专利名称：用于在植物根部调节基因表达的启动子的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及植物分子生物学领域以及植物中基因表达的调节。本发明披露了来自玉蜀黍(玉米)的核苷酸序列，这些核苷酸序列包括一个调节元件，例如启动子。更具体地，本发明涉及植物根部对根冠具有特异性的基因表达的调节。发明背景
操纵作物植物以改变和/或改进表型特性(例如产率或品质)要求在植物组织中表达异源基因。此类遗传操纵由于两个发现而成为可能将异源遗传材料转化到植物细胞中的能力，以及存在能够促进该异源遗传材料表达的启动子。有利的是拥有各种不同的启动子选择，以便在转基因植物中给出所希望的效果。可以选择适当的启动子用于特定的基因、构建体、细胞、组织、植物或环境。对植物转基因表达有用的启动子包括以下类型可诱导型、病毒型、合成型、组成型(Odell etal. ,1985, Nature 313:810-812;Granger & Cyr, 2001, Plant Cell Repo. 20:227-234),时间性调节型、空间性调节型、组织特异型以及时空调节型的启动子(KuhIemeier etal. 1987, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mo I. Biol. 38:221-257)。来自细菌、真菌、病毒以及植物的启动子已经用于控制植物细胞中的基因表达。启动子由该启动子全部功能所必须的几个区域构成。这些区域中有一些是模块式的，换言之它们可以用于分离以给予启动子活性或者它们可以与其他元件进行组装以构建新的启动子。这些启动子区域中的第一个紧靠在编码序列的上游，并且形成“核心启动子区域”，该区域包含几个共有序列，通常是紧接在编码序列上游的20-70个碱基对。核心启动子区域包括一个TATA盒,并且通常包括一个起始子元件和一个起始位点。核心启动子区域的精确长度不是固定的，但通常很好识别。这种区域通常存在于大部分启动子中，并且有一些变异。存在于不同的表征良好的元件之间的碱基序列似乎不太重要。核心启动子区域通常是指一个最小启动子区域，因为它本身具有功能可以启动基线水平的转录。这种核心启动子区域的存在将一个序列定义为启动子。如果该区域不存在，则该启动子没有功能。该核心区域发挥作用使该启动子使用通用转录机制进行转录起始。然而，该核心启动子区域不足以提供全部的启动子活性。一系列调节序列(通常位于该核心的上游)构成了该启动子的剩余部分。这些调节序列决定了表达水平、表达的空间与时间形式、以及一个子集启动子在诱导条件下(通过诸如光线、温度、化学物质以及激素等外部因素调节)的表达。调节序列可以是6-100个碱基对的短DNA序列区域，这些区域限定了反式作用因子(例如转录因子)的结合位点。调节序列还可以是增强子，与该核心启动子区域具有一定距离时(有时距离该核心区域超过数千个碱基)能发挥作用的较长的DNA序列区域。调节序列的活性可以受到反式作用因子的影响，这些因子包括通用转录机制、转录因子以及染色体组装因子。通常，希望的是感兴趣的基因在植物中具有组织特异性表达。组织特异型启动子专门启动一组组织的表达，而不是整个植株的表达；组织偏好型启动子促进一个子集组织的较高水平的表达，而该表达在该植物的其他组织中是显著较低的。例如，可能希望的是仅在玉米种子中而非该植物的其余部分表达一个增值产物。另一个例子是通过组织特异性消除来产生雄性不育。在这种情况下，表达只限于根部，更具体地是根冠。农业生物技术中有很多方面使用并要求组织特异性表达。玉米根冠可以由多达10，000个细胞构成。这些帽细胞起源于分生组织，它的作用仅是产生新的帽细胞。分生组织具有约12小时的细胞周期。细胞由分生组织产生之后，经过根冠并最终溶解成为黏胶。玉蜀黍的根冠细胞从分生组织到成为黏胶这一过程花费五到八天。依据根尖的结构，分生组织已被分为开放的或封闭的。玉蜀黍具有封闭的根系统，这意味着细胞列在根锥顶点会合，这使得可以清晰地分辨根部的不同部分。这是相对于开放的根系统而言的，开放的根系统在根本身与根冠之间没有单独的边界，使得很难追踪细胞列((Lim The Plant Cell 12:1307-1318 (2000) )0玉蜀黍的根系统与草的根系统相似，由发育过程中在不同阶段与位置形成的不同类型的根构成。胚胎发生时，形成主根和侧根。胚后发育时，冠根以及支持/支柱根由茎组织产生。 这提供了在植物根部表达所选择的基因时需要启动子的一个重要例子。这种植物的根由许多细胞类型构成，例如表皮、根冠、囊轴、皮层、中柱鞘、维管以及形成生毛细胞的根毛，它们组织成根的组织或区域，例如根尖、根表皮、分生组织区、主根、侧根、根毛以及维管组织。分离成根特异性或根偏好性的启动子可以偏向在这些细胞类型的一个或一些类型中启动表达。这种细胞特异性的活性可用于特定应用，例如仅在分生组织细胞区调节分生组织的活性，或仅在线虫害虫接触的细胞类型中调节一个杀线虫基因的表达。在其他情况中，更广泛的细胞类型特异性是所希望的，以便在整个根组织表达感兴趣的基因。这可用于表达一种杀虫基因来控制一种以植物根为食的害虫，例如玉米根虫(根萤叶甲属)。根冠特异性可以通过以下方式实现使用一种单一的具有广泛细胞类型特异性的根特异性启动子、或通过使用两个或多个具有不同细胞类型表达特异性的根特异性或根偏好性的启动子。有限数量的根偏好性启动子以及根特异性启动子的例子已经进行说明。这些例子包括来自普通烟草的RB7启动子(美国专利号5，459，252和5，750，386 )、来自拟南芥的ARSKl启动子(Hwang and Goodman (1995)Plant J 8:37-43)、来自玉蜀黍的MR7启动子(美国专利号5，837，848)、玉蜀黍的ZRP2启动子(美国专利号5，633，363)以及来自玉蜀黍的MTL启动子(美国专利号5，466，785和6，018，099)。这些例子中有很多披露了表达模式限定于有限数量的根组织的启动子。其他启动子不能提供表达已选基因所需要的根特异性。因此，在本领域内存在着用于分离并鉴定新的根启动子的需要，以便获得具有不同广度、表达水平和细胞类型表达特异性的启动子用于根特异性与根偏好性表达，特别是根冠特异性表达。发明概述在本发明中，提供了用于在转基因植物中指导根冠特异表达的组合物和方法。尤其是，提供了一种从玉蜀黍中分离的新颖的核酸分子，该分子促进异源基因以根冠特异的方式在植物中表达。本发明还涉及多种表达盒和载体，它们包括本发明的新颖的核酸分子，该核酸分子可操作地连接至异源编码序列。本发明还涉及包括本发明表达盒的转基因植物。本发明还提供了以下方法，这些方法用于在转基因植物的根部特异性地表达一种异源编码序列，用于分离一种根特异性cDNA、用于分离一种可用于指导根特异性表达的核酸分子并且用于分离一种根特异性启动子。本发明还提供了多种引物和核苷酸探针以便从其他植物基因组中鉴定相关的核苷酸序列，这些序列指导根冠特异性转录或根冠偏好性转录。根据ー个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，该分子编码了ー种能够在植物中指导根冠特异性转录的启动子，其中该启动子的核苷酸序列包括在SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列。根据ー个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，该分子编码了ー种能够在植物中指导根冠特异性转录的启动子，其中该启动子的核苷酸序列包括在SEQ ID N0:2中给出的核苷酸序列。SEQ ID N0:2是SEQ ID NO: I的截短形式。本发明还提供了 ー个表达盒，该表达盒包括本发明的可操作地连接至ー个异源编码序列的核酸分子。一方面，该表达盒包括ー个异源编码序列，该序列选自下组，其构成为杀虫编码序列、杀线虫编码序列、除草剂耐受编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物胁迫耐受编码序列、营养品质编码序列、可见标记编码序列以及选择标记编码序列。在另ー个实施方案中，该表达盒包括ー个杀虫编码序列，该序列编码了有效抵抗一种鞘翅目害虫的毒素。在这个实施方案的ー个方面，该鞘翅目害虫是根萤叶 甲属的ー个物种。在又另ー个实施方案中，该表达盒包括ー个非生物胁迫耐受性编码序列，该胁迫包括但不限于干旱胁迫、营养胁迫、盐胁迫、水胁迫以及重金属胁迫。在又另ー个实施方案中，该表达盒包括ー种可见标记编码序列，该可见标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、葡萄糖醛酸酶(⑶S)以及萤光素莓(LUC)。在又另ー个实施方案中，该表达盒包括一个选择标记编码序列，该选择标记包括但不限于磷酸甘露糖异构酶(PMI)，ー种抗生素抗性基因例如潮霉素、卡那霉素以及类似物，ー种除草剂耐受性基因例如草丁膦(PAT)、芽孢杆菌RNA酶(BAR)、EPSPS, GAT以及类似物。本发明还提供了ー种包括本发明的表达盒的重组载体。在这个实施方案的ー个方面，该重组载体是ー个质粒。此外，本发明提供了ー种转基因的非人类宿主细胞，该细胞包括本发明的表达盒。根据本发明的这一方面的转基因宿主细胞优选地是ー种植物细胞。此外，本发明提供了一种包括这种转基因植物细胞的转基因植物。根据本发明的这一方面的转基因植物可以是高梁、小麦、向日葵、番茄、马铃薯、甘蓝类蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜以及玉米，优选玉米。此外，本发明提供了选自下组的转基因植物的转基因种子，该组的构成为高粱、小麦、向日葵、番茄、甘蓝类蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜以及玉米。在本发明的一个实施方案中，该转基因种子来自ー种转基因玉米植物。