三维多孔结构的制作方法

专利名称：三维多孔结构的制作方法
三维多 孔结构本发明涉及多孔结构、制备该结构的方法和该结构在固相过程中的用途。所述结构在广泛范围的物理和化学方法中是有用的，特别是当需要与底物的相互作用时，例如固相合成、固相萃取、固相试剂、物类的固定化、细胞培养、催化、色谱法和在医学诊断中。已制备三维大孔结构用于广泛范围的应用，包括例如作为用于色谱法的静止相的多孔整体(monoliths)，用于物类过滤的多孔盘，用于电渗泵的多孔材料，用于固相合成和其他化学转化的固体支持物、绝缘材料、用于在燃料电池应用中使用的多孔膜和用于组织工程的多维支架。三维(3D)结构可以在一系列材料中制备，包括其包括例如聚苯乙烯的有机聚合物和其包括例如二氧化硅的无机聚合物。然而，在广泛范围的聚合物中产生明确限定的孔尺度和互联通道中出现困难。其中可以获得对孔尺度的合理控制的聚合物范围是有限的。在广泛范围的聚合物中能够产生明确限定的孔尺度和通道将存在显著实际利益。在色谱应用中，3D结构通常指的是整体(monolith)。当整体用于色谱应用时,采用3D结构代替常规微粒静止相。用于在微粒静止相的孔内的质量转移的一般驱动力是扩散。与扩散相比，通过整体的孔的对流流动使得大分子例如蛋白质的分离速度中的显著增力口，并且3D整体在这点上优于常规静止相。一般地，整体材料在平面或管状模子中制备，从模子中取出片层或圆柱体，并且将多孔聚合物穿孔或切片以获得盘。在这些整体内的孔通过加入成孔剂(porogens)而掺入。在例如基于二氧化硅的整体中，成孔剂一般是大分子例如聚乙二醇。在例如基于聚苯乙烯的整体中，成孔剂通常是甲苯。目前使用的成孔剂引入具有不定连接性的宽孔径分布，这对于整体的色谱性能是有害的。用于过滤的3D结构通常通过烧结微粒进行制备。例如玻璃滤器通过例如烧结微粒玻璃进行制备。产生的烧结物的多孔性受起始玻璃粉的微粒大小控制，这是限定差的，并且导致宽孔径分布。这些烧结的3D结构可以用于一系列其他应用中，包括电渗泵，并且3D结构的孔径分布和互联通道影响通过泵的反压和流速。如果孔径太小，那么流速可以很高但随后反压也很高。提供用于例如在燃料电池中的应用的这些泵的效率可以通过提供更受控制的孔径得到极大改善，以促进有效对流流动。质子交换膜燃料电池也称为聚合物电解质膜(PEM)燃料电池开发用于一系列应用包括运输应用。PEM燃料电池使用聚合物电解质膜，这希望地允许通过膜的有效对流流动。在固相合成过程中有用的固体支持物材料是已知的。广泛范围的物理和化学方法采用固体支持物材料，包括例如有机分子特别是肽和寡肽的合成、物类的固定化、催化剂的支持、离子交换、从材料中萃取物类、诊断学和色谱法。固相合成提供超过液相合成的某些优点，例如，分离操作步骤可以得到简化或避免，可以保证减少执行操作步骤的时间，并且产物可以以基本上定量的得率回收。聚合物支持物通常用于在常规有机化学中使用的催化剂的固定化，包括化学和生物催化剂，以及固定化在医学和诊断应用中的生物学大分子。3D结构在固相萃取和在固相试剂的制备中的用途也是化学、药学和生物技术工业中已知的。已知的固相支持物一般包含特定大小和物理性质的聚合物微粒，以适应于应用。为了易于使用，这些聚合物微粒通常是球形的且具有限定的微粒大小分布。微粒的球形性质改善聚合物的流动和过滤特征。尽管固体支持物的使用具有优点，但存在关于固相方法的缺点。例如，由于例如复杂的制造过程，通常用于肽和寡肽的固相合成的商购可得支持物是昂贵的。这些过程在某些方面是不利的，包括对于连续相的单体丧失，在聚合过程中一系列微粒大小的生成和细粒的不希望生成，和费力的微粒大小分类例如筛分和风选。除在制备过程中不希望有的制造成本和废物，已知聚合微粒的物理性质中产生一些缺点。微孔聚合物可以用作支持物且具有相对低水平的交联剂，其允许聚合物微粒成溶剂化物且随后膨胀，这可以限制流动通道。微孔聚合微粒一般是柔软的，并且一般不适合于在填充柱床中以高流速在色谱应用中使用。此外，柔软微粒可能被不希望地压缩，并且例如在过滤过程中引起污垢，通常导致压缩侵入进入在柱底部使用的烧结物或网目内。大孔聚合物具有在聚合物基质中高水平的交联剂且含有大孔。刚性大孔和大网格微粒更适合于在填充柱床中的高流速。然而，由于刚性性质，微粒可以是脆性的且在物理应力下成碎片。这些问题被常规柱填充技术所恶化，其中可以对聚合物微粒实施不希望有地大的应力。为了在三维中培养和分化细胞，需要将细胞接种到能够支持组织形成的人工结构内。通常称为支架的这些结构对于离体和体内允许细胞影响其自身微环境是关键的。支架必须首先允许细胞附着和迁移，使得细胞营养素和所表达的废物扩散，并且提供必要的机械和生物学性质。当设计大孔结构时，在流动下的多孔性和性质是考虑的重要因素。迄今为止利用的大孔支架具有限定差的孔结构，并且孔一般太小或具有宽孔径分布。允许营养素和废物的有效迁移且允许细胞的快速和不受阻碍扩散的结构将是所希望的。多孔聚合物是已知的，然而，它们一般具有广泛的孔径分布。已知在水性乳剂中聚合单体，其中聚合物包围水滴而形成。一般至少一个数量级的广泛范围大小的水滴，意指聚合物的孔还具有广泛大小分布。