专利名称：c-Met基因的siRNA片段及其运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域，特别涉及C-Met基因的SiRNA片段及其运用。
背景技术：
喉癌占全身恶性肿瘤的1% 5%，是头颈部最常见的肿瘤之一，占头颈部肿瘤的 13. 9%，我国部分地区发病率约为1. 5 3. 4/10万人，已成为严重威胁人民生命健康和生活质量的疾病，以鳞癌多见。虽然近几十年来传统的治疗方式如手术、放疗、化疗等已有很大改进，提高了患者的五年生存率，但手术治疗易使患者的喉功能严重破坏而致残；放疗仅对早期喉癌疗效好，对于大多数就诊时即为中、晚期或治疗后又出现复发、转移的患者往往效果不佳；而化疗又由于毒副作用严重常使得患者无法耐受，从而使这些治疗方式仍受到很大限制。因此，积极寻求治疗喉癌的新途径即成为耳鼻咽喉科研究者面临的新课题。肝细胞生长因子Ofepatocyte growth factor，HGF)是一种多功能的细胞因子，为一种多肽，其生物学活性由c-Met蛋白所介导。c-Met蛋白属酪氨酸激酶活性的生长因子受体，研究发现其在促进细胞增殖分化、细胞扩散、新生血管的生成方面具有重要作用。异常表达的c-Met激活下游分子导致肿瘤的发生、发展和转移。研究表明c-Met在喉癌中强表达，与喉癌的增殖及转移关系密切。RNA干扰技术具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地抑制特定基因的表达，目前已成为肿瘤基因治疗研究的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种SiRNA片段，该片段通过RNAi方法沉默c-Met基因表达，从而达到抑制HGF-c-Met信号转导系统，发挥抑制
肿瘤功能。为实现上述目的，本发明的技术方案为 c-Met基因的siRNA片段，具有如下任一序列 序列1
正义链(RNAi-IF)
5’-GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAA GTTGGGAAGCTGATACTTTTTA -3，； 反义链(RNAi-IR)
3 ‘ -GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACC CTTCGACTATGAAAAATTCGA-5‘； 序列2
正义链(RNAi-2F)
5 ‘ -GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGC AGAATCTGGCTTGCTTTTTA-3‘； 反义链(RNAi-2R)3 ‘ -GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTA GACCGAACGAAAAATTCGA -5‘； 序列3
正义链(RNAi-3F)
5 ‘ -GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGT CAGCCTTGTCCCTCCTTTTTA-3‘； 反义链(RNAi-3R)
3 ‘ -GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGG AACAGGGAGGAAAAATTCGA-5‘。本发明的目的之二在于提供一种SiRNA重组质粒，其根据Genbank中报道的 c-Met基因核苷酸序列，参考siRNA设计原则设计并构建的重组质粒。为实现上述目的，本发明的技术方案为
c-Met 基因 siRNA 重组质粒，其含有如 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 3 任一序列的c-Met基因的siRNA片段。进一步，c-Met基因 siRNA 重组质粒 pSilencer2. 0-c-Met_shRNA2 如 SEQ ID NO. 10所示。本发明的另一目的在于提供c-Met基因的siRNA片段的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。具体方案为
c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。进一步，C-Met基因的siRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。本发明的目的之四提供了 c-Met基因siRNA重组质粒的用途，该用途为抗肿瘤提供了一种新思路。其具体方案为