另ー方面，本发明提供了在本发明的ー种核酸分子的转录控制下在转基因植物根部特异性地表达ー个异源编码序列的方法，包括(a)使用ー种载体转化植物细胞，其中该载体包括本发明的可操作地连接至ー个异源编码序列的核酸分子，(b)使包含该载体的转基因植物细胞生长，并且(C)从这些已转化的植物细胞产生转基因植物，其中该异源编码序列在本发明的ー种核酸分子的控制下特异地表达于植物根部。在这一方面的一个实施方案中，该转基因植物是ー种玉米植物或水稻植物。在这一方面的另ー个实施方案中，该异源编码序列是选自下组，其构成为杀虫编码序列、杀线虫编码序列、除草剂耐受编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物胁迫耐受编码序列、营养品质编码序列、可见标记编码序列以及选择标记编码序列。在又另ー个实施方案中，本发明提供了根据这一方面所产生的转基因植物。在另ー个实施方案中，这些转基因植物是玉米植物或水稻植物。由本发明提供的还有以下核苷酸引物，这些引物包含SEQ ID N0S: 1-2中任何ー个的至少16个连续核苷酸。这些引物用于检测这些启动子的存在。此类引物的实例在SEQID NO:7 - 10中给出。序列表中的序列的简要说明SEQ ID NO: I是ZmRCPl-I启动子的核苷酸序列。SEQ ID N0:2是ZmRCPl-2启动子的核苷酸序列。SEQ ID NO:3 是 ZmRCPl-ICDS 的核苷酸序列。SEQ ID NO:4 是 ZmRCPl-ImRNA 的核苷酸序列。 SEQ ID NO:5是pN0V6901载体的核苷酸序列。SEQ ID N0:6是pSYN15605载体的核苷酸序列。SEQ ID NO:7是pSYN15861载体的核苷酸序列。SEQ ID N0:8是pSYN15888载体的核苷酸序列。SEQ ID N0:9是ZmRCPl-I启动子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 10是ZmRCPl-I启动子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 11是ZmRCPl-2启动子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID勵:12是21111^^1-2启动子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 13是ZmRCP突变I引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 14是ZmRCP突变2引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 15是ZmRCP突变3引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 16是ZmRCP突变4引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 17是ZmRCP突变5引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 18是ZmRCP突变6引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 19是ZmRCPl终止子正向引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:20是ZmRCPl终止子反向引物的核苷酸序列。SEQ ID N0:21是pSYN15670载体的核苷酸序列。定义“反义抑制”指产生了反义RNA转录物，它能够抑制来自内源基因或转基因的蛋白的表达。“嵌合体的”是指ー个DNA序列(例如一个载体或基因)包括两段或多段不同起源的DNA序列,这些DNA序列通过重组DNA技术融合到一起而产生ー个DNA序列,这ー过程不会自然发生。“染色体整合的”指ー个外来基因或DNA构建体通过共价键整合进入宿主DNA。若基因不是“染色体整合的”，则它们可以是“瞬时表达的”。基因的瞬时表达指不整合进入宿主染色体中但独立发挥作用的基因的表达，其作用例如作为自主复制质粒的一部分或表达盒，或作为另ー个生物系统(例如病毒)的一部分。“编码序列”指ー个DNA或RNA序列，该序列编码ー个特定的氨基酸序列并排除非编码序列。它可以构成ー个“不受干扰的编码序列”，即例如在ー个cDNA中缺少内含子，或者它可以包括一个或多个被合适的剪接连接界定的内含子。“内含子”是ー个RNA序列，该序列包含在初级转录物中，但通过细胞内RNA的切割与再连接被除去，以产生可以被翻译为蛋白质的成熟mRNA。“组成型启动子”是指ー种启动子，该启动子能够在所有或几乎所有的植物组织中、在植物的所有或几乎所有的发育阶段过程中表达它所控制的基因，由此产生该基因的“组成型表达”。“共抑制”和“正义抑制”指产生了正义RNA转录物，它能够抑制完全一致的或基本一致的转基因或内源基因的表达(美国专利号5，231，020)。“连续的”在此是指彼此前后排列在一起的核苷酸序列。 如在此所使用，“玉米根虫”指根萤叶甲属的昆虫，包括幼虫阶段或成虫阶段(优选幼虫阶段)的南方玉米根虫、北方玉米根虫、西方玉米根虫以及墨西哥玉米根虫。本发明的根冠特异性启动子用于在转基因植物根部表达玉米根虫毒素，由此保护转基因植物的田地免受玉米根虫的伤害。术语“玉米根虫”和根萤叶甲属在此可互換使用。“表达”指mRNA的转录和稳定积累。表达还可以指蛋白质的产生。如在此所使用，“表达盒”是指ー个DNA序列，该序列能够指导ー个特定的核苷酸序列在适当的宿主细胞中的表达，该DNA序列包括ー个可操作地连接至感兴趣的核苷酸序列的启动子，该感兴趣的核苷酸序列被可操作地连接至終止信号。它还典型地包括适当翻译该核苷酸序列所要求的序列。该编码区通常编码ー种感兴趣的蛋白质，但是还可以编码ー种感兴趣的功能性RNA，例如正义或反义方向的反义RNA或非翻译性RNA。包含感兴趣的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的组分中至少有ー个相对于它的其他组分中至少ー个是异源的。启动子(带有或没有增强子)的“表达模式”是以下表达水平模式，该模式显示该启动子在植物的哪个部分以及发育阶段开始转录。当一个启动子的表达模式与另ー个启动子的表达模式显示出少量重叠时，这组启动子的表达模式被认为是互补的。“基因”是指表达mRNA、功能性RNA、或特异性蛋白的核酸片段，包括调节序列。术语“原生基因”是指在自然界中发现的基因。术语“嵌合基因”是指包含以下序列的任何基因1)DNA序列，包括调节序列和编码序列，在自然界中这些调节序列和编码序列没有发现在一起，或2)编码了未自然邻近的蛋白部分的序列，或3)未自然邻接的启动子的部分。因此，嵌合基因可以包括源自不同来源的调节序列和编码序列，或包括源自相同来源、但以与自然界中所发现的方式不同的方式进行安排的调节序列和编码序列。“转基因”是指ー个基因，该基因已经通过转化引入到该基因组中并且得到稳定维持。转基因可以包括例如，与有待转化的特定植物的基因异源或同源的基因。此外，转基因可以包括插入到非天然生物内的原生基因、或嵌合基因。术语“内源性基因”是指在ー种生物的基因组中位于其天然位置的原生基因。“外来”基因是指通常地未在宿主生物中发现、但通过基因转移引入到该生物中的基因。“基因沉默”是指病毒基因、转基因或内源性核基因的同源依赖性抑制。当该抑制由于这些受影响的基因转录而减少时，基因沉默可以是转录基因沉默；当该抑制由于与这些受影响的基因同源的RNA种类的更替(降解)增加时，基因沉默可以是转录后基因沉默。(English, et al.，1996，Plant Cell 8:179-1881)。基因沉默包括病毒诱导的基因沉默(Ruiz et al. , 1998, Plant Cell 10:937-946)。“遗传上稳定的”和“可遗传的”指染色体整合的遗传元件，这些元件稳定维持在植物中并且被子代稳定地遗传连续数代。“异源DNA序列”是ー种DNA序列，该序列与将其引入的宿主细胞并非自然地结合，包括ー个自然发生的DNA序列的非自然发生的多个拷贝。“诱导型启动子”是指那些受调节的启动子，它们可以通过ー种外部刺激(例如，化学物质、光、激素、应力、或ー种病原体)而在ー种或多种细胞类型中出现。“杀虫的”被定义为ー种能够控制昆虫的毒性生物活性，优选通过杀死昆虫。“5’非编码序列”指位于编码序列5’端(上游)的一个核苷酸序列。它存在于起始密码子上游的完全加工过的mRNA中，并且可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA的稳定性或翻译效率。(Turner et al. , 1995, Molecular Biotechnology, 3:225)。“3’非编码序列”指位于编码序列的3’端(下游)的核苷酸序列，并且包括多腺苷酸化信号序列以及其他编码调节信号的序列，这些调节信号能够影响mRNA的加工或基因 表达。多腺苷酸化信号通常的特征是影响多聚腺苷束添加到mRNA前体的3’末端。不同的3，非编码序列的用途通过Ingelbrecht等人举例说明(1989，Plant Cell, I 671-680,)。术语“核苷酸”指ー种高分子量的多聚核苷酸，它可以是单链或双链，由含有ー种糖、磷酸盐和一种碱基的単体(核苷酸)组成，该碱基是ー种嘌呤或嘧啶。“多核苷酸片段”是一种给定核酸分子的一部分。在高等植物中，脱氧核糖核酸(DNA)是遗传物质，而核糖核酸(RNA)涉及将DNA中所含的信息传递到蛋白中。“基因组”是在ー种生物的每个细胞中所含有的遗传物质的整体。术语“核苷酸序列”指DNA或RNA的聚合物，它可以是单链或双链，可任选地含有能够结合到DNA或RNA聚合物中的合成的、非自然的或改变的核苷酸碱基。