进一步地，去除水以提供多孔聚合物，但这不容易使得材料留在聚合物中形成的空隙或孔中。在广泛范围的应用中，由于广泛范围的孔径且缺乏在孔之间的通道维度的相对一致性而出现问题。本发明旨在改善与目前技术相关的问题。我们目前已发现与已知聚合物微粒相关的这些及其他问题可以通过提供具有窄孔径分布的3D大孔结构得到改善。窄孔径分布通过下述获得紧密填充具有特定微粒大小的微粒，并用可流动组合物例如单体溶液充满微粒之间的空隙空间，并且实现单体的聚合作用，从而使得微粒事实上提供用于聚合团块的模子。在形成后，聚合物一般收缩，由此在微粒和聚合物之间产生通道。在第一个方面，本发明提供了用于产生3维多孔结构的方法，其包括在区中紧密填充微粒以提供微粒的3维阵列，使可聚合的单体优选纯单体或包含可聚合单体的组合物与阵列接触，从而使得单体或包含单体的组合物充满在微粒之间的空隙空间，并且实现单 体的聚合作用，由此在微粒周围形成聚合物结构，且任选从结构中去除微粒。为了产生3D大孔结构，多种微粒可以填充在一起，并且用包含单体的组合物充满在微粒之间的空隙空间，所述单体随后聚合。取决于最终应用，用于形成大孔结构的微粒可以通过扩散、化学降解、酶促降解、熔化或某些其他方法去除，所述其他方法设计为去除微粒且使大孔结构留在原处，或可以保留在大孔结构内。本发明的3D大孔聚合物可以通过聚合作用产生，通过本领域技术人员已知的方法起始。例如，加热与含有自由基引发剂的单体或单体溶液混合的微粒，以实现聚合作用。
在一个优选实施方案中，用于产生3D结构的方法包括形成微粒在液体中的浆，其中液体是包含单体的组合物或纯单体。适当地，取决于单体的亲水性，溶液包含单体在其中是可溶的溶剂，例如水或甲苯。优选地，使浆浓缩，以便保持液体组分至充满微粒之间的空隙空间所需的最低限度，在微粒填充在一起时。在六边形紧密填充中，空隙空间计算为约24%体积，并且适当地液体组分将以不超过30%且优选24或25%存在，以充满空隙间隙，且有小数量留下用于在微粒之间的润滑，以促进移动到紧密填充排列内。增加在浆中液体组分的水平可以改变3D结构的结构，并且为用户提供根据需要修改条件的范围。微粒可以是中空的和在液体中有浮力的。在这种情况下，可以采用更大量的液体组分，使得微粒漂浮且在液体的表面上紧密填充。在接触液体和微粒后，取决于采用的单体，聚合作用以常规方式起始。自由基引发剂或催化剂可以加入液体组分中，以起始或实现聚合作用。在第二个方面，本发明提供了包含多孔聚合物结构的3维多孔聚合结构，任选具有在聚合物的孔内的微粒，并且其中孔具有窄孔径分布。3D结构的多孔聚合物可以是任何无机或有机聚合物。合适聚合物的例子包括聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚苯乙烯-二乙烯基苯、二氧化硅、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚脲、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇、二氧化硅、聚β羟基酯和聚丙烯腈。优选地，在结构中的孔是这样的，使得结构具有在结构中平均孔径的1/10-10倍之间的孔径范围，更优选在1/5-5倍之间，希望地在1/2-2倍之间的平均孔径直径。最佳地，孔径范围是平均孔径直径的75-125%，并且特别是90-110%。适当地，在3D结构中的孔径使用扫描电子显微镜进行测量，尽管根据需要可以采用其他已知方法。在描绘孔径对比在结构内孔径的发生率的曲线图中，已知多孔聚合物将一般显示广泛“钟形”高斯分布，而本发明的结构将显示窄得多的“波峰”，以证实窄孔径分布。3维结构可以在聚合物结构的孔内保留微粒，或在形成聚合物结构后可以去除微粒。在来自组合物的单体聚合后，由于在形成后，聚合物与被组合物占据的空隙空间比较而收缩，形成的聚合物将退出微粒。这种收缩产生在空隙之间的迷宫通道，其可以用于在应用中提供通过聚合物结构的相对一致流动。微粒随后可以任选留在原位以执行进一步功能，或可以去除而留下先前被微粒占据的空间中具有孔的多孔3D结构，所述微粒通过空隙之间的通道连接。在一个优选实施方案中，在本文中可以称为“支架”的3D结构可以包含在大孔结构内诱陷的聚合物微粒或连续聚合物凝胶。备选地，取决于应用，可以使用在孔中没有任何东西的3D结构本身。有利地，本发明提供了以相对廉价的方式产生具有窄孔径分布的新3D结构的方法，并且提供可以适合于在广泛范围的应用中使用的3D结构，具有先前无法达到的化学和物理特征。如本文采用的，术语“聚合物”包括无机聚合物例如二氧化硅，和有机聚合物例如聚苯乙烯。聚合微粒一般可以通过分散体或乳液聚合过程进行，其中在聚合作用起始前，将单体的溶液分散在不能混合的溶剂(连续相)中。形成的聚合物微粒一般随后过滤、洗涤且分类，以分离所需微粒大小分布。如本文采用的，就孔径或多孔性程度或其他方面而言，术语“大孔的”和“超大孔的”不以限制性含义使用。本发明的3D结构是多孔的，并且这个术语的一般性不受术语“大孔的”和“超大孔的”在本文中的使用限制。 