c-Met基因siRNA重组质粒用于制备治疗肿瘤药物的用途。进一步，c-Met基因siRNA重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。本发明的有益效果在于本研究根据Genbank中报道的c_Met基因核苷酸序列，参考siRNA设计原则设计出了三条阻断c-Met基因表达的RNAi序列，并成功构建了 c-Met 基因 siRNA 重组质粒 pSilencer2. 0-c-Met_shRNAl、pSilencer2· 0-c-Met_shRNA2、 pSilencer2. 0_c- Met_shRNA3。通过脂质体介导转染喉癌ifep-2细胞，观察其对H印-2细胞c-Met基因表达的影响，并通过MTT法、运动实验及侵袭实验比较转染前后H印-2细胞的生长、运动及侵袭能力。得到如下结论
1.成功构建了 c-Met 基因 siRNA 重组质粒 pSilencer2. O-c-Met-shRNAl、 pSilencer2. 0-c-Met-shRNA2 >pSilencer2. 0_c_Met_shRNA3。2.重组质粒 pSilencer2. 0-c-Met_shRNA2 可显著降低 H印-2 细胞 c-Met mRNA 及蛋白的表达。3.重组质粒pSilencer2. 0-c-Met_shRNA2在体外显著抑制了喉癌H印_2细胞的生物学活性。4. siRNA重组质粒介导的基因治疗有可能成为喉癌靶向性c_Met治疗的新策略，为喉癌的临床治疗提供了实验基础。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为Psilencer2. 0-U6质粒物理图谱；
图2为pSilencer2. O/c-Met-shRNA酶切电泳图片，其中M 分子量标准；Si-U Si_2、 Si-3、Si-c分别表示靶序列1、2、3、随机对照序列的pSilencerf. O重组质粒；
图3为RT-PCR检测目的基因c-Met mRNA在靶细胞中的转录，3-A中M 分子量标准；1 未转染组；2 空载体组(转染了空质粒pSilencerf. O的Hep-2细胞)；3 随机序列组(转染了随机对照序列的Hep-2细胞)；4 =Si-I组(转染了 pSilencer2. O/c-Met-shRNAl的Hep-2 细胞)；5 :Si-2 组(转染了 pSilencer2. 0/c-Met_shRNA2 的 Hep_2 细胞)；6 Si-3 组(转染了 pSilencer2. 0/c-Met_shRNA3的Hep-2细胞)。3-B为分析图，其中纵坐标为c-Met与 GAPDH光度DU比值。图4为Western-Blot检测各组细胞c_Met蛋白的表达分析图，其中1 未转染组；2 空载体组；3 随机序列组；4 =Si-I组；5 :Si-2组；6 Si-3组。纵坐标c-Met与β -actin光度DU比值。图5为MTT实验的生长曲线绘制图。图6为各组细胞侵袭能力的比较分析图，其中1.空白治疗组；2.阴性治疗组；3. 阳性治疗组。图7为细胞趋化运动实验细胞图，A为空白对照组，B为阴性组，C为阳性治疗组。
具体实施例方式以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1 c-Met基因的siRNA片段、重组质粒的制备
一、实验方法
1.靶向c-Met的shRNA的设计
从GenBank中找出c_Met mRNA序列(登录号NM_000245)，经Ambion公司网址 https://www. Genscript. com/ssl-bin/app/rnai 寻找人 c-Met 的 RNAi 革巴点序列并设计对应的寡核苷酸序列。针对c-Met筛选的23个碱基的3个靶序列如下 5 ‘ -GTATCAGCTTCCCAACTTCACCG-3 ‘(编码区 119 141 位)、 5 ‘ -GCAAGCCAGATTCTG CCGAACCA-3 ‘(编码区 1045 1067 位)、 5 ‘ -GGAGGGACAAGGCTGACCATATG-3 ‘(编码区 1728 1750 位)， 经Blast基因同源性分析以确保基因抑制的特异性。并设置一随机对照序列 5 ‘ -GGACTGTGCTAATGCTCCAGTAGC-3 ‘，经Blast基因同源性分析，此序列不与任何人类基因序列同源。针对靶点序列，参考SiRNA的设计策略
BamH I酶切位点+正义链+ Loop +反义链+终止信号+ Hind III酶切位点分别设计四对shRNA (short hairpin RNA, shRNA)序列(3对干扰序列及1对随机对照序列)如下 序列1
正义链(RNAi-IF)
5’- GATCCGTATCAGCTTCCCAACTTCACCGTCAAGAGCGGTGAAG TTGGGAAGCTGATACTTTTTA -3， 反义链(RNAi-IR)
3 ‘ -GCATAGTCGAAGGGTTGAAGTGGCAGTTCTCGCCACTTCAACCC TTCGACTATGAAAAATTCGA-5‘ 序列2