术语“开放阅读框”和“0RF”是指在一个编码序列的翻译起始和終止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“終止密码子”是指ー个编码序列中三个相邻的核苷酸(“密码子”)単位，它对应地指明蛋白质合成(mRNA翻译)的起始和链終止。“可操作地连接”和“操作地连接”指将核酸序列结合到一个单个的核酸片段上，这样ー个序列的功能会被另ー个影响。例如，当一个启动子能够影响一个编码序列或功能RNA的表达时(即，该编码序列或功能RNA受到该启动子的转录控制)，则该启动子与该编码序列或功能RNA是可操作地连接的。正义方向或反义方向的编码序列能够与调节序列可操作地连接。“过表达”是指转基因生物中的表达水平，该水平超过在正常或未转化生物中表达的水平。“植物组织”包括已分化的和未分化的组织或植物，包括但不限于根、茎、嫩枝、叶、花粉、种子、瘤组织、以及细胞和培养物的各种形式，例如单个细胞、原生质体、胚和愈伤组织。植物组织可以在植物中或在器官、组织或细胞培养物中。“偏好表达”是基因产物的表达，这些产物以较高的水平优选表达于ー个或ー些植物组织中(空间限制)和/或ー个或ー些植物发育阶段中(时间限制)，同时在其他组织/发育阶段的表达水平相对较低。“初代转化体”和“ TO代”指转基因植物，这些植物与最初转化的组织具有相同的遗传代数(即，从转化起没有经过减数分裂和受精)“次代转化体”和“T1、T2、T3等代”指通过一次或多次減数分裂和受精循环、衍生自“初代转化体”的转基因植物。它们可以通过初代或次代转化体的自体受精、或者初代或次代转化体与其他转化的或未转化的植物的杂交而获得。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”在此可互換使用。“启动子”是典型地编码区上游的非翻译DNA序列，它含有RNA聚合成酶的结合位点并且启动该DNA的转录。启动子区域也可包括充当基因表达调节物的其他元件。“启动子调节序列”由近端以及更远端的上游元件构成，更远端的上游元件经常被称为增强子。因此，“增强子”是ー个DNA序列，它可以促进启动子的活性，并且可以是该启动子的ー个固有元件或为了增强ー种启动子的水平或组织特异性而插入的异源元件。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至从该启动子的上游或下游移动时还能够发挥作用。启动子可以全部衍生自ー种原生基因、或者由自然界中发现的不同启动子所衍生的不同元件构成、或甚至由合成的DNA区段构成。“最小或核心启动子”是ー种仅由转录起始所需要的全部基础元件(例如，ー个TATA盒和/或一个起始子)构成的启动子。如在此所使用，“參比序列”被定义为作为序列比较基础的ー个序列。一个參比序列可以是ー个特定序列子集或整体；例如，作为ー个全长cDNA或基因序列的片段、或该全 长cDNA或基因序列。“受调节的启动子”是指非组成型地、但却以ー种时间和/或空间的调节方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性启动子和诱导型启动子。它包括自然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的多个序列。不同启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在发育的不同阶段、或响应于不同的环境条件来指导基因的表达。“调节序列”和“合适的调节序列”各自指位于ー个编码序列的上游(5'非编码序列)、内部、或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且这些核苷酸序列影响了相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。这些调节序列包括增强子、启动子、翻译前导序列、内含子、以及多腺苷酸化信号序列。它们包括自然序列和合成序列、连同可能是合成序列与自然序列的组合的多个序列。术语“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化通过ー个DNA序列的转录而得到的产物。当RNA转录物是该DNA序列的完美互补拷贝时，它被称作初级转录物；或者它可以是由初级转录物的转录后加工而衍生的RNA序列，并且被称为成熟RNA。“信使RNA” (mRNA)指没有内含子并且可以被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指一种单链或双链的DNA，它与mRNA互补并且衍生自mRNA。“功能性RNA”指一种反义RNA、核糖核酸酶、或其他不被翻译但作为RNA參与ー个反应或过程的RNA。术语“根”指植物的基本结构。通常，根是ー个种子植物本体的地下部分，通常源自下胚轴。它作为一种吸收、换气以及食物贮藏的器官、或作为锚固与支撑手段的器官而发挥专用干。根与茎不同，特别是在缺少生叶处、芽以及叶方面。玉米植物有三种根。种子根、不定根以及支持根。种子根由胚根发育而成，并且持续很长时间。不定根是由地下茎较下方的生叶处所发育的须根，并且是植物有作用的、有活性的根。支持根或支柱根由该茎的较下方的两个生叶处产生。术语“根冠”指套管状的薄壁细胞团，它覆盖着生长的根尖并且将其保护，因为它穿透土壌根冠随着根尖的生长增长而向前推迸。根冠周围的细胞随着根冠的推进而脱落，而新的细胞由顶端分生组织加入。根冠保护了顶端的分生组织，当根穿透土壤时辅助根，并且在控制根对重力的反应(向地性)方面发挥重要作用。
“选择标记基因”指ー种基因，该基因在植物细胞中的表达给予该细胞ー种选择优势。用选择标记基因转化的细胞所具有的选择优势可以是由于与非转化细胞的生长能力相比，这些转化细胞在阴性选择剂(例如抗菌素或除草剤)存在下具有生长能力。这些转化细胞所具有的选择优势还可以是由干与非转化细胞相比，它们将ー种添加的化合物用作营养素、生长因子或能源的能力增强。转化细胞所具有的选择优势还可以是由于丢失了ー个先前拥有的基因，这被称为“负性选择”。其中，加入ー种化合物，该化合物仅对没有丢失母细胞中存在的特定基因(ー个负性选择标记基因)的细胞具有毒性，该母细胞典型地来自ー种转基因植物。 “特异性表达”是表达了基因产物，该表达被限定在ー个或ー些植物组织中(空间限制)和/或ー个或ー些植物发育阶段(时间限制)。基本一致的在两个核酸或蛋白质序列的背景下，短语“基本一致的”是指两个或多个序列或子序列，当比较和比对最大对应性时，它们具有至少60%、优选80%、更优选90%、甚至更优选95%、并且最优选至少99%的核苷酸或氨基酸残基的一致性，正如使用以下序列比较算法之一或通过目测检查所測量。优选地，这种基本一致存在于整个长度为至少约50个残基的序列的区域中，更优选地整个至少约100个残基的区域中，并且最优选地该序列在至少约150残基中是基本一致的。在本发明的一个实施方案中，这些序列在整个编码区的长度内是基本一致的。此外，基本一致的核酸或蛋白序列基本上执行相同的功能。对于序列比较，典型地是ー个序列充当參比序列而与测试序列进行比较。当使用ー种序列比较算法吋，将测试序列与參比序列输入到计算机中(如有必要，指定子序列坐标)，并且指定序列算法程序的參数。然后，这种序列比较算法依据所指定的程序參数来计算这个或这些测试序列相对于參比序列的序列一致性百分数。本领域内的普通技术人员应当理解，为了避免由于多聚核苷酸包含空隙而导致与參比序列的高度相似性，典型地引入空隙罚分并且将其从匹配数中减去。用于比较的序列最佳比对可以按照以下方式进行，例如通过Smith &Waterman, 1981, Adv. App I. Math. 2:482 的局部同源性算法、通过 Needleman &Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443 的同源比对算法、通过 Pearson & Lipman, 1988, Proc.Nat' I. Acad. Sci. 85:2444的相似性法搜索、通过这些算法(威斯康辛州麦迪逊市科学大道575号遗传计算基团(Genetics Computer Group)的威斯康辛遗传软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA、以及TFASTA)的计算机化实施、或通过目测检查(通常參见Ausubel等人，见下文)。适合于确定序列一致性百分数以及序列相似性的算法的ー个实例是BLAST算法，它说明于 Altschul et al.，1990，J. Mol. Biol. 215:403-410.。执行 BLAST 分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)。这种算法涉及首先通过识别查询序列中长度为W的短字而识别得分高的序列对(HSP)，这些得分高的序列对当与数据库中长度相同的字符比对时匹配或满足某个阳性值的阈值得分T。T被称为邻近字符得分阈值(Altschul等人，1990)。这些初始的邻近字符命中充当种子用于启动捜索，以便发现包含它们的较长的HSP。然后，将这些字符命中在两个方向上沿着每个序列延长，直到累积的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用參数M (—对匹配残基的奖赏得分；总是>0 ^PN (错配残基的罚分；总是〈O)来计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用打分矩阵来计算累积的得分。当累积的比对得分从它所达到的最大值降低数量X、由于ー个或多个得分为负的残基比对使累积的得分降至O或O以下时、或者到达各自序列的末端时，这些字符命中在每个方向的延伸停止。