微粒可以是能够形成紧密填充排列并且具有相对一致的微粒大小的任何合适材料。在一个优选实施方案中，微粒由玻璃或聚合物预先形成。细胞也可以用作微粒，以限定3D结构的孔径。微粒可以是中空的或实心的。中空玻璃微粒和中空聚合物微粒是许多工业中可广泛获得和常用的，并且具有应用包括路面标志、爆炸物、化妆品和建筑材料。有利地，它们以大规模制造，成本不高且以广泛范围的尺度可获得的，并且具有可接受的物理和化学特征。用于形成3D结构的微粒可以是任何合适材料，但有利地包含廉价的容易获得的材料。3D结构的孔径通过微粒大小指定，并且可以是从亚微米大小到毫米规模，例如O. I μ m-lmm。例如,酵母细胞(酿酒酵母)可以用于生成小孔,例如1_10 μ m,在包被工业中使用的球形蜡颗粒可以用于生成在范围5-50 μ m中略微更大的孔。玻璃和聚合物微粒可以以广泛范围的大小获得，允许所需微粒大小的选择，以产生具有1-500 μ m、特别是10-300 μ m大小的孔。重要考虑是微粒具有窄大小分布，因为这决定3D结构的孔径。本发明还设想了其中采用具有不同微粒大小但各自具有窄微粒大小分布的2种或更多种微粒的3D多孔结构。聚合物结构可以在更大微粒周围形成，并且更小微粒将占据在它们之间的空隙空间或通道中的位置。3D多孔结构可以包含具有更大孔的聚合物结构，其中限定孔自身的聚合物主体也含有更小孔。适当地，本发明的微粒支持物是球形、接近球形或椭圆形的。支持物的球形性质在许多应用中是有利的，并且促进在其周围形成3D结构的更有序紧密填充的形成。然而，可以使用不规则、卵形和其他形状的微粒。存在可获得的许多级别的中空玻璃和中空聚合物微粒，其在外径和内径中不同，即壳的内壁的直径。可获得的微粒大小包括具有在ΙΟμ 区域中的平均直径的小微粒，和具有在200 μ m区域中大得多的平均微粒直径的更大微粒。这些不同级别对于特定应用将是有用的，例如具有在IOym区域中的大小的微粒在用于高压液相色谱法的整体制备中将是有用的，并且具有在200 μ m微粒区域中的大小的微粒在制备用于干细胞培养的3D支架中将是有用的。有利地，当使用中空微粒产生时，3D多孔结构是有浮力的。每个级别的中空微粒的密度是容易控制的，并且通过中空微粒的内径与外径的比改变。这个比越高，最终产物将越不致密且越有浮力。合适的中空玻璃微粒可以例如从Potters Industries Inc, Malvern,Pennsylvania, USA商业获得。合适的中空聚合物微粒可以例如从Akzo Nobel, Expancel,Box 300, S-85013, Sundsvall，瑞典商业获得，并且以商标Expancel 4肖售。W02008/012064描述了包含聚合物浸溃珠的固体支持物，其中珠在其中具有洞并且聚合物放置于洞中。珠完全是实心的并且充当框架，以支持洞中的聚合物。在产生固体支持物中，聚合物被说成在珠上和在洞中形成，并且例如通过磨损去除在珠的外部上的聚合物。在一个进一步的方面，本发明提供了包含在其中具有洞的珠和放置于洞中根据本发明的3D结构的固体支持物。珠完全是实心的并且充当框架，以支持洞中的3D结构。在产生固体支持物中，3D结构可以在珠上和在洞中形成，并且适当地去除在珠的外部上的3D结构。包含根据本发明的3D大孔结构的珠改善对流流动和大量转运。适当地，微粒表面可以共价修饰用于在特定应用中使用。此外，聚合物可以用于包被微粒的外部。聚合物可以与微粒直接或间接共价结合。当微粒由具有活性位点的材料制成时，聚合物可以是直接结合的。当微粒由更惰性的材料例如玻璃制成时，可能希望处理微粒，以提供聚合物可以与之结合的活性位点。当微粒包含玻璃时，它用基于氟化氢的溶液适当地处理，以提供适合于与衍生物反应的活性位点。当微粒包含聚合物时，那么任何合适的化学反应可以用于修饰表面。例如，用氢化铝锂处理基于聚丙烯腈的中空聚合物球将提供在表面上的伯胺功能性。聚合物可以是根据所需应用的任何合适材料。在一个优选实施方案中，聚合物选自一系列聚合物类型，包括但不限于聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚脲、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇、二氧化硅、聚β羟基酯和聚丙烯腈。聚合物可以进一步反应，以提供特定功能性用于给定应用。适当地，聚合物与具有至少2个官能团的化合物反应，一个用于与聚合物反应，并且另一个提供游离功能性用于在所需应用中使用。在一个优选实施方案中，聚合物例如具有N-丙烯酰肌氨酸甲酯的聚二甲基丙烯酰胺和聚丙烯酰吗啉共聚物与二胺化合物例如乙二胺反应。胺官能化的支持物例如适合于在肽合成、寡肽合成、固相有机化学、酶固定化和细胞培养中使用。胺官能化的支持物可以进一步官能化，例如需要时通过使用琥珀酸转换为羧酸。例如，在用于固定化蛋白质例如蛋白质A的制备中，胺官能化的支持物可以用N-羟基琥珀酰亚胺和1_乙基-3_[3-二甲基氨基丙基]-碳化二亚胺(carbodimide)盐酸盐处理。在一个进一步的实施方案中，该支持物包含微粒和其自身为大孔聚合物的聚合物。特别优选的惰性材料是PolyHIPE。PolyHIPE是多孔和高度吸收的。这种材料对于其中材料待通过3D大孔聚合物吸收的应用是特别优选的。在另一个实施方案中，所述支持物包含微粒和其自身为大孔聚合物的聚合物，其中孔通过常规成孔剂形成。这种材料对于其中材料待通过3D大孔聚合物吸收的应用是特别优选的。根据本发明的3D大孔聚合物还可以包含由聚合物支持的功能材料。合适的功能材料的例子包括催化剂、用于肽合成的引发剂物类、药物活性剂、农用化学活性剂、大分子、酶、核酸序列和蛋白质。本发明在支持贵金属催化剂例如钯催化剂中是特别有用的。特别有利的例子是在聚脲上支持的乙酸钯。、
