专利名称：包含末端取代的sirna化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及经修饰的SiRNA化合物、包含其的药物组合物以及使用其抑制基因表达的方法。所述化合物和組合物展现有利的特性(包括敲低靶标基因表达的活性)，且用于治疗罹患在其中基因表达具有不利影响的疾病或病况和/或与此疾病或病况相关的症状或有患上该疾病或病况的风险的受试者。
背景技术：
本发明受让人的PCT专利公布No. W02008/104978及W02009/044392中公开新的 siRNA结构，所述专利以全文引用的方式并入本文中。仍需要展现增强的敲低基因表达的活性、提高的稳定性和/或降低的脱靶效应的活性且有效的siRNA治疗剂。发明概述本文所公开的双链RNA(dsRNA)化合物具有可例如增强活性、提高稳定性、降低免疫原性、增强对RISC复合物的负载和/或使毒性最小的结构及修饰；siRNA的新修饰可有利地应用于用于阻止或削弱靶标基因表达的双链RNA。本文提供用于下调基因表达的双链(双链体)寡核苷酸化合物。本发明在某种程度上基于如下意外的观测结果包含有义链及互补反义链且在反义链的5’端核苷酸与靶标RNA的核苷酸之间具有错配的双链核酸分子显示有效下调靶标基因的活性。在优选实施方案中，dsRNA包含在反义链的位置1(5’端)上取代而替代胞苷或鸟嘌呤的腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或胸苷。根据一方面，提供具有下述所列结构(A)的经修饰的双链核酸分子(A) 5，N1-(N)x-Z3，(反义链)3，Z，-N2-(N，)y_z，，5，(有义链)其中N2、N及N’各自为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分；其中(N)X及(N’)y各自为寡核苷酸，其中每个连续N或N’通过共价键与相邻N 或N’连接；其中χ及y各自独立地为17至39的整数；其中(N，)y的序列与(N)x的序列互补，且(N)X与靶标RNA中的连续序列互补；其中N1与(N) χ共价结合，且与靶标RNA错配或为与靶标RNA互补的DNA部分；其中N1选自由天然或经修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷組成的组的部分；其中ζ”可存在或不存在，但若存在，则为共价连接于N2-(N’ )y的5’端的加帽部分；及其中Z及Z’各自独立地存在或不存在，但若存在，则独立地为共价连接于其所存在的所述链的3’端的1-5个连续核苷酸、连续非核苷酸部分或其組合。在一些实施方案中，(N’ )y的序列与(N)X的序列完全互补。在各种实施方案中， N2-(N')y的序列与N1-(N)x的序列互补。在一些实施方案中，(N)x包含与靶标RNA中的约 17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。在其它实施方案中，(N)x包含与靶标RNA 中的约17至约39个连续核苷酸实质上互补的反义序列。在一些实施方案中，N1和N2形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。在ー些实施方案中，N1与N2形成非沃森-克里克碱基对。在一些实施方案中，碱基对在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间形成。在一些实施方案中，χ = y = 18，x = y = 19或χ = y = 20。在优选实施方案中， χ = y = 18。在一些实施方案中，N1与(N)x共价结合且与靶标RNA错配。在各种实施方案中， N1与(N) χ共价结合且为与靶标RNA互补的DNA部分。在一些实施方案中，处于反义链的位置1的尿苷经选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在各种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，处于反义链的位置1的鸟苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在各种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，处于反义链的位置1的胞苷经选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在各种实施方案中，N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，处于反义链的位置1的腺苷经选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷的N1取代。在各种实施方案中，N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。在一些实施方案中，N1与N2形成介于尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间的碱基对。在其它实施方案中，N1与N2形成介于脱氧尿苷与腺苷之间的碱基对。在一些实施方案中，双链核酸分子为siRNA、siNA或miRNA。