BLAST算法的參数W、T、和X决定了该比对的灵敏度与速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是字符长度(W) 11、期望值(E) 10、截止值100、M=5、N=-4、以及两股比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认值是字符长度(W) 3、期望值(E) 10、以及BLOSUM62得分矩阵(见 Henikoff & Henikoff 1989，Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10915)。除了计算序列 一致性百分数之外，BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(见，例如Karlin & Altschul, Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的ー种测量值是最小概率和(P (N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，若在测试核酸序列与參比核酸序列的比较中最小概率和小于约0. I、更优选地是小于约0. 01、并且最优选地是小于约0. 001，则该测试核酸序列被认为是与该參比序列类似的。为了本发明的目的，比较核苷酸序列用于确定与在此公开的启动子序列的序列一致性百分比，优选地是使用BlastN程序(I. 4. 7或以后版本)及其默认參数或任何等效程序。提及“等效程序”是指任何序列比较程序，当任意两段关注的序列与优选程序所产生的对应比对比较时，该程序产生了具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配的比对，以及相同的百分比序列一致性。两个核酸序列是基本一致的另ー种指标是这两个分子在严格杂交条件下彼此杂交。短语“特异性杂交”是指当ー个特定的核苷酸序列存在于DNA或RNA的复杂混合物(例如，总细胞)时，ー个分子在严格杂交条件下只与该序列结合、双链化或杂交。“基本上結合”是指探针核酸与靶核酸之间的互补性杂交，并且涵盖了少量错配，这些错配可以通过降低杂交介质的严格程度来调节，从而实现所希望的目标核酸序列检测。在核酸杂交实验的背景下(例如，DNA及RNA杂交)，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖的，并且在不同环境參数下是不同的。较长的序列在较高的温度下特异性地杂交。核酸杂交的全面指导发现于Tijssen (1993)《实验室生物化学与分子生物学技木》-核苷酸探针杂交第I部分，第二章“杂交原理概论和核酸探针测定的策略”，爱思维尔(Elsevier)，纽约。通常，在限定的离子强度和pH值条件下，选择高严格杂交条件和洗涤条件，使其比该特异序列的热熔点(Tm)约低5°C。典型地，在高严格条件下，探针将与它的靶子序列杂交，而不与其他序列杂交。Tm是50%的目标序列与ー种完全匹配的探针进行杂交所处的温度(在限定的离子強度及PH下)。选择极度高严格条件，使其与ー种特定探针的! 相同。用于互补核酸(这些核酸在DNA印迹法或RNA印迹法的滤纸上具有超过100个互补的残基)杂交的高严格杂交条件的ー个实例是50%甲酰胺与Img肝素在42°C杂交过夜。极高严格洗涤条件的ー个实例是0. 15M NaCl，在72°C下约15分钟。高严格洗涤条件的ー个实例是0. 2x SSC洗涤，在65°C下进行15分钟(參见，Sambrook，见下文对于SSC缓冲液的描述)。通常，一种高严格洗涤之前会先进行ー种低严格洗涤，以去除背景探针信号。对于例如具有超过100个核苷酸的双链体，中等严格洗涤的实例是Ix SSC，在45°C持续15分钟。对于例如具有超过100个核苷酸的双链体，低严格洗涤的例子是在40°C下以4-6x SSC持续15分钟。对于短探针(例如，大约10-50个核苷酸)，高严格条件典型地涉及盐浓度小于约I. OM的Na离子，典型地在pH 7. 0-8. 3下大约0. 01至I. OM的Na离子浓度(或其他盐类)，并且温度典型地是至少约30°C。高严格条件还可以通过加入去稳定试剂(例如甲酰胺)来实现。一般而言，在特定的杂交测定中观察到比不相关的探针高出2倍(或更高)的信噪比就表明检测到ー种特异的杂交。如果核酸编码的蛋白质基本一致，则在高严格条件下彼此不杂交的核酸仍然是基本一致的。例如，当使用遗传密码允许的最大程度的密码简并而生成ー个核酸的拷贝时，就会出现这种情況。
低严格条件包括用30%至35%的甲酰胺、IM NaCl、1%SDS (十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37°C下杂交，并且在IX至2X SSC (20X SSC=3. OM NaCl/0. 3M枸櫞酸三钠)中在50°C至55°C下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40%至45%甲酰胺、I. OM NaCl、l%SDS中在37°C下杂交，并且在0. 5X至IX SSC中在55°C至60°C下洗涤。示例性的高严格条件包括在0%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS中在37°C下杂交，并且在0. IX SSC在60°C至65°C下洗涤。以下是可以用来克隆同源核苷酸序列的杂交/洗涤条件组的例子，这些序列与本发明的參比核苷酸序列是基本一致的一种參比核苷酸序列在以下条件下优选地与该參比核苷酸序列杂交在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在2x SSC、0. 1%SDS中在50°C下洗涤；更令人希望的是在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5MNaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在Ix SSC,0. 1%SDS中在50°C下洗涤；仍又更加令人希望的是在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在0. 5x SSC、0. 1%SDS中在50°C下洗涤；优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA中在50°C下，并且在0. Ix SSC,0. 1%SDS中在50°C下洗涤；更优选在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、
0.5M NaPO4UmM EDTA 中在 50°C下，并且在 0. Ix SSC,0. 1%SDS 中在 65°C下洗涤。特异性典型地是杂交后洗涤的功能，关键因素为最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于 DNA-DNA 杂交，！ 可以由 Meinkoth and Wahl Anal. Biochem. 138:267-284 (1984)的方程近似计算出来；TM 81. 5°C +16. 6 (log M) +0. 41 (%GC) -0. 61 (%form) -500/L ;其中 M是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是该DNA中鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，%形式是该杂交溶液中甲酰胺的百分比，并且L是碱基对中杂交的长度。TM是ー个互补的目标序列的50%杂交到ー个完全匹配的探针时的温度(在限定的离子强度及PH下)。每1%的错配会使T降低大约1°C ;因此，可以调节TM、杂交和/或洗涤条件以便使其杂交到具有所希望的一致性的序列上。例如，若找到一致性大于90%的序列，则该Tm可以降低10°C。通常，对于处于限定的离子強度和PH值条件下的特异序列及其互补序列，高严格条件被选择为比热熔点(Tm)约低19°C。然而，极高严格条件可以利用比热熔点(Tm)低1°C、2°C、3°C或4°C的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热熔点(Tm)低6°C、7°C、8°C、9°C或10°C的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔点(Tm)低ire、12°C、13°C、14°C、150C或20°C的杂交和/或洗涤。使用这些方程、杂交和洗涤组合物以及所希望的T，普通技术人员应当理解杂交和/或洗涤溶液的严格程度变化是固有地描述。如果所希望的错配程度导致低于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的T，优选增加SSC浓度这样可以使用更高的温度。核酸杂交的全面指导见于Tijssen (1993)《实验室生物化学与分子生物学技木》-核苷酸探针杂交第I部分第二章(爱思维尔，纽约)；以及Ausubel等人(1995)《现代分子生物学技术方案》第