如果优选，那么3D大孔聚合物可以在聚合作用过程中或在聚合作用后与支持物微粒共价连接。备选地，一种或多种组成成分单体可以在聚合作用起始前与微粒表面共价连接本发明的3D大孔聚合物可以用于其中使用固体支持物的任何化学或物理方法中。3D大孔聚合物可以用于涉及导电和发光聚合物的应用中。含有发光聚合物的支持物可以排列在显示板上。3D大孔聚合物对于有机物类特别是大分子的固相合成是特别有用的。在一个优选实施方案中，3D大孔聚合物可以用于肽、寡核苷酸或寡糖的合成中。聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇和聚苯乙烯是在肽的合成中是特别有利的聚合物支持物的例子。在固相合成中，在应用例如肽合成中使用固体聚合微粒的过程一般涉及将微粒悬浮于在多孔过滤板上的合适溶剂中，且轻轻搅拌微粒，以便不在机械上损害微粒。已知微粒是致密的且沉降在常用溶剂中的滤器上。关于微粒的制造过程通常生成细粒，其引起滤板中的堵塞，导致缓慢过滤或者需要替换或清洁滤器。此外，固体微粒的搅拌可以引起破裂，导致生成增大过滤堵塞问题的细粒。在药学和相关工业中，在动态药品生产管理规范(cGMP)下的严格质量管理要求在每批产物后替换滤板，以便避免后续批次被从滤板中移出的材料污染。通过使用比常规采用更简单的设备，根据本发明的3D大孔聚合物简化固相合成。3D大孔聚合物可以以其整体形式用于基于柱的系统中。在这种情况下，形成3D大孔聚合物的聚合物提供用于固相合成的支持物。如果3D大孔聚合物在用于固相合成的常规聚合物支持物周围形成，那么3D大孔聚合物可以是惰性的并且仅提供机械骨架用于支持用于固相合成的常规聚合物。在上述2个例子中，3D大孔聚合物可以如专利W02008/012064中所述装入种子珠(seed beads)内。本发明进一步提供了根据本发明的3D大孔聚合物作为在色谱过程中的整体的用途。在色谱分离中固体支持物或静止相的应用是非常昂贵的，例如在药学和生物技术工业中使用的复杂高技术分离和在采矿工业中使用的更大规模过程。某些药学工业的最有价值药物通过制备型色谱法纯化，并且改善的色谱分离将是技术上有利和经济上有利的。在采矿和贵金属回收工业中，全世界的大部分钯可以使用固定的冠醚进行精炼，所述钯是广泛范围的工业应用和过程包括催化转换器和高价值产品的制造中的关键组分(Traczyk，F. P. ；Bruening, R. L. ；Izatt, N. E. ^TheApplication of Molecular RecognitionTechnologyCMRT)forRemoval and Recovery of Metal Ions from Aqueous Solutions"；In Fortschritte in der Hydrometallurgie ; 1998，Vortrage beim34. MetallurgischenSeminar des Fachaus schus ses fuerMetallurgische Aus—und Weiterbildung derGDMB ；18-20Novemberl998 ;Goslar)。本发明的3D结构可以用于这些应用中。在色谱法或例如肽、寡核苷酸的固相合成中应用的整体柱中，催化剂(化学和生物学的)均匀流动是高度希望的，从而使得当其流经柱时，施加于柱的材料的条带均匀地且以窄条带流动。这种窄条带对于用于分离混合物的组分的色谱分离，对于反应化学是重要的，当条带向下经过柱时，在所述反应化学中试剂可以流经柱以维持在反应点上的高浓度。具有相对窄孔径分布的本发明的3D结构在提供相对均匀的流速中是特别有用的。由于在材料内广泛范围的孔径，已知多孔材料例如polyHIPE在离开色谱柱时产生相对宽的条带，从而使得在较小孔中，条带将具有更曲折的通道，并且在较大孔中，条带将快得多地穿越。在本发明中，由于窄孔径分布，条带以较恒定的速度穿越。JJ van Deemter开发了限定通过含有填充床JJ van Deemter的柱的不同类型流动的等式(van Deemter, J. J, Zuiderweg, F. J. andKlinkenberg, A. Chem. Eng. Sci. , (1956)5，271-289)，并且开发了通过描绘流速对比就条带加宽而言的柱效率，用于设计通过填充床的最佳流速的过程。