正义链(RNAi-2F)
5 ‘ -GATCCGCAAGCCAGATTCTGCCGAACCATCAAGAGTGGTTCGGCAGA ATCTGGCTTGCTTTTTA-3‘； 反义链(RNAi-2R)
3 ‘ -GCGTTCGGTCTAAGACGGCTTGGTAGTTCTCACCAAGCCGTCTTAGAC CGAACGAAAAATTCGA -5'。序列3 正义链(RNAi-3F)
5 ‘ -GATCCGGAGGGACAAGGCTGACCATATGTCAAGAGCATATGGTCAGCC TTGTCCCTCCTTTTTA-3‘； 反义链(RNAi-3R)
3 ‘ -GCCTCCCTGTTCCGACTGGTATACAGTTCTCGTATACCAGTCGGAACA GGGAGGAAAAATTCGA-5‘。对照序列 正义链(Control-F)
5 ‘ -GATCCGTCAGCACTCTCGAATCAGATGCTCAAGAGGCATCTGATTCGAG AGTGCTGACTTTTTA-3‘； 反义链(Control-R)
3 ‘ - GCAGTCGTGAGAGCTTAGTCTACGAGTTCTCGCTAGACTAAGCTCTCAC GACTGAAAAATTCGA -5'。弓丨物及双链寡核苷酸由金思特科技有限公司代理合成。2.重组质粒的构建及鉴定
pSilencer2. O载体是利用RNA polymerase (pol III)类启动子的siRNA表达用质粒载体，其结构见图1。在pol III类启动子下游处插入与U型(hairpin型)RNA相对应的Oligo DNA序列后，便可以构建成siRNA表达质粒，将得到的质粒导入细胞可以进行RNAi实验。2. 1单链目的基因片段c-Met-shRNA的制备
(1)将化学合成的c-Met-shRNA单链用165 μ LTE buffer溶解。
(2)上链和下链各取 4. 5 μ L于PCRtube 中，而后加 IyL T4DNA Ligation buffer， 混勻。(3)在 PCR 仪上进行以下循环95°C 2min，68°C 5min，37°C lOmin，4°C 5min，共计 3h。(4)合成的片段储存于-20°C以备用。2.2pSilencer2.0 载体的制备
(1)pSilencer2. 0的酶切，按下列组分加样
权利要求
1.C-Met基因的SiRNA片段，其特征在于，具有如SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2 或SEQ ID NO. 3的任一序列。
2.权利要求1所述的c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗肿瘤药物的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，c-Met基因的siRNA片段用于制备治疗喉癌药物的用途。
4.c-Met基因siRNA重组质粒，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的 c-Met基因的siRNA片段。
5.根据权利要求3所述的c-Met基因siRNA重组质粒，其特征在于，c-Met基因siRNA 重组质粒的序列 pSilencer2. 0-c-Met_shRNA2 如 SEQ ID NO. 10 所示。
6.权利要求4所述的c-Met基因siRNA重组质粒用于制备治疗肿瘤药物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，c-Met基因siRNA重组质粒用于制备治疗喉癌药物的用途。
全文摘要
本发明涉及基因治疗领域，特别涉及c-Met基因的siRNA片段及其运用,c-Met基因的siRNA片段如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3任一序列,c-Met基因siRNA重组质粒的序列pSilencer2.0-c-Met-shRNA2如SEQ ID NO.10所示，c-Met基因的siRNA片段及重组质粒明显降低喉癌Hep-2细胞c-Met基因在mRNA和蛋白水平的表达，显著抑制喉癌Hep-2细胞的生长、运动及侵袭用于制备治疗肿瘤药物的用途效果明显，能成为治疗喉癌的潜在药物。
文档编号C12N15/113GK102154292SQ20111002176
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月19日 优先权日2011年1月19日
发明者刘蓉蓉, 姬长友, 李洪涛, 陈继川, 霍文谦 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院