2章(Greene Publishing and Wiley - Interscience,纽约)。參见 Sambrook 等人(1989)《分子克隆实验室手册》(第二版，冷泉港实验室出版，普莱恩维尔(Plainview)，纽约)。两个核酸序列或蛋白质是基本一致的另ー个指示是指由该第一核酸编码的蛋白质与由该第二核酸编码的蛋白进行免疫性交联反应或与其特异性结合。因此，ー种蛋白质典型地是与ー种第二蛋白质是基本一致的，例如当这两种蛋白的区别仅仅是保存性置換时。“组织特异性启动子“是指以下受调节的启动子，它们不表达于所有植物细胞中而仅仅在特定器官(例如，叶、根或种子)或特异性组织(例如，胚或子叶)的ー个或多个细胞类型、或特定的细胞类型(例如，叶实质或种子存储细胞)中。这些启动子还包括受时间调节的启动子，例如在胚形成的初期或晩期、在种子或果实发育的果实催熟期、在完全分化的叶中、或在开始衰老时。术语“反式激活基因”指编码ー种反式激活蛋白的基因。它可以编码ー种转录因子。它可以是ー种天然基因(例如ー种植物转录激活子)或一种嵌合基因，例如当植物调节序列可操作地连接至来自另ー种生物的转录因子的开放阅读框吋。“反式激活基因”可以是染色体整合的或瞬时表达的。“反式激活”指通过另ー种反式(调控的)基因的表达而开启基因。“表达盒”在5' -3'的转录方向上包括一个转录和翻译的起始区、一个感兴趣的DNA序列以及ー个在植物中发挥作用的转录和翻译的终止区。该终止区可以是与该转录起始区原生的，可以是与该感兴趣的DNA序列原生的，或可以从其他来源衍生。“转录起始位点”是围绕着该第一核苷酸的位置，它是经转录的序列的一部分，还被定义为位置+1。根据这个位置，对该基因的所有其他序列及它们的控制区域进行编号。对下游序列(即，在3'方向上的其他蛋白编码序列)进行正性命名，而对上游序列(在5'方向上的大多数控制区域)进行负性命名。术语“转化”指将ー个核酸片段转移到ー个宿主细胞的基因组中，导致遗传学上的稳定遗传。“瞬时转化的”指已引入转基因或外来DNA的细胞(例如，通过诸如农杆菌介导的转化或基因枪轰击)，但不选择用于稳定保持。“稳定转化的”是指已被选择并且在转化后在选择性培养基上再生的细胞“转化的/转基因的/重组的”是指已经引入一种异源核酸分子的宿主生物，例如一种细菌或植物。该核酸分子可以被稳定地整合到宿主的基因组中，或者该核酸分子还可以作为ー种染色体外分子存在。这种染色体外分子能够自动复制。转化的细胞、组织或植物应当理解为不仅包含一个转化过程的最终产物，还包含其转基因子代。“非转化的”、“非转基因的”、或“非重组的”宿主是指ー种野生型生物，例如一种细菌或植物，它不含异源核酸分子。“瞬时表达”是指在细胞中表达，其中ー种病毒或转基因通过病毒感染或通过诸如农杆菌介导的转化、电穿孔或基因枪轰击等方法被引入到细胞中，但不选择用于稳定维持。术语“翻译前导序列”是指在启动子和编码序列之间的基因DNA序列部分，该部分被转录成RNA并且存在于翻译起始密码子(5')上游的全部加工过的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA的稳定性或翻译效率。 “载体”被定义为除了其他之外还包括双股或单股、线形或环形的任ー质粒、黏粒、噬菌体或农杆菌ニ元载体，它们可以进行或不能进行自我传送或移动，并且它们可以通过整合到细胞基因组中或存在于染色体外而转化原核或真核生物的宿主(例如，具有ー个复制起点的自主复制质粒)。尤其包括的是穿梭载体，提及“穿梭载体”是指ー种DNA运载体，它能够自然地或通过设计在两个不同宿主生物中复制，这些宿主生物可以选自放线菌以及相关物种、细菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳动物、酵母或真菌细胞)。“可见标记”指ー种基因，该基因的表达不会为转化细胞提供优势，但可以被检测到或看到。可见标记的实例包括但不限干￠-葡萄糖醛酸酶(⑶S)、萤光素酶(LUC)以及绿色荧光蛋白(GFP)。“野生型”是指在自然界中发现的没有任何已知突变的正常基因、病毒或生物。发明详细说明根特异性基因、启动子以及同源物的鉴定在很多情况下，希望的是对转基因的表达进行空间调节，以便使其仅在植物根组 织中表达。能够以特异性或偏好性的方式指导表达的启动子可以最快完成这种空间调节。本发明提供了分离的核酸分子，这些分子具有一个在根部指导特异性转录的核苷酸序列。根特异性启动子的分离方式是通过识别在目标植物的根组织中特异性表达的基因，并且接着分离这些基因的调节序列。本领域的普通技术人员还应当清楚的是，使用本领域内已知的方法可以将ー个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和/或置換引入核苷酸序列SEQ ID N0:1。此外，将本发明的序列重组可以提供新的以及变化的核苷酸序列。为了测试根据本发明的变体DNA序列的功能，例如SEQ ID NO: I的缺失片段，将感兴趣的序列可操作地连接到ー个选择标记基因或可见标记基因，并且在使用分离的根组织或细胞的瞬时表达測定中或通过稳定转化到植物中测试该标记基因的表达。本领域的普通技术人员应当了解，能够促进ー种相关编码序列表达的DNA序列是以ー种模块方式建造的。因此，较短DNA片段的表达水平与最长片段的表达水平可能是不同的，并且彼此之间可以是不同的。例如，缺失ー个下调上游元件将导致相关编码序列的表达水平増加，而缺失一个上调元件会降低相关编码序列的表达水平。本领域的普通技术人员还应当了解，发育特异性或组织特异性元件的缺失将产生ー种在时间或空间上改变的相关编码序列表达谱。在本发明的另ー个实施方案中，与SEQ ID NO: I同源的DNA和基因组DNA序列可以使用本领域内熟知的杂交或PCR技术从其他玉米种质中分离。。这些分离的序列与SEQID NO: I可以是一致的或它们与SEQ ID N0:1可以是基本一致的。获自其他玉米种质的序列没有必要包含相同的核苷酸序列以便与在此披露的这些序列功能一致。一些核苷酸的缺失、加入以及置換可以对基因表达没有影响或影响很小。根据本发明，一方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括一个核苷酸序列，该序列具有与SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列至少70%的一致性。另ー方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括一个核苷酸序列，该序列具有与SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列至少80%的一致性。另ー方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括一个核苷酸序列，该序列具有与SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列之任意一个至少90%的一致性。另ー方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括一个核苷酸序列，该序列具有与SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列至少95%的一致性。另ー方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括一个核苷酸序列，该序列具有与SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列至少99%的一致性。另ー方面是ー种分离的核酸分子，该分子包括在SEQ ID NO: I中给出的核苷酸序列之任意ー个。在本发明的另ー个实施方案中，cDNA和基因组DNA的序列可以从其他植物克隆，这些植物代表着根特异性玉米基因和启动子的同源物。这些同源物允许获得对根部多个基因调节有用的其他根特异性启动子。使用这些玉米cDNA以及基因组的序列或它们的部分进行杂交，用于筛选其他植物基因组中的同源物或基本一致的序列。这些序列可以仅包括核苷酸SEQ ID N0S: 1-2的ー个子集。同源性的优选长度是20个碱基对(bp)，更优选长度为50bp，并且最优选至少lOObp。在本发明的一个实施方案中，一个杂交探针是从SEQ IDN0S: 1-2中任意一个或它的部分制备的。此类序列的杂交可以在高严格条件下进行。可替代地，可以使用低严格或中严格条件以允许序列中出现ー些错配，以便检测到更低程度的相似性(异源探査)。一般，一个探针的长度低于大约1000个核苷酸，优选长度低于500个核苷酸。在本发明的另ー个实施方案中，CDNA和基因组的序列是通过制备包括SEQ IDN0S: 1-2中任意ー个的序列的引物而分离。这些引物可以用于ー个PCR反应，该反应使用来自植物的cDNA或基因组DNA，以便获得同源序列或与SEQ ID N0S: 1_2中的任意ー个基本一致的序列。表达盒的构建所构建的表达盒包括根特异性基因组克隆的5’侧翼序列。在本发明的一个实施方案中，每个表达盒所利用的启动子区域包括5’侧翼区域，直到并且包括翻译起始。翻译的起始是由在该cDNA和同源基因组序列中发现的开放阅读框(ORF)的第一个ATG来表示的。因此，该启动子区域可以包括5’非翻译前导序列以及转录起始位点、核心启动子以及其他调节元件。在本发明的一个实施方案中，所构建的表达盒包括根特异性基因组克隆的5’侧翼序列，直到并且包括该转录起始位点。转录起始位点可以通过获得的最长cDNA克隆的第一个核苷酸来定义。此外，转录起始位点可以进ー步通过使用本领域内熟知的技术来定义，包括RACE PCR, RNase保护作图以及引物延伸分析。这些表达盒可以进一歩包括该启动子下游(3’)的一个转录終止子。可以获得多种转录終止子用于表达盒。该转录終止子负责在该转基因之外終止转录，以及使mRNA转录物正确进行mRNA多聚腺苷酸化。适当的转录终止子是已知在植物中发挥作用的那些终止子，并且包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂碱合成酶终止子、豌豆rbcSE9終止子以及ZmRCPl終止子。这些终止子可以在单子叶植物和双子叶植物中使用。此外，可以使用一种基因的原生转录终止子。例如，可以使用ー个3’侧翼序列，该序列包含位于ー个区域的