本发明的3D结构有利地提供了最低限度条带加宽。常规地，色谱柱一般通过下述进行填充在合适溶剂中制备微粒的浆或静止相，并且将其转移到柱内。床在色谱柱中的不均匀沉降可以引起不均匀和甚至裂开的静止相床，导致差的和无法重现的分离。柱通常必须清空且重新填充几次以达到所需性能。这可以是费力的，且导致生产规模操作中的特定缺点的故障时间。本发明的3D大孔聚合物提供了以整体或其他合适介质例如盘形式的用于色谱分离的可重现静止相，其可以直接使用或如专利W02008/012064中所述作为胶囊用于在常规柱中填充。本发明的3D大孔聚合物也可用于固相萃取，以从与支持物接触的液剂中取出物类，无论是以批形式还是作为在3D大孔聚合物上的流，例如离子萃取和离子交换。固相萃取一般在柱中或在具有滤板的系统中执行，用于分离在萃取下的固相与混合物。本文提及的对于固相合成和色谱法观察到的问题可以类似地对于固相萃取观察到。本发明的3D大孔聚合物提供了与在色谱法和固相合成中提供的相似优点。本发明的3D大孔聚合物可以用于固定化物类包括抗体、寡核苷酸、酶、全细胞或荧光素，并且可以置于阵列中，其中阵列中的每种3D大孔聚合物用于测定溶液的不同组分。具有与其表面共价附着的或具有经由聚合物与表面结合的配体的3D大孔聚合物可以用在‘孔’中。随后可以使用已经确定的方法检测靶配体例如抗原或者互补DNA或RNA序列的特异性结合。固定化的酶可以用于执行有机化学反应或用于手性分辨，例如，固定化的青霉素酰胺酶用于分辨仲醇的用途(E. Baldaro等人Tet. Asym. 4，1031, (1993)，和固定化的青霉素G酰胺酶在阿莫西林的制造中也用于水解节基青霉素(Carleysmith,S. W.和Lilly,M.D. . Biotechnol. Bioeng. ,21，1057-73，1979)。本发明的3D结构也用于固定化生物学大分子用于医学和诊断应用。这包括蛋白质、单克隆和多克隆抗体的固定化。细胞培养通常在具有特定表面特征和形态的固体支持物上执行。在微粒中固定化的酶可以用作传感器，以生成信号。例子是通过葡萄糖氧化酶/过氧化物酶偶联的酶系统的葡萄糖检测，其中葡萄糖的存在生成过氧化氢，其进而是过氧化物酶的底物，所述过氧化物酶用于氧化广泛多样的底物，以提供有色、荧光或发光信号。本发明的3D大孔聚合物还可以用于固定化生物催化剂。生物催化剂通常用在柱 中或具有滤板的系统中，用于分离在萃取下的固相与混合物。本文提及的对于固相合成和色谱法观察到的问题可以类似地对于固相萃取观察到。本发明的3D大孔聚合物提供了与在色谱法和固相合成中提供的相似优点。在固体支持物上，常规固定化的生物催化剂例如固定化的酶可以不利地沉降在反应器的基底上，导致生物催化剂与底物的接触减少。本发明的微粒支持物可以以整体或微粒形式使用，以确保生物催化剂的最大限度可用面积保持可用于底物。本发明还设想了具有在相同柱或反应器中2种或更多种不同固定化的生物催化剂或辅因子的系统。在本发明中，一个实体可以固定化在3D大孔聚合物上，并且另一个固定化在用于制备结构的球形微粒上。本发明的3D大孔聚合物在固定化物类中是特别有用的，所述物类包括固相试剂、金属和其他催化剂、生物催化剂 、酶、蛋白质、抗体包括多克隆和单克隆抗体、全细胞和聚合物。本发明在支持酶例如脂肪酶Cal A良好工作中是特别有利的，特别是与聚二甲基丙烯酰胺和其他相似亲水性聚合物组合。脂肪酶Cal B通常用于生物柴油的制造中，并且在疏水性聚合物例如聚苯乙烯支持下良好工作。此外，通过本发明的3D大孔聚合物结构的改善对流流动可以特别适合于粘稠植物油通过基质的流动，并且因此在生物柴油制造中特别有用。本发明在亲和配体例如蛋白质A的固定化中也是特别有用的，所述蛋白质A用于生物药物的工业规模纯化中。在进一步的应用中，本发明的支持物还可以用于化学催化中，例如通过固定化过渡金属催化剂和配体。在再进一步的应用中，本发明可以用于细胞培养中。动物细胞系的大量培养在制造病毒疫苗和生物技术的许多产物中是基础。在动物细胞培养中通过重组DNA技术产生的生物制品包括酶、合成激素、免疫生物制剂(单克隆抗体、白细胞介素、淋巴因子)和抗癌齐U。许多更简单的蛋白质可以使用rDNA在细菌培养中产生；其为糖基化的(碳水化合物修饰的)的更复杂蛋白质目前必须在动物细胞中制备。此类复杂蛋白质的重要例子是激素促红细胞生成素。培养哺乳动物细胞培养物的成本很高，因此公司不断地注意改善技术。细胞可以在悬液中或作为贴壁培养物中进行培养。然而，贴壁细胞需要可以用细胞外基质组分包被的表面，以增加粘附性质且提供生长和分化所需的其他信号。一般地，衍生自固体组织的细胞是贴壁的。器官特征培养涉及在三维环境中培养细胞，与二维培养皿相反。这种3D培养系统在生物化学和生理学上更类似于体内组织，但由于许多因素(例如扩散)，对于维持在技术上具有挑战性。在一个进一步的方面，本发明提供了用于通过简单或复杂性质的细胞或者无细胞系统分泌或排泄的单克隆抗体或其他生物活性分子的连续产生的方法，其中生产单位在根据本发明的3D结构上生长或与根据本发明的3D结构可逆或不可逆地附着。在另一个实施方案中，在形成3D大孔聚合物的微粒之间的空隙空间可以充满另外组分例如细胞培养营养素。在这个例子中，细胞可以在用于形成3D大孔聚合物的聚合物微粒或在3D大孔聚合物本身上培养。适当地，3D结构在保留装置例如套管、盒内包含或浇铸，或者可以形成所需形状和材料，例如以包含营养素或其他活性组分的溶液或蒸汽形式的材料可以与3D结构接触，例如通过经过、越过或通过多孔结构。本发明的3D结构适合于用作用于有机体例如干细胞、器官和骨的生产单位和用于组织工程中。有利地，例如含有分泌或排泄的材料的废弃材料可以被有效去除且不破坏、损害或限制生产单位的效率。适当地，保留装置是不渗透、半渗透或可渗透的，以允许活性组分和废弃材料的引入和去除。