下表提供附及对应N2的实例。
权利要求
1.一种双链核酸分子，其具有下述所列结构(A) (A) 5，N1-(N)x-Z3，(反义链)3，Z，-N2-(N' )y-z”5，(有义链) 其中N2、N及N’各自为未经修饰或经修饰的核糖核苷酸或非常规部分； 其中(N)x及(N’)y各自为寡核苷酸，其中每个连续N或N’通过共价键与所述相邻N 或N’连接；其中χ及y各自独立地为17至39的整数；其中(N，)y的序列与(N)x的序列互补，且(N)x与靶标RNA中的连续序列互补； 其中N1与(N) χ共价结合，且与所述靶标RNA错配或为与所述靶标RNA互补的DNA核苷酸；其中N1选自由天然或经修饰的尿苷、脱氧核糖尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷或脱氧腺苷組成的组的部分；其中ζ”可存在或不存在，但若存在，则为共价连接于N2-(N’)y的5’端的加帽部分；及其中Z及Ζ’各自独立地存在或不存在，但若存在，则独立地为共价连接于其所存在的所述链的3’端的1-5个连续核苷酸、连续非核苷酸部分或其組合。
2.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N’)y的所述序列与(N)x的所述序列完全互补。
3.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N2-(N’)y的所述序列与N1-(N)x的所述序列互补。
4.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N)χ包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸完全互补的反义序列。
5.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中(N)χ包含与靶标RNA中的约17至约39个连续核苷酸实质上互补的反义序列。
6.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N1和N2形成沃森-克里克碱基对。
7.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中N1与N2形成非沃森-克里克碱基对。
8.如权利要求1至7中任一项所述的双链核酸分子，其中χ= y = 18，x = y = 19或 χ = y = 20。
9.如权利要求8所述的双链核酸分子，其中χ= y = 18。
10.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1与(N)x共价结合且与所述靶标RNA错配。
11.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1与(N)x共价结合且为与所述靶标RNA互补的DNA部分。
12.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为腺苷。
13.如权利要求12所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷或脱氧尿苷。
14.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为胸苷。
15.如权利要求14所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
16.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷、脱氧尿苷、核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为鸟苷。
17.如权利要求16所述的双链核酸分子，其中N1选自腺苷、脱氧腺苷、尿苷或脱氧尿苷。
18.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1选自脱氧腺苷、脱氧尿苷、 核糖胸苷或脱氧胸苷，且其中所述靶标RNA中所述配对核苷酸中的核苷酸为尿苷。
19.如权利要求18所述的双链核酸分子，其中N1选自脱氧腺苷或脱氧尿苷。
20.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1与N2形成尿苷或脱氧尿苷与腺苷或脱氧腺苷之间的碱基对。
21.如权利要求1至9中任一项所述的双链核酸分子，其中N1与N2形成介于脱氧尿苷与腺苷之间的碱基对。
22.如权利要求1至21中任一项所述的双链核酸分子，其中ζ”存在。
