性GLA结构域凝固蛋白和无活性的GLA结构域凝固蛋白。特别是为了制备亲和层析支持物,本发明的抗GLA核酸适配体优选包括在化学结构中,在本说明书中也被称为“化合物”,所述化学结构具体包括间隔区工具,以及恰当时包括用于固定在固相支持物上的工具。在某些实施方案中,核酸适配体包括在下列通式(II)的化合物的结构中[IMM]x-[SPAC]y_[APT] (II),其中-[MM]表示用于固定在支持物上的化合物,-[SPAC]表示间隔区链,-[APT]表示本说明书中定义的抗GLA适配体,-X是等于O或I的整数,和_y是等于O或I的整数。在通式(II)的化合物的某些实施方案中,[APT]由其序列是选自序列SEQ ID NO 3、4和6至39的脱氧核糖核酸組成。在通式(II)的化合物中表示为[SPAC]的“间隔区链”可以是任何已知的类型。所述间隔区链的功能是物理上分隔核酸与固相支持物的表面(所述表面上可以固定所述化合物),并允许核酸相对于其可固定的固相支持物的表面的相对移动。间隔区链限制或防止了位阻损害在所述核酸和可与其产生接触的凝固蛋白分子之间的结合事件,其中所述位阻是由于在固相支持物和核酸之间太接近导致的。在通式(II)的化合物中,间隔区链优选与核酸适配体的5’端或3’端连接。有利的,间隔区链同时与适配体的一端和固相支持物连接。具有间隔区的构造具有不将适配体直接移动在固相支持物上的优势。优选的,间隔区链是非特异性的寡核苷酸或聚こニ醇(PEG),或另ー种亲水性的基于烃的链。当间隔区链由非特异性的寡核苷酸组成时,所述寡核苷酸有利的包括至少5个核苷酸的长度,优选长度在5至15个核苷酸之间。在间隔区链由聚こニ醇组成的通式(II)的化合物的实施方案中,所述间隔区链涵盖了由例如Sigma Aldrich公司出售的PEG(C18)类型的聚こニ醇。如实施例所示,用包含间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物,和不具有间隔区链[SPAC]的通式(II)的化合物都可进行活性GLA结构域凝固蛋白的纯化。为了将适配体固定在间隔区链上,可以用多种化学基团化学修饰核酸,例如使得能够共价固定所述核酸的基团,例如巯基、胺或任何其他能够与固相支持物上存在的化学基团反应的基团。在通式(II)的化合物中,化合物[IMM]由这样的化合物组成,所述化合物选自(i)能够与固相支持物材料形成ー个或多个共价键的化合物,和(ii)能够通过弱的非共价键(包括氢键、静电力或范德华氏力)特异性结合在固相支持物上的化合物。在某些情况下,化合物[MM]由于是由通过共价键彼此连接的原子链组成,因而可以具有间隔区链的行为。然而,根据定义,化合物[IMM]绝不可以表示在根据本发明的通式(II)的化合物中的[SPAC]链。換言之,在通式(II)的化合物中,当存在[SPAC]链时,其不可以通过共价键或弱的非共价键与层析支持物直接连接。第一种类型的化合物[I匪]涵盖了双功能偶联剂,例如戊ニ醛、SIAB或SMCC。SIAB 化合物,如 G. T. Hermanson (1996, Bioconj ugate techniques, San Diego Academic Press,第239-242页)所述,是下列通式(A)的化合物
权利要求
1.纯化GLA结构域蛋白的方法,其包括下列步骤 a)将含有ー种或多种GLA结构域凝固蛋白以及可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与亲和支持物接触,所述亲和支持物上固定了特异性结合至少ー种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物, b)从步骤a)中形成的复合物释放GLA结构域凝固蛋白,和 c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
2.权利要求I中所述的方法,其特征是所述核酸适配体由脱氧核糖核酸适配体组成。
3.权利要求I和2之一所述的方法,其特征是所述核酸适配体包括在下列通式(I)的化合物的结构中[IMM]x-[SPAC]y-[APT] (I),其中 -[IMM]表示用于在支持物上固定的化合物, -[SPAC]表示间隔区链, -[APT]表示特异性结合GLA结构域蛋白的核酸, -X是等于O或I的整数,和 -Y是等于O或I的整数。
4.权利要求I至3之一所述的方法,其特征是所述GLA结构域凝固蛋白是维生素K依赖性的凝固因子。
5.权利要求I至4之一所述的方法,其特征是所述GLA结构域凝固蛋白选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S。
6.权利要求I至4之一所述的方法,其用于同时纯化至少两种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域蛋白。
7.权利要求1-4之一所述的方法,其用于同时纯化至少三种选自因子II、因子VII、因子IX、因子X、蛋白C和蛋白S的活性GLA结构域蛋白。
8.权利要求I至4之一所述的方法,其用于同时纯化因子II、因子VII、因子IX和因子Xo
9.权利要求1-8之任一所述的方法,其特征是所述核酸适配体由具有选自序列SEQIDNO :3、4和6至39的序列的适配体组成。
10.特异性结合一种或多种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体,它结合靶生物学活性的GLA结构域蛋白的能力不被高离子强度环境改变。
11.权利要求10所述的适配体,其特征是它结合靶生物学活性GLA结构域蛋白的能力不被具有至少O. 5M的最终NaCl浓度的高离子强度环境改变。
12.特异性结合生物学活性的GLA结构域蛋白的核酸适配体,其包含选自具有序列SEQID NO :3、4和6至39的序列的核酸的核酸。
13.权利要求10至12之一所述的核酸适配体,其特征是它由脱氧核糖核酸适配体组成。
14.亲和支持物,其上固定了权利要求10至13之一所述的核酸适配体。
全文摘要
本发明涉及纯化生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的方法,包括下列步骤a)使含有一种或多种GLA结构域凝固蛋白,并可能含有GLA结构域蛋白的生物学无活性分子的样品与亲和支持物接触,所述亲和支持物上固定了特异性结合至少一种生物学活性的GLA结构域凝固蛋白的核酸适配体,从而在(i)所述核酸适配体和(ii)所述GLA结构域凝固蛋白之间形成复合物,b)从步骤a)形成的复合物中释放GLA结构域凝固蛋白,和c)以纯化的形式回收所述生物学活性的GLA结构域凝固蛋白。
文档编号C12N15/115GK102666857SQ201080043798
公开日2012年9月12日 申请日期2010年7月30日 优先权日2009年7月31日
发明者G·佩雷, L·塞列特, N·比霍罗 申请人:Lfb 生物技术公司
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