本发明的3D结构还可以用于过程中用于产生包含3D结构的基质的2种或更多种成形表面。适当地，基质可以包含相同或不同聚合物，并且优选地浇铸或挤出成所需形状。基质适当地具有相似或不同孔径、孔径的分级或空间上分隔的孔径。人或非人其起源的细胞或者无细胞组分可以以邻近、邻接或空间上分隔的方式接种到一个或所有表面上。所述方法意在通过任何生物化学或形态学方法研究细胞作为个体或群体的生物学、生物化学和生物物理学特征，及其相互作用。本发明还提供了 3D结构作为构建体用于细胞培养和再生医学的用途。本发明允许制备组织，以便修复或替换现有器官或身体部分，例如修复损害肌肉，以生长整个人器官例如肾和心脏，以及替换骨。本发明的3D结构提供了在其中生长和分化细胞的超大孔结构。3D结构中的窄孔径分布使得细胞、营养素和废物通过结构的相对均匀流动成为可能。使用合适大小微粒允 许用户根据具体应用确定遍布3D结构的孔径。例如，骨在其整个长度各处是不均匀的，并且使用2种或更多种不同大小的微粒使得能够修改3D结构，每种不同大小的微粒具有窄微粒大小分布，以提供不同密度或多孔性的骨以模拟原始骨结构。本发明的3D结构也可以用于其他生物学应用中，包括作为浇铸或挤出基质的用途，用于在负或正压下收集空气传播的生物。3D结构对于作为生物传感器的芯片和/或光导纤维的应用，和用于作为定制模塑在伤口或烧伤处理，惰性表面伤口 /烧伤，例如关于手指、臂、足的保护/封闭中的用途；兽医学用途，关于治疗试剂例如局部杀菌剂、抗生素、抗真菌制剂通过封闭的局部应用，且允许空气的交换。本文描述的本发明允许比先前对于组织工程可以达到的更精确控制的孔结构、孔体积、孔连接性和孔尺度。该方法允许以实际上任何聚合物制造3D结构，所述聚合物包括生物可降解的、生物相容的、有机的或无机的。当产生大于100 μ m的孔时，这些3D大孔聚合物结构通常称为超大孔的，其顺应在静止和对流条件下的快速细胞和营养素迁移。本发明的3D大孔聚合物结构可以以几乎任何形状或大小制造或浇铸，并且因此提供用于再生医学的重要支架。在一个进一步的方面，本发明因此提供了根据本发明的3D大孔聚合物在孔的表面上或在用于产生孔的球形微粒的表面上培养细胞的用途。适当地，干细胞可以在本发明的微粒支持物上培养，以减少不受控制的分化和控制需要的分化。微粒支持物的处理特征以及3D大孔聚合物的表面区域和孔直径的高利用在这种应用中是有利的。本发明在医学诊断测试例如免疫测定中是特别有用的。相应地，本发明进一步提供了用于检测化合物的存在的医学诊断剂，其包含根据本发明的微粒支持物和由在支持物中的聚合物支持的功能材料例如酶，例如辣根过氧化物酶，用于与待检测的化合物选择性反应或结合。许多医学诊断依赖于固体支持物以固定化多种诊断配体。本发明的3D大孔聚合物可以用于其中固相的物理分离通过液相的医学诊断操作步骤中。在进一步的应用中，3D大孔聚合物可以用作吸收剂。在这个应用中，如果3D大孔聚合物是惰性、吸收性材料，那么它是特别有利的。PolyHIPE是特别优选的惰性材料。3D大孔聚合物可以用于吸收家庭溢出物例如茶、咖啡和酒，或者可以用于更大规模的应用中，例如以吸收来自溢出的油。吸收性支持物可以用于吸收溢出物且随后物理去除，或在水体中的油溢出物的情况下，有效地捕获油且将油保留在有浮力的团块中用于收集和处置。本发明的3D大孔聚合物可以用作载体，以携带经过一段时间释放的化合物，例如药学或农用化学化合物或组合物。这种用途提供了根据化合物在支持物中的装载修改化合物的给药方案的方法。在药物的情况下，这在帮助活性剂的正确剂量是有利的，例如具有连续缓慢释放而不是要求患者服用定期大剂量，例如在化学治疗中。本发明通过参考实施例和伴随扫描电子显微镜照片(SEM’ s)进行举例说明。这些参考列出的实施例。