23.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z及Z’不存在。
24.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z或Z’中的ー个存在。
25.如权利要求1至22中任一项所述的双链核酸分子，其中Z或Z’包含非核苷酸部分。
26.如权利要求1至25中任一项所述的双链核酸分子，其中N或N’中的至少ー个包含经2' OMe糖修饰的核糖核苷酸。
27.如权利要求沈所述的双链核酸分子，其中N包含単一交替的未经修饰的核糖核苷酸与2’ OMe糖修饰的核糖核苷酸。
28.如权利要求1至27中任一项所述的双链核酸分子，其中N2包含2’OMe糖修饰的核糖核苷酸。
29.如权利要求1至观中任一项所述的双链核酸分子，其中所述双链核酸分子为 siRNA、siNA 或 miRNA。
30.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中χ= y = 18，Z’不存在，Z存在且包含两个彼此经由磷酸ニ酯键共价连接的烷基部分，N2包含腺苷且N1包含尿苷。
31.如权利要求1所述的双链核酸分子，其中χ= y = 18，Z’不存在，Z存在且包含两个彼此经由磷酸ニ酯键共价连接的烷基部分，N2包含尿苷或脱氧尿苷且N1包含腺苷。
32.如权利要求1至31中任一项所述的双链核酸分子，其中所述靶标mRNA为哺乳动物基因的mRNA。
33.如权利要求32所述的双链核酸分子，其中所述靶标mRNA为人基因的mRNA。
34.如权利要求1至33中任一项所述的双链核酸分子，其用于治疗。
35.一种药物組合物，其包含至少ー种如权利要求1至34中任一项所述的双链核酸分子；及药学上可接受的载体。
36.一种用于治疗或预防有需要的受试者中疾病或病况的发生或严重度的方法，其包括以有效地预防或治疗或延迟疾病或病况的发生或严重度的量向所述受试者施用权利要求1至33中任一项所述的双链核酸分子或权利要求35所述的药物組合物，其中所述疾病或病况和/或与其相关的症状选自由以下組成的組听カ丧失；急性肾衰竭(ARF)；肾移植后移植肾功能延迟恢复(DGF)；青光眼；眼缺血性病况，包括非动脉炎性缺血性视神经病变 (NAION)、前部缺血性视神经病变、年龄相关的黄斑变性(AMD)、缺血性视神经病变(ION)及干眼综合症；急性呼吸窘迫综合症(ARDS)及其它急性肺及呼吸道损伤；慢性阻塞性肺病 (COPD)；原发性移植失败；缺血再灌注损伤；再灌注损伤；再灌注水肿；同种异体移植物功能障碍；器官移植、尤其肺移植后肺再植入反应和/或原发性移植物功能障碍(PGD)；器官移植，包括肺、肝、心脏、胰脏及肾移植；肾毒性及神经毒性；脊髓损伤；脑损伤；神经退行性疾病或病况；褥疮；口腔粘膜炎；纤维变性病症及癌症。
37.一种产生由有义链及反义链组成的双链siRNA分子的方法，其包括以下步骤a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与所述靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中所述反义链的5’端核苷酸经尿苷、经修饰的尿苷、核糖胸苷、脱氧核糖胸苷、腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代，其限制条件为rG:rU链寡核苷酸及所述靶标mRNA的3’端核苷酸。b)合成与所述反义链互补的具有17至25个核苷酸的有义链，其中所述有义链的3’端核苷酸与所述反义链的5’端核苷酸形成沃森-克里克碱基对；及c)使所述有义链与反义链退火；从而产生双链RNA分子。
38.一种产生由有义链及反义链组成且在与未经修饰的siRNA双链体比较时展现增强的RNAi活性的经修饰的siRNA双链体的方法，其包括以下步骤a)选择靶标RNA中的连续17至25个核苷酸的序列且合成包含与所述靶标mRNA的连续17至25个核苷酸的序列的互补性的反义链，其中所述3’端核苷酸经腺苷、经修饰的腺苷、脱氧腺苷或经修饰的脱氧腺苷取代；b)合成与所述反义链互补的具有17至25个核苷酸的有义链，其中所述反义链的5’端核苷酸包含核糖尿苷、经修饰的核糖尿苷、脱氧核糖尿苷或经修饰的脱氧核糖尿苷且与所述过客链的3’端核苷酸形成碱基对；c)使有义链与反义链退火；从而产生具有增强的RNAi活性的siRNA双链体。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述3’端核苷酸不为腺苷。
全文摘要
本发明涉及下调靶标基因表达的经修饰的siRNA化合物、包含该化合物的药物组合物以及治疗和/或预防与所述基因相关的各种疾病或病况和/或与该疾病或病况相关的症状的发生或严重度的方法。
文档编号C12N15/113GK102597239SQ201080049901
公开日2012年7月18日 申请日期2010年11月25日 优先权日2009年11月26日
发明者莎伦·阿夫金-纳祖姆 申请人:夸克医药公司