3‘端的基因组序列，该区域与ー个根特异性cDNA克隆同源。在本发明的一个实施方案中，ー个异源编码序列(例如杀虫编码序列、可见标记编码序列或选择标记编码序列)是在本发明的一个启动子与转录终止子之间克隆的，由此该异源编码序列是可操作地连接到该启动子，并且该转录终止子是可操作地连接到该异源编码序列。对于本发明有用的可见标记的实例包括但不限于P -葡萄糖醛酸酶(GUS)、氯霉 素こ酰转移酶(CAT)、萤光素酶(LUC)以及具有荧光特性的蛋白质例如来自维多利亚多管发光水母(Aequora victoria)绿色突光蛋白(GFP)。原则上,很多其他蛋白适合用于此目的，条件是蛋白不会干扰重要的植物发挥作用。对于本发明有用的异源编码序列的其他实 例包括但不限干抗生素抗性、病毒抗性、抗虫性、抗病性，或者对其他害虫的抗性、除草剂耐受性、营养价值改进、エ业性能改进或者繁殖能力改变。在本发明的这个实施方案的ー个方面，对以这些植物的根为食的昆虫的抗性进行编码的基因是在该启动子和終止子之间克隆的。在本发明的另ー个实施方案中，编码了功能RNA (例如反义RNA，ー种用于正义抑制的正义RNA、或一种双链RNA)还可以在该启动子和转录终止子之间克隆的。在另ー个实施方案中，该启动子可以通过ー种转基因途径用于改进根发育、水与营养物的吸收和利用，并因此改进胁迫耐受性。已经发现很多序列增强了来自转录単位之内的基因表达，并且这些序列可以与本发明的启动子结合使用以增加它们在转基因植物中的表达。不同的内含子序列已显示增强了表达，特别是在单子叶植物的细胞中。例如，已经发现玉米AdhI基因的内含子当引入玉米细胞中时，显著地增强了野生型基因在其同源启动子的调节下表达。已经发现内含子I是特别有效的，并且增强了具有氯霉素こ酰转移酶基因的融合构建体中的表达(Callis etal. , Genes Develop. 1:1183-1200 (1987))。在相同的实验系统中，来自玉米bronze I基因 的内含子在增强表达方面具有相似的效果。内含子序列已经被常规地结合到植物转化载体中，典型地在非翻译前导序列中。还已知许多源自病毒的未翻译前导序列增强了表达，并且这些序列在双子叶植物的细胞中是特别有效的。确切地说，来自烟草花叶病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)、以及苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示出在增强表达方面是有效的(例如，Gallie et al. Nucl. Acids Res. 15:8693-8711 (1987) ; Skuzeskiet al. Plant Molec. Biol. 15:65-79 (1990))。本领域中已知的其他前导序列包括但不限于细小核糖核酸病毒前导序列，例如，EMCV前导序列(脑心肌炎5'非编码区)(Elroy-Stein, 0. , Fuerst, T. R. , and Moss, B. PNAS USA 86:6126-6130(1989);马铃薯 Y病毒属前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison等人，1986) ；MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒);Virology 154:9-20 ;人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列(Mace jak, D. G. , and Sarnow, P. , Nature 353:90-94 (1991));来自首猜花叶病韋的外壳蛋白 mRNA 的未翻译的前导序列(AMV RNA 4) (Jobling, S. A. , and Gehrke, L. , Nature325:622-625 (1987));烟草花叶病毒前导序列(TMV) (Gallie, D. R. et al.，MolecularBiology of RNA, pages 237-256 (1989));以及玉米萎黄病斑点病毒前导序列(MCMV)(LommeI, S. A. et al. , Virology 81:382-385 (1991))。还參见Della-Cioppa et al. , PlantPhysiology 84:965-968(1987)。对于本发明有用的植物转化方法可用于植物转化的多种转化载体对于植物转化领域的普通技术人员而言是已知的，并且本发明的核酸分子可以与任何此类载体结合使用。载体的选择将取决于优选的转化技术以及用于转化的目标植物种类。对于某些目标种类，可以优选不同的抗生素或除草剂选择标记。在转化时常规使用的选择标记物包括nptll基因，它赋予了对卡那霉素及相关抗生素的抗性(Messing&Vierra. Gene 19:259-268 (1982) ; Bevan et al. , Nature304:184-187(1983)) ;bar基因，它赋予了对于除草剂草丁膦的抗性(White et al. , Nucl.Acids Res 18:1062(1990), Spencer et al. Theor. Appl.Genet 79:625-631 (1990))；hph基因，它赋予了对抗生素潮霉素的抗性(Blochinger & Diggelmann, Mol Cell Biol4:2929-2931);以及dhfr基因，它赋予了对于甲氨蝶呤的抗性(Bourouis et al. , EMBOJ. 2(7) :1099-1104(1983)) ;EPSPS基因，它赋予了对草甘膦的抗性(美国专利号4，940, 935和5，188，642)；以及甘露糖-6-磷酸异构酶基因，它提供了使甘露糖代谢的能力(美国专利号 5，767，378 和 5，994，629)。适合于农杆菌转化的载体很多载体可供用于使用根瘤农杆菌进行的转化。这些载体典型地携帯至少ー个T-DNA边界序列，并且包括例如pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984))。以下说明了适合于农杆菌转化的ー种典型的载体的构建。适合于非农杆菌转化的载体
没有使用根瘤农杆菌的转化避免了在经选择的转化载体中对于T-DNA序列的要求，并且因此除了诸如以上说明包含T-DNA序列的载体以外，还可以利用缺乏这些序列的载体。不依赖农杆菌的转化技术包括经由粒子轰击、原生质体摄入(例如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择很大程度上取决于对于正在转化的种类的优先选择。对于本发明有用的转化方法本发明的ー种核酸分子一旦已经被克隆到ー个表达盒中，则该分子即被转化到一种植物细胞中。本发明的受体和目标表达盒可以采用本领域公认的多种方式引入到植物细胞中。用于植物再生的方法在本领域中也是熟知的。例如，Ti质粒载体已用于递送外来DNA、连同直接DNA摄取，脂质体，电穿孔，显微注射、以及微粒轰击。此外，可以利用来自农杆菌属的细菌来转化植物细胞。以下是用于转化双子叶和单子叶植物的代表性技术连同一种代表性质体(plastid)转化技术的说明。根据本发明所转化的植物可以是单子叶或双子叶植物，并且包括但不限于玉米、小麦、大麦、黒麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝、花椰菜、西兰花、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、蒜、胡椒、芹菜、倭瓜、南瓜、大麻、西葫芦、苹果、梨、榲梓、甜瓜、李子、樱桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、菠萝、鳄梨、番木瓜、芒果、香蕉、大豆、番U、高梁、甘鹿、甜菜、向日葵、油菜籽、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥以及木本植物，例如针叶树和落叶树，特别是玉米、小麦或水稻。ー种表达盒一旦已经被转化到ー种特定的植物物种中，使用传统的育种技术可以将该表达盒在该物种中繁殖或将其转移到相同物种的其它品种中，特别包括商业品种。双子叶植物的转化用于双子叶植物的转化技术在本领域也是熟知的，并且包括基于农杆菌的技术以及基于非农杆菌的技术这两者。非农杆菌技术涉及直接通过原生质体或细胞来摄取外源基因材料。这可以通过粒子轰击介导的递送、显微注射或PEG或电穿孔介导的摄入实现。Paszkowski et al. , EMBO J 3:2717-2722 (1984), Potrykus et al. , Mol. Gen.Genet.199:169-177(1985)，Reich et al. , Biotechnology 4:1001-1004(1986)，以及Klein et al. , Nature 327:70-73 (1987)说明了这些技术的实例。在每种情况下，使用本领域已知的标准技术将这些转化的细胞再生为完整的植物。农杆菌介导的转化是双子叶植物转化的ー种优选技术，因为它的转化效率高并且它广泛应用于许多不同的种类。农杆菌转化典型地涉及将携帯感兴趣的外源DNA的ニ元载体(例如，PCIB200或pCIB2001)转移到一个适当的农杆菌菌株中，它可以依赖于由宿主农杆菌菌株在ー个共驻留Ti质粒上或在染色体上携帯的vir基因的互补物(例如用于PCIB200 以及 pCIB2001 的 CIB542 菌株(Uknes et al. Plant Cell 5:159-169(1993))。该重组ニ元载体转移到农杆菌中是通过三亲本杂交步骤实现的，该步骤使用了携帯该重组ニ元载体的大肠杆菌、携带一种质粒(例如PRK2013)并且能够将该重组ニ元载体移动到目标农杆菌菌株中的辅助大肠杆菌菌株。可替代地，该重组ニ元载体可以通过DNA转化转移到农杆菌中(H6fgen& ffillmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877(1988))。通过重组农杆菌将目标植物物种转化通常涉及将该农杆菌与来自该植物的外植体共培养，并且遵循本领域中熟知的科学试验计划。将转化的组织在选择培养基上再生，这些培养基携帯了存在于ニ元质粒T-DNA边界之间的抗生素或除草剂抗性标记。