实施例实施例IExpancel 920DEX 80d30装入聚丙摇酉先胺中将亚甲基-二-丙烯酰胺(MBA) (123mg,0. 8mmol)伴随加温溶解于N, N-二甲基甲酰胺(DMF) (I. 26cm3)中。将这种溶液冷却至室温，并且加入2- (二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯(DMAEM) (O. 43cm\0. 55mmol)、丙烯酰胺(2. 02g、28. 5mmol )、四亚甲基乙二胺(TEMEDA) (O. 006cm\0. 05mmol)和水。将混合物搅动直至所有组分溶解。在加入过硫酸铵溶液(O. 285cm3的I % w/v)起始聚合作用前,加入Expancel 920DEX80d 30 (80μηι聚丙烯腈气球)(150mg，10cm3)，且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘。放置使聚合作用在室温过夜完成，随后在冷冻干燥前用水充分洗涤。产物的扫描电子显微镜照片(SEM)显不于图I中。实施例2聚丙烯酸的制备将亚甲基-二-丙烯酰胺(MBA) (240mg, I. 55mmol)伴随加温溶解于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF) (2. 5cm3)中。将这种溶液冷却至室温，并且加入2- (二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯(DMAEM) (O. 43cm3、0. 55mmol)、丙烯酰胺(I. 9g，26. 8mmol)、四亚甲基乙二胺(TEMEDA)(O. 006cm\0. 05mmol)和水。将混合物搅动直至所有组分溶解。在加入过硫酸铵溶液(O. 285cm3的I % w/v)起始聚合作用前,加入Expancel 920DEX80d 30 (80μηι聚丙烯腈气球)(150mg，10cm3)，且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘。放置使聚合作用在室温过夜完成。将上文制备的几个盘在80_100°C用水性氢氧化钠(20% w/v)处理，直至聚合物基质变得澄清。在冷冻干燥前，将盘用稀盐酸(lmol/dm3)和水充分洗涤。产物的SEM显示于图2中。实施例3聚苯乙烯-二乙烯基苯的制备将1，4_ 二乙稀基苯(DVB) (4. 6cm3,43mmol)、苯乙稀(O. 92cm3,8. 85mmol)和1，I-偶氮双(环己腈)(IOOmg)加入 Expancel 920DEX80d 30 (150mg，IOcm3)中，且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘。放置使聚合作用在80°C过夜完成。将盘用二乙醚充分洗涤且风干。在用二乙醚充分洗涤且风干前，将上文制备的几个盘在80-100°C用DMF处理数小时。产物的SEM显示于图3中。实施例4装入聚苯乙烯-二乙烯基苯中的聚二甲基丙烯酿胺微粒将1，4_ 二乙稀基苯(DVB) (O. 934cm3,8. 7mmol)、苯乙稀(O. 19cm3,1. 83mmo I)、甲苯(Icm3)和 1，I-偶氣双(环己臆)(50mg)加入 Expancel920DEX 80d 30 (150mg, IOcm3)中,且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘，并且放置使聚合作用在80°C过夜完成。将盘用二乙醚充分洗涤且风干。在用二乙醚充分洗涤且风干前，将上文制备的几个盘在80-100°C用DMF处理数小时。实施例5聚苯乙烯-二乙烯某苯的制各将1，4_ 二乙稀基苯(DVB) (I. 63cm3,15mmoI)> 苯乙稀(O. 92cm3, 5. 4mmo1 )、甲苯(I. 9cm3)和1，I-偶氮双(环己腈)(15mg)加入Q-Cel 300 ( 80μηι中空玻璃球)(300mg)中。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘，并且放置使聚合作用在100°c进行2. 5小时，以过夜完成。将盘用二氯甲烷充分洗涤且风干。 产物的SEM显示于图4中。实施例6 二氧化硅的制备将四甲氧基正娃烧(Tetramethoxyorthosilane,TM0S) (2. 5cm3)和 3_ 氨丙基-三甲氧基硅烷(APTS) (0.0250113)加入乙醇-水(50113，95:5￥八)中，且充分混合。将这种混合物加入Expancel 920DEX 80d30 (200mg，13cm3)，且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘，并且放置使聚合作用在50°C进行数小时。将盘用DMF处理超过 60小时，随后在冷冻干燥前用水充分洗涤。产物的SEM显示于图5和6中。实施例7含二氧化硅的中空玻璃球的制备将TMOS (2. 5cm3)和 APTS (O. 025cm3)加入乙醇-水(2. 5cm3，95: 5v/v)中，且充分混合。将这种混合物加入Q-Cel 7014 ( 100 μ m中空玻璃球)中，且充分混合。将混合物在特氟隆模子中浇铸成盘，并且放置使聚合作用在50°C进行48小时。在冷冻干燥前，将盘用水充分洗涤。产物的SEM显示于图7中。实施例8装入玻璃种子珠内的含聚丙烯酰胺的中空聚丙烯腈球将亚甲基-二-丙烯酰胺(MBA) (24011^，1.55臟01)伴随加温溶解于队^二甲基甲酰胺(DMF) (2. 5cm3)中。将这种溶液冷却至室温，并且加入2- (二甲氨基)甲基丙烯酸乙酯(DMAEM) (O. 43cm3、0. 55mmol)、丙烯酰胺(I. 9g，26. 8mmol)、四亚甲基乙二胺(TEMEDA)(O. 006cm\0. 05mmol)和水。将混合物在圆底烧瓶中搅动直至所有组分溶解。在加入过硫酸铵溶液(O. 285cm3l % w/v)起始聚合作用前,加入Expancel 920DEX 80d 30 (80 μ m聚丙烯腈气球)(150mg, IOcm3),且充分混合。将Imm直径玻璃种子珠(30cm3)加入混合物中，并且将烧瓶立即抽成真空，以将聚合作用混合物抽取到种子珠内。放置使聚合作用在室温过夜完成。将种子珠用水充分洗涤，并且通过磨损去除在珠的表面上的任何聚合物。将水润湿的珠冷冻干燥。产物的SEM显示于图8中。实施例9实施例2中制备的盘的切片用于培养人胚胎干细胞。将细胞群体应用于盘且用常规营养素饲养。干细胞繁殖且传播遍及3D结构，从而使得干细胞在3D结构的孔内产生。
权利要求
1.一种3维多孔聚合结构，其包含多孔聚合物结构，任选具有在所述聚合物的孔内的微粒，并且其中所述孔具有窄孔径分布。
2.根据权利要求I的结构，其中所述多孔聚合物选自聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚苯乙烯-二乙烯基苯、二氧化硅、聚苯乙烯、纤维素、琼脂糖、聚二甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚脲、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇、聚P羟基酯和聚丙烯腈、聚亚烷基二醇和polyHIPE。
3.根据权利要求I或权利要求2的结构，其中 所述结构中的所述孔是这样的，使得所述结构具有在所述结构中平均孔径的1/10-10倍之间的孔径范围。
4.根据权利要求3的结构，其中所述孔径范围是平均孔径直径的75-125%。
5.根据前述权利要求中任一项的结构，其包含在所述结构的所述孔内的微粒。
6.根据权利要求5的结构，其中所述微粒选自细胞以及选自玻璃、陶瓷、聚合物、天然产物和金属的材料。
7.根据权利要求5或权利要求6的结构，其中所述微粒是中空的。
8.根据权利要求5-7中任一项的结构，其中所述微粒是球形或椭圆形的。
9.根据权利要求5-8中任一项的结构，其中所述微粒是中空玻璃球、中空聚合物球、酵母细胞或腊球。
10.根据权利要求5-9中任一项的结构，其中所述微粒其中所述微粒包含中空聚合物，并且具有用于与衍生物反应的活性位点用于与所述多孔聚合物连接。
11.根据前述权利要求中任一项的结构，其进一步包含由所述聚合物支持的功能材料，其选自催化剂、用于肽合成的引发剂物类、用于寡核苷酸合成的引发剂物类、用于固相有机合成的引发剂物类、酶、药物活性剂、农用化学活性剂、蛋白质或其他生物学大分子或全细胞。
12.—种用于产生3维多孔结构的方法，其包括在区中紧密填充微粒以提供所述微粒的3维阵列，使可聚合的单体或单体溶液与所述阵列接触，从而使得所述单体或所述溶液充满在所述微粒之间的空隙空间，并且实现所述单体的聚合作用，由此在所述微粒周围形成聚合物结构，且任选从所述结构中去除所述微粒。
13.根据权利要求12的方法，其包括在包含单体的液体中形成微粒的浆和使所述单体聚合的步骤。
14.根据权利要求1-11中任一项的3维多孔结构在选自下述的方法中的用途选自肽、寡核苷酸、寡糖的物类的固相合成；固相萃取；固相有机化学；选自固相试剂、金属和其他催化剂、生物催化剂、酶、蛋白质、抗体包括多克隆和单克隆抗体、全细胞和聚合物的物类的固定化；细胞培养；用于色谱分离的静止相的制备；或用于用作吸收剂；或用于用作绝缘材料或用在组织再生中。
15.根据权利要求1-11中任一项的3维多孔结构在通过细胞或无细胞系统分泌或排泄的单克隆抗体或其他生物活性分子的连续产生的方法中的用途，其中所述细胞或无细胞系统在所述3D结构上生长或者以其他方式与所述3D结构可逆或不可逆地附着。
16.根据权利要求1-11中任一项的3维多孔结构作为用于有机体的生产单位的用途。
17.根据权利要求16的用途，其中所述有机体选自干细胞、器官和骨。
全文摘要
三维多孔聚合结构，其包含多孔聚合物结构，任选具有在聚合物的孔内的微粒，并且其中孔具有窄孔径分布。该结构可以通过下述进行制备在区中紧密填充微粒以提供微粒的三维阵列，使可聚合的单体与阵列接触，从而使得组合物充满在微粒之间的空隙空间，并且实现单体的聚合作用，由此在微粒周围形成聚合物结构，且任选从结构中去除微粒。三维多孔结构可以用于固相合成、固定化、细胞培养和用于色谱分离的静止相的制备、用作吸收剂、绝缘材料或用在组织再生中。
文档编号C12N5/00GK102630240SQ201080050390
公开日2012年8月8日 申请日期2010年9月16日 优先权日2009年9月16日
发明者D·A·韦林斯 申请人:斯菲瑞技术有限公司