另ー种用基因转化植物细胞的方法涉及在植物组织和细胞上推入惰性粒子或生物学活性粒子。这种技术披露于美国专利号4，945，050、5，036，006、以及5，100, 792 (均授予Sanford等人)。通常，该步骤涉及在细胞上、在有效穿透该细胞的外表面并提供掺入到其内部中的条件下推入惰性粒子或生物学活性粒子。当使用惰性粒子时，该载体可以通过用含有所希望的基因的载体包被这些粒子而引入到细胞中。可替代地，该载体可以围绕着该目标细胞，使得该载体通过该粒子的激发被带入该细胞中。也可将生物学活性粒子(例如， 干酵母细胞、干细菌或噬菌体，各自均含有被试图引入的DNA)推入到植物细胞组织中。单子叶植物的转化多数单子叶植物种类的转化目前也已成为常规操作。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术、经由农杆菌直接将基因转移进入未成熟的胚胎、原生质体，以及粒子轰击进入愈伤组织。可以用单一 DNA种类或多种DNA种类(即，共转化)进行转化，并且这两种技术均适用于本发明。共转化可能具有避免完全载体构建、以及生成对于感兴趣的基因与选择标记具有非伴性基因座的转基因植物的优点，使得能够在随后几代中去除该选择标记(如果这被认为是所希望的话)。然而，使用共转化的ー个缺点是所分离的DNA种类被整合到基因组中的频率小于 100% (Schocher et al. Biotechnology 4:1093-1096(1986))。专利申请EP 0292435、EP 0392225、以及WO 93/07278说明了用于从良种近交系玉米制备愈伤组织和原生质体、使用PEG或电穿孔转化原生质体、以及从已转化的原生质体再生玉米植物的技术。Gordon-Kamm等人(Plant Cell 2:603-618 (1990))和Fromm等人(Biotechnology 8:833-839 (1990))已经公开了使用粒子轰击来转化A188来源的玉米系的技术。此外，WO 93/07278 和 Koziel 等人(Biotechnology 11:194-200 (1993))说明了通过粒子轰击用于转化良种近交系玉米的技木。这种技术利用了授粉后14天-15天从玉米穗切除的I. 5mm-2. 5mm长的未成熟玉米胚，以及用于轰击的F1DS-IOOOHe Biolistics装置。水稻的转化也可以利用原生质体或粒子轰击、通过直接基因转移技术来进行。原生质体介导的转化已经对粳型水稻和籼型水稻进行了说明(Zhang et al. PlantCell Rep 7:379-384(1988);Shimamoto et al. Nature 338:274-277(1989);Datta etal. Biotechnology 8:736-740(1990))。使用粒子轰击也可常规地转化这两种类型(Christou et al. Biotechnology 9:957-962(1991))。此外，WO 93/21335 说明了经由电穿孔转化水稻的技木。专利申请EP 0 332 581说明了用于产生、转化以及再生早熟禾亚科原生质体的技木。这些技术允许转化鸭茅属植物和小麦。此外，小麦的转化通过以下方式说明如下Vasil等人(Biotechnology 10:667-674(1992))使用粒子轰击进入C型长期可再生愈伤组织的细胞，以及 Vasil 等人(Biotechnology 11:1553-1558 (1993))和 Weeks 等人(PlantPhysiol. 102:1077-1084(1993))使用离子轰击未成熟胚和未成熟胚来源的愈伤组织。用于小麦转化的ー种技术涉及通过离子轰击未成熟胚来转化小麦，并且在基因送递之前包括ー个高蔗糖步骤或高麦芽糖步骤。在轰击之前，将长度为0. 75mm-lmm的胚在MS培养基上进行铺板用于诱导体细胞胚，该培养基具有3%鹿糖(Murashiga & Skoog, PhysiologiaPlantarum 15:473-497 (1962))以及3mg/l 2，4-D，这ー步骤允许在黑暗中进行。在选择进行轰击的那天，将胚从诱导培养基中取出并且放置在渗压剂上(即，以希望的浓度(典型地是15%)添加含有蔗糖或麦芽糖的诱导培养基)。允许这些胚质壁分离2-3小吋，然后进行轰击。每个目标板中二十个胚是典型的，尽管这不是关键性的。使用标准步骤将ー种适当的携带基因的质粒(如PCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金颗粒上。使用约IOOOpsi的爆破压力，使用标准的80目网筛，用D uPont Biolistics⑧氦装置射击每个板的胚。轰击之后，将这些胚放回到黑暗中恢复约24小时(仍在渗压剂上)。24小时后，将这些胚从渗压剂上取出，并将其放回到诱导培养基上，在再生之前将它们在该培养基上放置约I个月。约ー个月之后，将开始胚胎发生的愈伤组织的胚外植体转移到再生培养基中(MS+lmg/升NAA、5mg/升GA)，该再生培养基进ー步包含适当的选择剂(在pCIB3064的情况下是10mg/l的basta,而在pS0G35的情况下是2mg/l的甲氨蝶呤)。约I个月之后，将发育的嫩枝转移到更大的被称为“GA7”的灭菌容器中，这些容器包含半浓度的MS、2%的蔗糖、以及相同浓度的选择剂。使用农杆菌的单子叶植物的转化还说明于WO 94/00977以及美国专利号
5,591, 616中，这两者均通过引用结合在此。一种优选的玉米转化方法说明于Negrotto等人的文章中(Plant Cell Reports 19:798-803 (2000))，通过引用结合在此。启动子活力分析有ー些方法可供使用以便评估启动子的活力。如以上所述，构建含有ー种可见标记的表达盒。使用瞬时转化方法评估启动子的活力。使用诸如微粒轰击、农杆菌转化或原生质体转化等转化方法，将表达盒递送到植物细胞或组织。转化后随时间变化(例如，使用本领域内熟知的方法在递送DNA后2小时，5小时，8小时，16小时，24小时，36小时，48小时和72小吋)监测报告基因活力，例如P -葡萄糖醛酸酶活力、荧光素酶活力或GFP荧光。通过酶活力、通过用由该报告基因编码的酶的底物对细胞或组织染色、或通过在ー个合适光波长下直接用肉眼观测来监测报告基因的活力。可以对全长启动子序列、启动子序列的缺失或突变进行測定，并且比较它们的表达水平。此外，使用本领域内熟知的方法(例如RNA印迹法、竞争性逆转录PCR以及RNA酶保护測定)来測量RNA的水平。这些测定通过测定标准的已转录报告mRNA的“稳定态”浓度，測量了一个报告基因的表达水平。该测量是间接的，因为该报告mRNA的浓度不仅依赖于其合成率，还依赖于该mRNA的降解率。所以，这种稳定态水平是合成率和降解率的产物。然而，当这些转录的序列一致时，该降解率可以被认为是以ー个固定速率进行的，并且因此这数值可以用作合成率的ー个测量值。启动子活力的进ー步确定是通过将ー个表达盒中的启动子稳定转化到如以上所述的ー种植物而获得的，该表达盒包括一种可见标记或感兴趣的基因。使用以上说明的各种方法例如酶活力測定、RNA分析以及如之前所说明的蛋白质测定，启动子的活力可随发育进行监測，并且额外地通过监测初代转化物的不同组织中的表达以及通过转基因植物的后代来进行检測。
实例本发明将通过參考以下具体实例进ー步说明。这些实例仅仅作为说明性的目的而提供，并且并非g在进行限制，除非另外说明。在此所使用的标准的重组DNA以及分子克隆技术是本领域所熟知的，并且由Ausubel编辑，《现代分子生物学技术方案》，约翰威立公司(John Wiley and Sons, Inc. ) (1994) ;J. Sambrook等人，《分子克隆实验室手册 》(第三版，冷泉港，纽约冷泉港实验室出版社，普莱恩维尔，纽约)(2001) ;WlT.J.Silhavy，M.L. Berman 以及 L. W. Enquist《基因融合实验》(Experiments with Gene Fusions)冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1984)进行了说明。实例I :根冠特异性表达盒的构建入门载体表达盒构建的第一歩骤是将该启动子克隆进入ー种入门载体。设计PCR引物，以 便将来自玉米株系B73的启动子和終止子扩增。将这些分离的核酸序列进行T0P0克隆并测序。将与该序列对应的启动子命名为玉米根冠特异性I启动子或ZmRCPl-I启动子。将与该序列对应的終止子命名为玉米根冠特异性I終止子或ZmRCPl-終止子。将ZmRCPl-I启动子在50 ii L Extensor (AB基因公司)DNA聚合酶反应中以玉米基因组DNA(B73)为模板扩增，该反应包含IOii g gDNA、5iiL 10X Extensor缓冲液I、2. 0 y LIOmM dNTP混合物、I. Oii L的20iiM prRCP正向-SEQ ID N0:9(5' GCTAGCCTCGAGGGACCCAACMTTTGCCACAAACTGG-3' )，I. 0 y L 的 20 y M RCP P2 反向-SEQ ID NO :10(5' -GCTAGCGGATCCGGCGCCGCCGGGATAGMGTCGCACAC-3' ), 10. 0 u L 5x Q 溶液以及 I ii L Extensor DNA 聚合酶。该热循环程序是95°C持续2分钟，随后是40个循环的95°C持续30秒、50V持续60秒、以及68°C持续5分钟。最后的延伸步骤是68°C持续15分钟。将I. 5kb反应产物在1%TBE琼脂糖上凝胶纯化，并且使用Qiapr印DNA提取方法提取DNA。将DNA克隆到pCR4-Blunt_T0P0载体中。ZmRCPl-I启动子在一系列QuikChange反应中进行修饰，以便将STOP密码子添加到开放阅读框(ORF)中并且修正在使用斯崔塔基因公司的QuikChange多位点突变试剂盒进行扩增时所产生的点突变。25 ii L反应包含IiiL pCR4-Blunt-T0P0-prZmRCP、2. 5u L IOXQuikChange 缓冲液、I u L QuikChange dNTP 混合物、0. 75 u L Quik 溶液、I u LQuikChange DNA聚合酶以及I ii L的20 y M以下寡核苷酸中的至少ー项SEQ ID N0:13prRCP mutl(5' -GCGGCGGCGGCGTAGTTGCAACCCGCATC-3')，SEQ ID N0:14prRCP mut2(5/ -GCAGTGTGCGACTTGAATCCCGGCGGCGCC-3')，SEQ ID N0:15prRCP mut3(5/ -CTACTCCATGCTAAAGCTGTAGAGCCGAG-3')，SEQ ID N0:16prRCP mut4(5/ -CCTTTATCAATTTGCCTCGATCTCCATAG-3')，SEQ ID N0:17prRCP mut5(5/ -GAAACTTGTTTGTTGTTATTAATTTTCAAC-3')，以及SEQ ID N0:18prRCP mut6(5/ -GCACCAACATCAAGAGCAACAAGACCACC-3')。该热循环程序是95°C持续I分钟，随后是35个循环的95°C持续I分钟、55°C持续I分钟以及65°C持续15分钟。将产物按照制造商(斯崔塔基因公司)的说明进行处理，并且进行全测序。可以将修正过的ZmRCPl-I启动子通过XhoI/BamHI从T0P0载体切除，并且连接到类似切 ロ PN0V6901 (SEQ ID NO: 5)。
ZmRCP终止子在50 ii L Expand (罗氏公司)DNA聚合酶反应中以玉米基因组DNA(B73)为模板进行扩增，该反应包含IOiig gDNA、5iiL IOX含有MgCl2的Expand HighFidelity 缓冲液、LOyL IOmM dNTP 混合物、2. 0 y I 的 2%DMS0、2. 0 y L 的 20 y tRCP 正向-SEQ ID NO:19(5' -GCGCCCGCGGCGCCATAACAAAGGACACGTCGTACGC-3' )，2. 0 y L 的 20 y MtRCP 反向-SEQ ID NO :20(5' -GCGCCCCGGGCGGTCCGCTAAAAAAAACTGTTTTCTCTTGTTG-3')，以IiiL Expand DNA聚合酶。将矿物油覆盖在这些反应上，并且该热循环程序是95°C持续5分钟，随后是12个循环的95°C持续30秒、66°C至60°C (每个循环降0. 5°C )持续I分钟以及70°C持续2. 5分钟，随后是25个循环的95°C持续30秒、60°C持续30秒以及70°C持续
2.5分钟。最后的延伸步骤是70°C持续7分钟。将500kb反应产物在1%TBE琼脂糖上凝胶纯化，并且使用Qiapr印DNA提取法提取DNA。将DNA克隆入pCR-Bluntll-TOPO载体中，并且完整测序。目的载体
将ZmRCP末端从TOPO载体上切除(SacII/Xmal)，并且连接到类似切ロ pN0V6901载体(SEQ ID N0:5)o所产生的这种pSYN15861包含ー个ZmRCP-GUS组装。核苷酸序列PSYN15861表示为SEQ ID NO :7。将完整的ZmRCP-GUS表达盒移动到ニ元载体pSYN15605(SEQ ID N0:6)中，该载体已被RsrII消化，随后作为SanDI/RsrII片段用小牛碱性磷酸酶进行处理。构建体PSYN15888包含ー个prZmRCP-GUS-prUBIl-PMI。pSYN15888的核苷酸序列表示为SEQ ID NO :8。实例2 :根冠特异性表达盒的构建入门载体表达盒构建的第一歩骤是将该启动子克隆到ー种入门载体中。设计PCR引物，以便扩增来自玉米株系B73的启动子。将这些分离的核酸序列进行TOPO克隆并测序。将与该序列对应的启动子命名为玉米根冠特异性1-2启动子或ZmRCPl-2启动子。该载体是PCR4-Topo，它含有一个假定的玉米根冠特异性启动子prZmRCPI_2。prZmRCPl-2是由玉米B73的基因组DNA通过PCR扩增而得，使用引物AG971f_SEQ ID NO: Il(CTCGAGGGACCCAACAATTTGCCACAAACTGG)以及AG972r_SEQ ID NO: 12 (GGATCCTGTAGACTGCTCTGGCTTAA)，然后被克隆到PCR4-Topo中并进行测序。所产生的载体是pSYN15670 (SEQ IDN0:21)。实例3 由根特异性启动子指导的在稳定转化的玉米中的GUS的表达用一种农杆菌载体对玉米植物进行转化，该载体包括本发明的ZmRCPl启动子和終止子，它可以操作地连接到GUS编码序列。该农杆菌载体进ー步包括泛素启动子以及NOS終止子，它可以操作地连接到PMI (磷酸甘露糖异构酶)编码序列。通过视觉測定来測量稳定转化的玉米中的GUS活力。GUS活力的特征为高(+++)、中(++)、低( + )、或无(-)，并且将每个启动子构建体的25株低拷贝转基因玉米植物的数据进行平均。表I中显示的结果证明，转基因植物中的⑶S活力被特异性地限定于根部，这些转基因植物包括ー种表达盒，该表达盒包括本发明的一种启动子。这种表达被进一步定义为隔离到根冠。表I.从转基因(TO)玉米植物切去的组织中的总结性的⑶S表达
权利要求
1.一种能够在植物细胞中指导表达的分离的核酸分子，其中所述核酸分子包括一种在SEQ ID NO: I中给出的启动子。
2.根据权利要求I所述的分离的核酸分子，其中所述启动子能够促进一个可操作地连接的核苷酸序列的根冠特异性表达。
3.根据权利要求I所述的分离的核酸分子，其中所述核酸分子从一个目标植物物种的根组织中分离。
4.根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其中所述目标植物物种是玉米。
5.一个表达盒，在序列方面包括如权利要求I所述的可操作地连接至一个异源编码序列的核酸分子，该核酸分子可操作地连接至一个3’ -非翻译区域，该区域包括一个聚腺苷酸信号。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其中所述异源编码序列是选自下组，该构成为杀虫编码序列、杀线虫编码序列、除草剂耐受编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物胁迫耐受编码序列、营养品质编码序列、可见标记编码序列以及选择标记编码序列。
7.根据权利要求6所述的表达盒，其中所述杀虫编码序列编码一种有效抵抗鞘翅目害虫的毒素。
8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述鞘翅目害虫是根萤叶甲属的一个物种。
9.根据权利要求6所述的表达载体，其中所述可见标记是β-葡萄糖醛酸酶。
10.一个重组载体，包括如权利要求6所述的表达盒。
11.根据权利要求10所述的重组载体，其中所述载体是一种质粒。
12.—种转基因的非人类宿主细胞，包括如权利要求6所述的表达盒。
13.根据权利要求12所述的转基因的非人类宿主细胞，它是一种转基因植物细胞。
14.一种转基因植物，包括如权利要求13所述的转基因植物细胞。
15.根据权利要求14所述的转基因植物，其中所述植物是选自下组，其构成为高粱、小麦、向日葵、番茄、甘蓝类蔬菜、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜以及玉米。
16.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物是一种玉米植物。
17.根据权利要求15所述的转基因植物，其中所述植物是一种水稻植物。
18.来自如权利要求15所述的转基因植物的转基因种子。
19.来自如权利要求16所述的玉米植物的转基因种子。
20.来自如权利要求17所述的水稻植物的转基因种子。
21.在转基因植物根中特异性地表达一个异源编码序列的一种方法，包括 (a)将带有一种载体的植物细胞转化,其中所述载体包括如权利要求5所述的表达盒。
(b)使转基因植物细胞生长，这些细胞包括所述表达盒，并且 (c)从所述已转化的植物细胞生产转基因植物，其中该异源编码序列在所述核酸分子的控制下特异性地表达于植物的根部。
22.根据权利要求21所述的方法，其中这些转基因植物根是玉米根或水稻根。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述异源编码序列是选自下组，其构成为杀虫编码序列、杀线虫编码序列、除草剂耐受编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物胁迫耐受编码序列、营养品质编码序列、可见标记编码序列以及选择标记编码序列。
24.根据权利要求21所述方法所生产的一种转基因植物。
25.根据权利要求24所述的转基因植物，其中所述植物是一种单子叶植物。
26.如权利要求25所述的植物，其中所述单子叶植物是玉米。
27.如权利要求25所述的植物，其中所述单子叶植物是水稻。
全文摘要
本发明针对一种从玉米中分离的启动子。本发明的启动子在促进异源基因的根偏好性表达、特别是根冠表达方面具有特定用途，这些异源基因给予一种给定的转基因植物增强的农艺的、园艺的和/或杀虫的性状。本发明还涉及包括本发明的启动子的DNA分子，以及包含DNA分子的已转化的植物组织，这些DNA分子包括本发明的可操作地连接至一个或多个异源基因的启动子，以及这些植物组织的种子。
文档编号C12P21/06GK102656178SQ201080056937
公开日2012年9月5日 申请日期2010年12月7日 优先权日2009年12月17日
发明者A·T·里克蒙德, T·朱, V·C·克拉默 申请人:先正达参股股份有限公司